CC BY
174
Вестник ДВО РАН. 2004. № 3
Н.А.КОМАНДРОВА, Е.Л.НАЗАРЕНКО, С.В.ТОМШИЧ, Р.П.ГОРШКОВА
Строение О-антигенных полисахаридов морских протеобактерий родов Pseudoalteromonas и Shewanella
Обобщены результаты структурных исследований полисахаридов из морских грамотрицательных бактерий родов Pseudoalteromonas и Shewanella семейства Alteromonadaceae. Отличительной особенностью этих полисахаридов является наличие в их составе необычных кислых и N—ациламиносахаров, а также различных заместителей неуглеводной пр-ироды.
Structure of O-antigenic polysaccharides of marine proteobacteria of the genera Pseudoalteromonas
and Shewanella. N.A.KOMANDROVA, E.L.NAZARENKO, S.V.TOMSHICH, S.PGORSHKOVA (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).
The chemical structures of polysaccharides isolated from various gram-negative marine bacteria of the genera Pseudoalteromonas and Shewanella belonging to the family Alteromonadaceae, the class Gammaproteobacteria, have been reviewed. These polysaccharides are characterized by their acidic character as well as by presence of unusual sugars and various uncommon non-sugar substituents in their compound.
Бактериальные полисахариды представляют собой группу полимеров с чрезвычайно разнообразным структурным составом, который определяется присутствием необычных сахаров и часто их производных. Они построены из олиго-сахаридных повторяющихся звеньев, структурное изучение которых приводит к установлению структуры всей цепи. При биосинтезе полисахаридов сначала образуется так называемое биологическое повторяющееся звено, а затем происходит полимеризация всей цепи.
Большинство структурных исследований посвящено определению только «химического» повторяющегося звена, которое может совпадать с «биологическим» или отличаться от него в результате циклических перестановок моносахаридных компонентов.
Кроме собственно полисахаридов бактерии также продуцируют другие полимеры, в которых углеводы являются основными компонентами. Одним из представителей таких биополимеров является липополисахарид — основной компонент пластического слоя внешней мембраны грамотрицательных бактерий. В ли-пополисахаридах S-форм бактерий, образующих колонии гладкой формы, имеет-
КОМАНДРОВА Надежда Алексеевна — кандидат химических наук, НАЗАРЕНКО Евгений Львович — кандидат химических наук, ТОМШИЧ Светлана Васильевна — кандидат химических наук, ГОРШКОВА Раиса Петровна — кандидат химических наук (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток).
ся О-специфическая полисахаридная цепь — О-антиген, локализованная на внешней стороне клеточной мембраны и связанная через олигосахарид кора с липидом А. Потеря в процессе биосинтеза О-антигена приводит к появлению шероховатых колоний R-форм, и их липополисахарид содержит только липид А и олигосахарид кора.
Тонкая химическая структура О-антигена, и очень часто кора, определяет иммуноспецифичность бактериальной клетки, т. е. каждый серологически отдельный штамм продуцирует свой О-специфический полисахарид или кор с уникальной химической структурой [23]. Многие О-антигены используются как вакцины. Структурам бактериальных полисахаридов и липополисахаридов наземных форм грамотрицательных бактерий посвящены обзоры: Kenne и Lindberg [27], Книрель и Кочетков [4], Jansson [26]. В то же время данные по строению антигенных полисахаридов морских микроорганизмов достаточно фрагментарны.
В данном обзоре представлены химический состав и структуры внеклеточных полисахаридов и О-антигенов грамотрицательных морских протеобактерий двух родов Pseudoalteromonas и Shewanella. Род Pseudoalteromonas принадлежит к валидно описанному семейству Alteromonadaceae, класс Gammaproteobacteria, тип Proteobacteria и включает только морские микроорганизмы. Род Shewanella содержит как морские, так и наземные формы бактерий, и, по данным последнего издания «Taxonomic Outline of Bergey Trust», также включен в семейство Alteromonadaceae. Эти бактерии обладают сходными фенотипическими и генотипическими характеристиками, обитают в различных биотопах, включая прибрежные и открытые воды, глубоководные и гидротермальные источники, донные осадки, а также в морских гидробионтах.
Большинство изученных бактериальных штаммов были взяты из Коллекции морских микроорганизмов (КММ) Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (Владивосток).
Для установления химической структуры полисахаридов были использованы методы моносахаридного анализа и метилирования, 1Н- и 13С-ЯМР спектроскопии [7], включая эксперименты двумерной спектроскопии ЯМР, такие как 1H, 1H COSY, HOHAHA или TOCSY, 1H—13C HMQC и HMBC, NOE спектроскопия (1D NOE, 2D NOESY и ROESY) и APT-эксперимент. В некоторых случаях применялось селективное химическое расщепление и масс-спектрометрический анализ.
Структуры углеводных антигенов рода Pseudoalteromonas
Для морских грамотрицательных гетеротрофных подвижных бактерий с одним полярным жгутиком, окислительным типом метаболизма и содержанием ГЦ в ДНК 38—50 моль % Бауманном был образован род Alteromonas, принадлежащий к семейству Alteromonadaceae [12]. На основании результатов секвенса рРНК в 1995 г. была проведена ревизия гетерогенного рода Alteromonas, в результате которой было образовано 2 рода: Alteromonas с единственным видом A. macleodii и Pseudoalteromonas, включающий около 30 валидно описанных видов бактерий [16].
Грамотрицательные бактерии рода Pseudoalteromonas являются аэробными неферментирующими прокариотами. Они представляют собой широко распространенные облигатные морские микроорганизмы и нуждаются для роста в морской
воде. Бактерии продуцируют широкий набор биологически активных соединений, таких как антибиотики, токсины и антитоксины, антиопухолевые и антимикробные агенты, а также широкий спектр ферментов.
Общей особенностью большинства полисахаридов рода РБеМоакеготопаБ, при отсутствии заметного сходства в строении повторяющегося звена, являются их кислый характер и присутствие редко встречающихся сахаров и неуглеводных заместителей. Так, среди необычных кислотных компонентов полисахаридов РБеМоакеготопаБ обнаружены Ь-идуроновая кислота [21], 2-ацетамидо-2-дезок-сигексуроновые кислоты с Б-галакто- [22, 37], Ь-галакто- [22, 45] и Ь-гуло-кон-фигурацией [10], 3-дезокси-Б-манно-октулозоновая кислота [18, 36], 5-ацетами-до-3,5,7,9-тетрадезокси-7-формамидо-Ь-глицеро-О-манно-нонулозоновая кислота [37], 2,3-диацетамидо-2,3-дидезокси-О-манно-уроноил-Ь-аланин [33], остатки (Я)-молочной кислоты [1], сульфатная [5, 40] и глицерофосфатная [2] группы. Широко представлены и различные М-ацильные производные 6-дезоксиами-носахаров, такие как М-ацетилированные 2-амино-2,6-дидезокси-Б-глюкоза (Б-хиновозамин) [37], -Ь-галактоза (Ь-фукозамин) [18] и -Ь-талоза (пневмоза-мин) [18], 3-(М-ацетил-Б-аланил)амино-3,6-дидезокси-Б-глюкоза [22],
4-(М-ацетил-Б-аланил)амино-4,6-дидезокси-Б-глюкоза [45] и 3,6-дидезок-си-3-(4-гидроксибутирамидо)-Б-галактоза [10], а также М-ацетил- и М-[(8)-3-гидроксибутирил]производные 2,4-диамино-2,4,6-тридезокси-Б-глю-козы (бациллозамина) [18, 21, 22, 33].
Химические структуры повторяющихся звеньев О-антигенов и экзополисахаридов (внеклеточных полисахаридов) установлены для 16 различных штаммов и видов РБеМоакеготопаБ.
Установлена структура экзополисахарида, продуцируемого микроорганизмом РБеМоакеготопаБ, штамм ИУБ 721, выделенным из глубоководного гидротермального источника [40]:
^4)-р-Б-Ыапр-(1 ^4)-р-Б-01ф-(1 ^4)-а-Б-ва1^-(1 ^-4)-р-Б-01ф-(1 ■^.
2 3
т т
1 1
а-Ь-ЯИа^ р-Б-Оа1/>
3
т
1
Р-Б-Мапр-(1^4)-р-Б-01фЛ
3
т
803И
Повторяющееся звено этого полимера представляет собой разветвленный сульфа-тированный октасахарид, содержащий в основном нейтральные моносахариды и один остаток Б-глюкуроновой кислоты. Он сильно отличается по составу от экзополисахаридов, секретируемых микроорганизмами ЛкеготопаБ, штаммы ИУБ 1545 и ИУБ 1644 [20].
Полисахарид Pseudoa1teromonas Бр. (ранее ЛкеготопаБ Бр.) КММ 155 построен из тетрасахаридных повторяющихся звеньев, содержащих четыре аминосахара, включая Б-ваШЛс, 2-ацетамидо-2-дезокси-Ь-галактуроно-вую кислоту (Ь-ваШЛсЛ), 4-(М-ацетил-Б-аланил)амино-4,6-дидезок-
си-Э-глюкозу [D-Qui4N(D-AlaAc)] и 2,4-диацетамидо-2,4,6-тридезок-си-Э-глюкозу (D-QuiNAc4NAc) [49]:
^3)-a-D-GalpNAc-(1^4)-a-L-GalpNAcA-(1^3)-a-D-QuipNAc4NAc--(1 ^3)-p-D-Quip4N(D-AlaAc)-(1 ^.
Следует отметить, что остаток 4-^-ацетил-Э-аланил)амино-4,6-дидезок-си-D-глюкозы [D-Qui4N(D-AlaAc)] был обнаружен в составе бактериальных полисахаридов впервые, в отличие от остатка 2,4-диацетамидо-2,4,6- тридезок-си-D-глюкозы (D-QuiNAc4NAc), который ранее был идентифицирован в составе О-антигенов некоторых других бактерий (Pseudomonas aeruginosa, P. aurantia-ca IMB 31, Vibrio cholerae O:3 и O:5, Fusobacterium necroforum [29]). QuiNAc4NAc и другие N-ацильные производные бациллозамина являются компонентами многих О-антигенов [8]. При установлении структуры полисахарида штамма КММ 155 применяли частичный сольволиз безводным HF и гетероядер-ный 1H—13C HMQC эксперимент.
О-специфический полисахарид Pseudoalteromonas sp. КММ 634 по своей структуре является уникальным среди антигенных полисахаридов бактерий [6, 39]:
^3)-a-D-QuipNAc4N(S-3Hb)-(1 ^4)-p-D-ManpNAc3NAcA6(L-Ala)-(1 ^4)--P-D-GlcpNAc3NAcA-(1 ^4)-p-D-Glcp A-(1 ^.
Он содержит ряд необычных компонентов, среди которых 2-ацетами-до-4-[(S)-3-гидроксибутирамидо]-2,4,6-тридезокси-D-глюкоза [D-QuiNAc4N(S-3Hb)], 2,3,-диацетамидо- 2,3-дидезокси-D-глюкуроновая кислота и амид 2,3,-диацетамидо-2,3-дидезокси-Э-маннуроновой кислоты с аланином [D-ManNAc3NAcA6(L-Ala)]. Обе диаминоуроновые кислоты редко встречаются в природе, и только в составе бактериальных полисахаридов [4, 26, 29, 33]; впервые они были идентифицированы в О-антигенах Pseudomonas aeruginosa [29]. Амиды диаминоуроновых кислот с аминокислотами или какими-либо другими аминокомпонентами ранее не были обнаружены в природе. В ходе структурного изучения полисахарида для селективного расщепления гликозидных связей был впервые применен новый сольволитический агент — безводная трифторметан-сульфокислота [40].
Кислый О-специфический полисахарид Pseudoalteromonas sp. КММ 637 (первоначально Alteromonas sp. 4MC17) выделен из мантии двустворчатого моллюска Crenomytilus grayanus и построен из трисахаридных повторяющихся звеньев, содержащих D-глюкозу, D-маннозу и D-галактуроновую кислоту [9]:
^4)-p-D-Glcp-(1^4)-p-D-GalpA-(1^4)-p-D-Manp-(1^.
На основании результатов кислотного гидролиза, дефосфорилирования, 31P-, 13С-ЯМР спектроскопии было установлено, что О-специфический полисахарид Pseudoalteromonas sp. KMM 639 представляет собой фосфорилированный полимер, построенный из дисахаридных повторяющихся звеньев, состоящих из остатков L-рамнозы, D-галактозы и глицерофосфата [2]:
^3)-a-L-Rhap-(1 ^3)-a-D-Galp-(1 ^.
6
t
Gro-2-P
Кислый разветвленный полисахарид из липополисахарида P. distincta КММ 638, выделенного из морской губки, содержит три кислых компонента в пентаса-харидном повторяющемся звене, два из которых — кислые аминосахара: D-GalNAcA и 5-ацетамидо-3,5,7,9-тетрадезокси-7-формамидо-Ь-гяице-
ро-Ь-манно-нонулозоновая кислота (производное псевдаминовой кислоты, Pse5Ac7Fo) [37]:
^4)-p-D-Qui/>NAc-(1 ^4)-a-Psep5Ac7Fo-(2^
3
t
1
a-D-Gkp A-(1 ^4)-p-D-Gal^NAc-(1 ^4)-a-D-Gal^NAcA
3
t
Ac (~ 60 %)
Попытка установить мономерный состав полисахарида обычными методами мо-носахаридного анализа оказалась неудачной из-за устойчивости гликозидных связей уроновых кислот к кислотному гидролизу. Структура полисахарида была определена с помощью частичного кислотного гидролиза и мягкой щелочной деградации с последующей характеристикой полученных продуктов методами ESI MS и ^^ЯМБ спектроскопии. Степень О-ацетилирования GalNAcA в положении 3 составляет ~ 60 %.
Штамм нового вида P. elyakovii КММ 162 был выделен из целомической жидкости дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus. Показано, что он значительно отличается от других фенотипически сходных видов Pseudoalteromonas (P. halo-planktis, P. tetraodonis, P. atlantica и P. carrageenovora) способом утилизации углеводов, низким содержанием ГЦ в ДНК (20—40 %), а также антигенной специфичностью. Структура линейного повторяющегося звена О-специфического полисахарида P. elyakovii КММ 162 [19]:
^2)-a-D-Glc^-(1^4)-p-D-Gal^NAc-(1^3)-a-D-Gal^-(1^3)-p-D-Gal^NAc-
-(1 ^6)-a-D-Glcp-(1 ^ была установлена на основании данных деградации по Смиту, метилирования и ЯМР спектроскопии, включая компьютерную обработку результатов 13С-ЯМР-спектров.
В 1979 г. шесть оранжево-пигментированных бактерий были выделены из морской воды и с поверхности морской водоросли Ulva lacuta [17] и отнесены к P. aurantia (первоначально Alteromonas aurantia). Однако было замечено, что один штамм, NCIMB 2033 (=ATCC 33042), имел некоторые фенотипические характеристики, общие с Pseudoalteromonas piscicida (первоначально Pseudomonas [14]). Позднее, на основании данных фено-хемотаксономических и генотипических исследований, он был отнесен к новому виду P. flavipulchra [34]. Кислый полисахарид P. flavipulchra NCIMB 2033T построен из трисахаридных повторяющихся звеньев, состоящих из остатков D-галактозы, 4-О-ацетил-6-дезокси-L-талозы (L-6dTal) и 3-дезокси-Э-манно-окт-2-улозоновой кислоты (Kdo) [36]:
^3)-a-L-6dTal^-(1^3)-p-D-Gal^-(1^7)-a-Kdo^-(2^.
4
t
Ac
6-Дезокси-L-талоза встречается в ряде бактериальных полисахаридов реже, чем L-рамноза и L-фукоза [33], и часто в ацетилированной форме. Kdo редко обнаруживается в антигенных полисахаридах, но является обязательным компонентом кора липополисахарида.
О-специфический полисахарид P. haloplanktis ATCC 14393T имеет кислый характер и содержит остатки D-галактозы (D-Gal), 3-^-ацетил-Э-аланил)ами-
но-3,6-дидезокси-D-глюкозы [D-Qui3N(D-AlaAc)], 2,4-диацетамидо-2,4,6-три-дезокси-D-глюкозы (D-QuiNAc4NAc) и 2-ацетамидо-2-дезокси-D- и -L-галак-туроновых кислот (D- и L-GalNAcA) [22]:
^3)-p-D-QuipNAc4NAc-(1^2)-p-D-Quip3N(D-AlaAc)-(1^4)-a-D-GalpNAcA--(1 ^4)-a-D-Gal^-(1 ^4)-a-L-Gal^NAcA-(1 ^.
2 6
I I
Ac Ac (50—70 %)
Структура полисахарида была установлена с помощью деградации по Смиту и 1H-и 13С-ЯМР спектроскопии. 50—70 % остатков галактозы в цепи замещены в положениях 2 и 6 О-ацетильными группами. Этот О-антиген — первый бактериальный полисахарид, который имеет в своем составе D- и L-изомеры 2-ацетамидо-2-дез-оксигалактуроновой кислоты. Другой редко встречающийся аминосахар, 3-(N-ацетил-D-аланил)амино-3,6-дидезокси-D-глюкоза [D-Qui3N(D-AlaAc), ранее обнаруживался только однажды как компонент О-специфического полисахарида Proteus penneri 14 [47].
Кислый О-специфический полисахарид был выделен из морского микроорганизма P. (ранее Alteromonas) haloplanktis КММ 156 [1]. Его тетрасахаридное повторяющееся звено содержит два остатка L-рамнозы и по одному остатку 2-ацетами-до-2-дезокси-D-глюкозы и D-глюкозы, этерифицированной остатком ^)-молоч-ной кислоты — 3-О-[(R)-1-карбоксиэтил]-D-глюкозы [Glc3(R-Lac)]:
^4)-p-D-Glc^NAc-(1 ^2)-a-L-Rhap-(1 ^3)-p-L-Rha^-(^.
3
t
1
a-D-Glc/>3(,R-Lac)
Последний моносахарид является деамино-аналогом мурамовой кислоты, которая широко распространена в природе как компонент пептидогликанов клеточной стенки бактерий.
О-специфический полисахарид P. haloplanktis КММ 223 [21] содержит один остаток L-идуроновой кислоты (L-IdoA) и по два остатка D-глюкуроновой кислоты (D-GlcA) и 2-ацетамидо-4[^)-3-гидроксибутирамидо]-2,4,6-тридезок-
си-D-глюкозы [D-QuiNAc4N(S-3Hb)]:
^4)-p-D-Glc^A-(1^3)-p-D-Qui^NAc4N(S-3Hb)--(1 ^2)-a-L-Ido^ A-(1 ^4)-p-D-Glc^ A-(1 ^.
4
t
1
a-D-Qui/>NAc4N(S-3Hb)
Интересно отметить, что полисахарид имеет три отрицательно заряженные группы в пентасахаридном звене, хотя обычно большинство известных кислых О-антигенов содержат не более одной отрицательно заряженной группы на повторяющееся звено. Один из кислых моносахаридов, L-идуроновая кислота, — хорошо известный компонент гликозаминогликанов млекопитающих (дерматансульфат, гепарансуль-фат и гепарин), но неизвестен в бактериальных полисахаридах. Это первый случай обнаружения L-идуроновой кислоты в липополисахариде. Идуроновая кислота не-
установленной абсолютной конфигурации идентифицирована ранее в составе полисахарида только одного вида бактерий — Clostridium perfringens [32].
Отличительной особенностью агаролитического штамма бактерии P. marino-glutinosa КММ 232 является то, что в процессе культивирования на твердых средах наряду со слизистыми колониями отмечается появление мелких матовых колоний, имеющих складчатую поверхность (R-форма). Бактерии R-формы неподвижны, но при культивировании в жидкой среде клетки вновь становятся монотриха-ми. Причем необходимо отметить, что и S—, и R-формы этого штамма устойчивы и хорошо разделяются. Это было отмечено для бактерий рода Pseudoalteromonas впервые. Полисахарид S-формы имеет дисахаридное повторяющееся звено, которое содержит остатки D-маннозы, L-рамнозы и сульфатную группу [5]:
^■3)-p-D-Manp-(1 ^4)-a-L-Rhap-(1 ^
2
t
SO3H
Присутствие и положение сульфатной группы были определены с помощью методов метилирования, ИК-спектроскопии (полоса поглощения 1240 см-1) и сравнительным анализом химических сдвигов в спектрах 13С-ЯМР нативного и десуль-фатированного полисахаридов, в частности по a-эффектам гликозилирования на замещенный углерод (> 6 м. д.). P. marinoglutinosa КММ 232 является первой гра-мотрицательной бактерией, в составе О-специфического полисахарида которой обнаружена сульфатная группа.
Повторяющееся звено полисахарида P. (ранее Alteromonas) nigrifaciens IAM 13010T [24] представляет собой разветвленный пентасахарид, состоящий из остатков L-фукозамина, 6-дезокси-L-талозы, Kdo и двух остатков D-глюкозамина [18]:
^4)-a-L-6dTal^NAc-(1 ^3)-a-D-GlcpNAc-(1 ^3)-a-L-Fuc^NAc-(1 ^3)-р-
3 t
2
P-Kdop
-D-Glc^NAc-(1^.
Следует отметить, что 6-дезокси-L-талоза была идентифицирована ранее только в составе капсульного полисахарида Pneumococcus тип V [11, 13]. Мягкий кислотный гидролиз полисахарида P. nigrifaciens IAM 13010T привел к отщеплению остатка Kdo, в результате чего был получен линейный полисахарид, состоящий из четырех N-ацетилированных аминосахаров.
Две морские бактерии, выделенные из мантии дальневосточных моллюсков Crenomytilus grayanus и Patinopecten yessoеnsis, были идентифицированы как P. nigrifaciens (штаммы КММ 158 [25] и КММ 161 [3], соответственно) на основе их физиологических и биохимических свойств и данных ДНК-ДНК гибридизации. Полисахарид, выделенный из P. nigrifaciens КММ 158 (описанный ранее как Alteromonas macleodii 2MM6), имел такое же строение, что и капсульный полисахарид. Он представляет собой разветвленный тетрасахарид, состоящий из остатков D-галактозы, 3-0-ацетил-Э-глюкозамина, 3,6-дидезокси-3-(4-гидроксибутирамидо)-D-галакто-зы [D-Fuc3N(4-Hb)] и 2-ацетамидо-2-дезокси-L-гулуроновой кислоты
(L-GulNAcA) [10]. О-специфический полисахарид P. nigrifaciens КММ 161 имеет такую же структуру, что и полисахарид штамма КММ 158; это следует из полного совпадения химических сдвигов в спектрах 13С-ЯМР обоих полисахаридов [3]:
^4)-aL-Gul^NAcA-(1 ^4)-p-D-GkpNAc-(1 ^3)-a-D-Gal^-(1 ^.
3 4
t t
Ac 1
a-D-Fuc/>3N(4-Hb)
Остаток 3,6-дидезокси-3-(4-гидроксибутирамидо)-D-галактозы обнаружен в природе впервые; он был выделен в индивидуальном состоянии методом хроматографии на бумаге после частичного гидролиза полимера. Производные другого редко встречающегося моносахарида, 2-ацетамидо-2-дезокси-L-гулуроновой кислоты, найдены ранее в составе капсульных полисахаридов Vibrio para-haemolyticus [44] и Neisseria meningitidis группа I [35].
О-специфический полисахарид тетродотоксин-продуцирующей бактерии P. tetraodonis IAM 14160Т содержит остатки D-галактозы, D-глюкуроновой кислоты, D-глюкозамина, D-галактозамина и два остатка 3,6-дидезокси-L-ксuло-гек-созы (колитозы, Col) [38]:
^2)-a-Col/>-(1 ^4)]-p-D-Glc/>NAc-(1 ^4)-p-D-Glc/>A-(1 ^3)-p-D-Gal/>NAc(^.
3
t
1
a-Col/>(1 ^2)-p-D-Gal/>
Интересно отметить, что гексасахаридное повторяющееся звено О-специфическо-го полисахарида P. tetraodonis содержит аналогичный тетрасахаридный фрагмент a-Col/>(1^2)-p-D-Gal/>-(1^3)-[a-Col/>-(1^4)]-p-D-Glc/>NAc, что и полисахарид Aeromonas trota [30] и капсульный полисахарид Vibrio cholerae 0139 [31]. Хо -тя этот фрагмент имеет разное замещение во внутренней части цепи, а два других моносахарида в гексасахаридной цепи не такие же, три полисахарида имеют большое сходство на невосстанавливающем конце. Общий терминальный тетрасаха-ридный фрагмент является «колитозным» аналогом (3-дезокси-L-фукоза) антигенной детерминанты групповых веществ крови Lewisb a-L-Fucp-(1^-2)-P-D-Gal/>-(1^3)-[a-L-Fuc/>-(1^4)]-p-D-Glc/>NAc, и его присутствие в бактериальных полисахаридах может играть роль в адаптации микроорганизмов.
Структуры углеводных антигенов рода Shewanella
Бактерии рода Shewanella являются предметом многих научных исследований уже 70 лет. К настоящему времени этот род содержит более 20 валидно описанных штаммов, включая свободноживущие и симбионтные формы, из разнообразных морских источников: воды, донных осадков, рыб, водорослей, животных и др. Морские микроорганизмы рода Shewanella являются патогенами некоторых видов промысловых рыб, инициируют гнилостные процессы в пищевых продуктах, богатых белком; некоторые виды патогенны для человека (S. algae и S. putre-faciens) — они вызывают некроз ткани и сепсис. Антигенный состав бактерий этого рода практически не изучен.
Штамм S. algae 48055, выделенный из крови больного [15], содержит липопо-лисахарид с кислым О-специфическим полисахаридом. В состав полисахарида входит сиаловая кислота (Neu5Ac), которая определена колориметрическим методом после О-дезацетилирования, и амид D-галактуроновой кислоты с 2-ами-но-1,3-пропандиолом (2-аминоглицерином) (GroN):
^3)-p-D-Gal^A6(GroN)-(1^3)-p-D-Glc^NAc-(1^3)-p-D-Gal^A6(GroN)-
(1^4)-a-Neu/>5Ac(2^-.
Мягкий кислотный гидролиз, применяемый обычно для делипидации липополиса-харида, привел к деполимеризации полисахарида и образованию тетрасахарида с остатком Neu5Ac на восстанавливающем конце. Изучение тетрасахарида и О-дез-ацетилированного липополисахарида методами 1Н- и 13С-ЯМР спектроскопии привело к установлению структуры повторяющегося звена полисахарида [42]. Примечательно, что структура этого полисахарида очень схожа со структурой О-специфического полисахарида non-O1 Vibrio cholerae H11 [45], которая отличается только присутствием остатка D-QuiNAc вместо D-GlcNAc и связью между остатком GlcNAc и одним из остатков D-GalA6 (GroN), (1^4) вместо (1^3).
Бактерия S. algae BrY выделена из донных осадков и является условно патогенной. При мягкой кислотной деградации липополисахарида был получен кислый О-специфический полисахарид, содержащий два остатка L-Rha, остаток D-QuiNAc4N(R-3Hb) и производное L-FucN [46]:
^•3)-a-D-Qui^NAc4N(R-3Hb)-(1 ^3)-a-L-Rha^-(1 ^-2)-a-L-Rha^-(1 ^2)-L-malyl-(4^2)-a-L-Fuc/>N-(1^-.
Последний моносахарид N-ацилирован 4-й карбоксильной группой L-малоновой кислоты, которая присоединяется к соседнему L-рамнозному остатку. Малоновая кислота идентифицирована в основной углеводной цепи бактериального полисахарида впервые.
Фенол-растворимый полисахарид был выделен из S. putrefaciens A6. Попытки определения моносахаридного состава обычными методами после полного кислотного гидролиза оказались безуспешными. Поэтому была проведена химическая модификация полимера с одновременным использованием 1Н- и 13С-ЯМР спектроскопии. Установлено, что повторяющееся звено состоит из двух высших С(9) сахаров: 8-О-ацетил-7-ацетамидино-5-ацетамидо-3,5,7,9-тетрадезокси-Ь-глице-ро-Э-галакто-нон-2-улозоновой кислоты (производное 8-эии-легионаминовой кислоты, 8eLeg5Ac7Am) и нового С-разветвленного моносахарида 2-ацетами-до-2,6-дидезокси-4-С-(3 '-карбоксамид-2' ,2'-дигидроксипропил) D-галактозы, названной шеванеллозой [43]:
СНз
^4)-a-8e-Leg/>5Ac7Am8Ac-(2^3)-p-Shep-(1^.
Ди-Ы-ацетил-8-эии-легионаминовая кислота впервые была обнаружена в составе О-антигена Legionella pneumophila серогруппы 1 [48], а позже в некоторых других бактериальных полисахаридах. В S. putrefaciens A6 шеванеллоза присутствует в пиранозной форме, хотя совсем недавно она была найдена и в пиранозной, и в фу-ранозной формах в составе О-антигена энтеробактерии Morganella morganii [28]. Интересно, что полисахарид M. morganii тоже представляет собой дисахаридное
повторяющееся звено, в котором второй моносахарид является также производным 8-эии-легионаминовой кислоты с другим положением N-ацильных групп (8eLeg5Am7Ac). Основываясь на предположении, что общими предшественниками биосинтеза различных моносахаридов являются нуклеотиды гексоз-4-улозы, можно считать, что ключевой ступенью в биосинтезе шеванеллозы является реакция между 2-ацетамидо-2,6-дидезокси-Э-ксило-гексоз-4-улозой и фосфоенол-пируватом. Следует заметить, что такая же гексоз-4-улоза была обнаружена как компонент капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae тип 5 [25].
Фосфорилированный полисахарид был выделен из водного слоя при фе-нол-водной экстракции негалофильной бактерии S. putrefaciens S29 [41]:
^4)-a-L-Qui^NAc-(1 ^3)-a-D-Glc^NAc-(1 ^3)-p-a-D-Qui^4NAc-(1 ^3)-a-D-Gal^-1-P-(O^.
Полисахарид принадлежит к семейству полимеров, имеющих олигосахаридфос-фатные повторяющиеся звенья, которые известны главным образом как внеклеточные полисахариды и полисахариды клеточной стенки грамположительных бактерий [27]. Гликозилфосфатные связи были легко расщеплены в условиях мягкого кислотного гидролиза, и получено фосфорилированное тетрасахаридное повторяющееся звено. Полисахарид содержит также два редко встречающихся 6-дезокси-ацетамидосахара, L-QuiNAc и D-Qui4NAc, которые были обнаружены и в некоторых полисахаридах грамотрицательных бактерий [4, 33].
Заключение
Химические структуры полисахаридов различных штаммов морских бактерий Pseudoalteromonas и Shewanella отличаются большим разнообразием при отсутствии заметного структурного сходства. Данные полисахариды являются источником редких и необычных моносахаридов, включающих высшие сахара и их производные, которые, в свою очередь, имеют неуглеводные заместители. Полученные результаты явятся существенным вкладом в структурную химию биогли-канов морских микроорганизмов.
Кроме того, структурное исследование полисахаридных антигенов как компонентов биогликанов в целом имеет фундаментальное значение для понимания молекулярных механизмов основных жизненных процессов и позволит использовать полученные данные как химическую основу для внутривидовой классификации бактерий, а также идентификации штаммов.
Изучение хемотаксономических особенностей протеобактерий, и в частности их антигенного строения, может также служить в качестве одного из критериев, позволяющих устанавливать филогенетическое родство и прослеживать пути эволюции микроорганизмов, а также быть полезным для уточнения существующих представлений об организации и механизмах функционирования клеточной стенки грамотрицательных морских бактерий.
ЛИТЕРАТУРА
1. Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Зубков В. А., Иванова Е.П., Оводов Ю.С., Шашков А.С., Книрель Ю.А. Структура повторяющегося звена кислого полисахарида Alteromonas haloplanktis KMM 156 // Биоорган. химия. 1993. Т. 19, № 3. C. 327—336.
2. Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Исаков В.В., Зубков В.А., Горшкова Н.М., Романенко Л.А., Иванова Е.П. Структура глицерофосфатсодержащего О-специфического полисахарида Pseudoalteromonas sp. KMM 639 // Биоорган. химия. 1998. Т. 24, № 11. C. 839—841.
3. Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Зубков В.А., Иванова Е.П., Горшкова Н.М., Исаков В.В. Структура О-специфического полисахарида Pseudoalteromonas nigrifaciens KMM 161 // Биохимия. 2002. Т. 67, вып. 6. С. 810—814.
4. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. III. Структура О-специфических полисахаридов // Биохимия. 1994. Т 59, вып. 12. С. 1784—1851.
5. Командрова Н.А., Томшич С.В., Исаков В.В., Романенко Л.А. Структура сульфатированного О-специфического полисахарида морской бактерии Pseudoalteromonas marinoglutinosa KMM 232 // Биохимия. 1998. Т. 63, вып. 10. С. 1410—1415.
6. Командрова Н. А., Томшич С.В., Шевченко Л.С., Перепелов А.В., Сенченкова С.Н., Шашков А.С., Книрель Ю.А. Структура кислого О-специфического полисахарида морской бактерии Pseudoalteromonas sp. KMM 634 // Биохимия. 2000. Т. 65, вып. 9. С. 1253—1261.
7. Кочетков Н.К., Виноградов Е.В., Книрель Ю.А., Шашков А.С., Липкинд Г.М. Программа SCAN для структурного анализа линейных полисахаридов на основе данных 13С-ЯМР-спектров с использованием персональных компьютеров // Биоорган. химия. 1992. Т. 18, № 1. C. 116—125.
8. Кочетков Н.К. Необычные моносахариды — компоненты О-антигенных полисахаридов микроорганизмов // Успехи химии. 1996. Т. 18, № 9. С. 799—835.
9. Назаренко Е.Л., Зубков В. А., Шашков А.С., Книрель Ю.А., Горшкова Р.П., Иванова Е.П., Оводов Ю.С. Структура повторяющегося звена кислого полисахарида Alteromonas sp. 4MC17 // Биоорган. химия. 1993. Т. 19, № 7. C. 733—739.
10. Назаренко Е.Л., Зубков В.А., Шашков А.С., Книрель Ю.А., Горшкова Р.П., Иванова Е.П., Оводов Ю.С. Структура повторяющегося звена кислого полисахарида Alteromonas macleodii 2MM6 // Биоорган. химия. 1993. Т. 19, № 7. C. 740—751.
11. Barker S.A., Brimacombe J.S., Low M.J., Stacey M., Williams J.N. Two new amino sugars from an antigenic polysaccharide of Pneumococcus // Nature. 1961. Vol. 189, N 4761. P. 303—304.
12. Baumann L., Baumann P., Mandel M., Allen R.D. Taxonomy of aerobic marine eubacteria // J. Bacteriol. 1972. Vol. 110. P. 402—429.
13. Brimacombe J.S., Low M.J. Pneumococcus type V polysaccharide: characterisation of pneumosamine as 2-amino-2,6-dideoxy-L-talopyranose // J. Chem. Soc. 1962. Vol. 344, N 12. P. 5037—5040.
14. Buck J.D., Meyer S.P., Leifson E. Pseudomonas (Flavobacterium) piscicida Bein comb. nov. // J. Bacteriol. 1963. Vol. 86. P. 1125—1126.
15. Domingues H., Vogel B.F., Gram L., Hoffman S., Schaebel S. Shewanella algae bacteremia in two patients with lower leg ulcers // Clin. Infect. Dis. 1996. Vol. 22. P. 1036—1039.
16. Gauthier G., Gauthier M., Christen R. Phylogenetic analysis of the genera Alteromonas, Shewanella, and Moritella using genes coding for small-subunit rRNA sequences and division of the genus Alteromonas into two genera, Alteromonas (emended) and Pseudoalteromonas gen. nov., and proposal of twelve new species combinations // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. Vol. 45, N 4. P. 755—761.
17. Gauthier M.J., Breittmayer V.A. A new antibiotic-producing bacterium from seawater: Alteromonas aurantia sp. nov // Int. J. Syst. Bacteriol. 1979. Vol. 29. P. 366—372.
18. Gorshkova R.P., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Paramonov N.A., Meshkov S.V., Ivanova E.P. Structure of the capsular polysaccharide from Alteromonas nigrifaciens IAM 13010T containing 2-acetamido-2,6-dideoxy-L-talose and 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid // Carbohydr. Res. 1997. Vol. 299, N 1—2. P. 69—76.
19. Gorshkova R.P., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Shashkov A.S., Ivanova E.P., Gorshkova N.M. Structure of the O-specific polysaccharide from Pseudoalteromonas elyakovii sp. nov. CMM 162 // Carbohydr. Res. 1998. Vol. 313, N 1. P. 61—64.
20. Guezennec J., Pignet P., Raguenes G., Deslandes E., Lijour Y., Gentric E. Novel exopolysaccharides from hydrothermal origin // Carbohydr. Polym. 1994. Vol. 24. P. 287—294.
21. Hanniffy O.M., Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Tomshich S.V., Komandrova N.A., Romanenko L.A., Knirel Y.A., Savage A.V. Structure of a highly acidic O-specific polysaccharide of lipopolysaccharide of Pseudoalteromonas haloplanktis KMM 223 (44-1) containing L-iduronic acid and D-QuiNHb4NHb // Carbohydr. Res. 1998. Vol. 307, N 3—4. P. 291—298.
22. Hanniffy O.M., Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Tomshich S.V., Komandrova N.A., Romanenko L.A., Knirel Y.A., Savage A.V. Structure of an acidic O-specific polysaccharide of Pseudoalteromonas haloplanktis type strain ATCC 14393 containing 2-acetamido-2-deoxy-D- and -L-galacturonic acids and 3-(N-acetyl-D-alanyl)amino-3,6-dideoxy-D-glucose // Carbohydr. Res. 1999. Vol. 321, N 1—2. P. 132—138.
23. Holst O. Chemical structures of the core region of lipopolysaccharides // Endotoxin in Health and Disease / Eds Brade Y., Opal S.M., Vogel S.N., Morrison D.C. N. Y.: Marcel Dekker, 1999. P. 115—154.
24. Ivanova E.P., Kiprianova E.A., Mikhailov V.V., Levanova G.F., Garagulya A.D., Gorshkova N.M., Yumoto N., Yoshikawa S. Characterization and identification of marine Alteromonas nigrifaciens strains and emendation of the description // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. Vol. 46. P. 223—228.
25. Jansson P.-E. The chemistry of the polysaccharide chains in bacterial lipopolysaccharides // Endotoxin in Health and Disease / Eds Brade Y, Opal S.M., Vogel S.N., Morrison D.C. N. Y: Marcel Dekker, 1999. P. 155—178.
26. Jansson P.-E., Lindberg B., Lindquist U. Structural studies of the capsular polysaccharide from Streptococcus pneumoniae type V // Carbohydr. Res. 1985. Vol. 140, N 2. P. 101—110.
27. Kenne L., Lindberg B. Bacterial polysaccharides // Polysaccharides / Ed. Aspinall G.O. N. Y: Academic Press, 1983. Vol. 2. P. 287—363.
28. Kilcoyne M., Shashkov A.S., Senchenkova S.A., Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Radziejewska-Lebrecht J., Galimska-Stypa R., Savage A.V. Structural investigation of the O-specific polysaccharides of Morganella morganii consisting of two higher sugars // Carbohydr. Res. 2002. Vol. 337, N 18. P. 1697—1702.
29. Knirel Y.A. Polysaccharide antigens of Pseudomonas aeruginosa // Crit. Rev. Microbiol. 1990. Vol. 17. P. 273—304.
30. Knirel Y.A., Senchenkova S.N., Jansson P.-E., Weintraub A., Ansaruzzaman M., Albert M.J. Structure of the O-specific polysaccharide of an Aeromonas trota strain cross-reactive with Vibrio cholerae O139 Bengal // Eur. J. Biochem. 1996. Vol. 238. P. 160—165.
31. Knirel Y.A., Paredes L., Jansson P.-E., Weintraub A., Widmalm G., Albert M.J. Structure of the capsular polysaccharide of Vibrio cholerae O139 synonym Bengal containing D-galactose-4,6-cyclophosphate // Eur. J. Biochem. 1995. Vol. 232. P. 391—396.
32. Lee L., Cherniak R. Identification of iduronic acid as a constituent of the «type-specific» polysaccharide of Clostridium perfringens Hobbs 10 // Carbohydr. Res. 1974. Vol. 33, N 2. P. 387—390.
33. Lindberg B. Structural diversity and functional versatility // Polysaccharides / Ed. Dumitriu S. N. Y.: Marcel Dekker, 1998. P. 237—273.
34. Mancheno J.M., Martin-Benito J., Martinez-Ripoll M., Gavilanes J.G., Hermoso J.A. Crystal and electron microscopy structures of sticholysin II actinoporin reveal insights into the mechanism of membrane pore formation // Structure. 2003. Vol. 11. P. 1—20.
35. Michon F., Brisson J.R., Roy R., Ashton F.E., Jennings H.J. Structural determination of the capsular polysaccharide of Neisseria meningitidis group I: a two-dimensional NMR analysis // Biochemistry. 1985. Vol. 24. P. 5592—5598.
36. Muldoon J., Perepelov A.V., Shashkov A.S., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Gorshkova R.P., Ivanova E.P., Gorshkova N.M., Knirel Y.A., Savage A.V. Structure of an acidic polysaccharide from the marine bacterium Pseudoalteromonas flavipulchra NCIMB 2033T // Carbohydr. Res. 2003. Vol. 338, N 5. P. 459—462.
37. Muldoon J., Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Tomshich S.V., Komandrova N.A., Romanenko L.A., Knirel Y.A., Savage A.V. Structure of an acidic polysaccharide from a marine bacterium Pseudoalteromonas distincta KMM 638 containing 5-acetamido-3,5,7,9-tetradeoxy-7-formamido-L-glycero-L-manno-nonu-losonic acid // Carbohydr. Res. 2001. Vol. 330, N 2. P. 231—239.
38. Muldoon J., Perepelov A.V., Shashkov A.S., Gorshkova R.P., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Ivanova E.P., Knirel Y. A., Savage A.V. Structure of a colitose-containing O-specific polysaccharide of the marine bacterium Pseudoalteromonas tetraodonis IAM 14160T // Carbohydr. Res. 2001. Vol. 333, N 1. P. 41—46.
39. Perepelov A.V., Senchenkova S.N., Shashkov A.S., Komandrova N.A., Tomshich S.V., Shevchenko L.S., Knirel Y.A., Kochetkov N.K. First application of triflic acid for selective cleavage of glycosidic linkages in structural studies of a bacterial polysaccharide from Pseudoalteromonas sp. KMM 634 // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1. 2000. P. 363—366.
40. Rougeaux H., Guezennec J., Carlson R.W., Kervarec N., Pichon R., Talaga P. Structural determination of the exopolysaccharide of Pseudoalteromonas strain HYD 721 isolated from a deep-sea hydrothermal vent // Carbohydr. Res. 1999. Vol. 315, N 3—4. P. 273—285.
41. Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Gorshkova N.M., Knirel Y.A., Gorshkova R.P. Structure of a phosphorylated polysaccharide from Shewanella putrefaciens strain S 29 // Carbohydr. Res. 1997. Vol. 303, N 3. P. 333—338.
42. Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Gorshkova N. M., Knirel Y.A., Gorshkova R.P. Structure of the acidic polysaccharide chain of the lipopolysaccharide of Shewanella algae 48055 // Carbohydr. Res. 1998. Vol. 309, N 1. P. 103—108.
43. Shashkov A.S., Torgov V.I., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Gorshkova N.M., Gorshkova R.P., Widmalm G. Structure of the phenol-soluble polysaccharide from Shewanella putrefaciens strain A6 // Carbohydr. Res. 2002. Vol. 337, N 12. P. 1119—1127.
44. Torii M., Sakakibara K., Kuroda K. Occurence of 2-amino-2-deoxy-hexuronic acids as constituents of Vibrio parahaemolyticus K15 antigen // Eur. J. Biochem. 1973. Vol. 37. P. 401—405.
45. Vinogradov E.V., Holst O., Thomas-Oates J.E., Broady K.W., Brade H. The structure of the O-anti-genic polysaccharide from lipopolysaccharide of Vibrio cholerae strain H11 (non O1) // Eur. J. Biochem. 1992. Vol. 210. P. 491—498.
46. Vinogradov E., Korenevsky A., Beveridge T.J. The structure of the O-specific polysaccharide chain of the Shewanella algae BrY lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. 2003. Vol. 338, N 3. P. 385—388.
47. Vinogradov E.V., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Kochetkov N.K., Sidorczyk Z., Swierzko A. The structure of Proteus penneri strain 14 O-specific polysaccharide containing D- and L-alanine // Carbohydr. Res. 1991. Vol. 219. C1—C3.
48. Zahringer U., Knirel Y.A., Lindner B., Helbig J.H., Sonesson A., Marre R., Rietschel E.Th. The lipopolysaccharide of Legionella pneumophila serogroup1 (strain Philadelphia 1) // Bacterial Endotoxins. 1995. P. 113—139.
49. Zubkov V.A., Nazarenko E.L., Gorshkova R.P., Ivanova E.P., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Paramonov N.A., Ovodov YS. Structure of the capsular polysaccharide from Alteromonas sp. CMM 155 // Carbohydr. Res. 1995. Vol. 275, N 1. P. 147—154.
