CC BY
68
© Коллектив авторов, 2020
Бязрова М.Г.1' 2, Астахова Е.А.1' 2, Спиридонова А.Б.1, Васильева Ю.В.1' 3,
Прилипов А.Г.4, Филатов А.В.1' 2
Стимуляция В-лимфоцитов человека in vitro с помощью ИЛ-21/СБ40Ь и их характеристика
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», биологический факультет, 119234, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Московский физико-технический институт (Национальный исследовательский университет)», 141701, Московская область, г. Долгопрудный, Российская Федерация
4 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 123098, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Клеточные линии и культуры являются незаменимым инструментом в исследованиях физиологии клеток. Культуры В-лимфоцитов имеют важное значение для изучения В-клеточного ответа, генерации антител, а также для создания терапевтических моноклональных антител. Вместе с тем активация В-лимфоцитов и их продолжительное культивирование in vitro продолжают оставаться нерешенной проблемой.
Цель исследования - разработка протокола стимуляции В-лимфоцитов человека in vitro, характеристика фенотипических и функциональных особенностей стимулированных В-клеток для последующего использования протокола для определения количества В-клеток памяти, секвенирования генов Ig, а также получения иммортализованных клонов В-лимфоцитов.
Материал и методы. Клетки, стабильно трансфецированные геном CD40L, получали путем лентивирусной трансдукции. В-лимфоциты выделяли из периферической крови человека с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верогра-фина с дальнейшим обогащением методом отрицательной селекции с использованием магнитных микросфер. В-лимфоциты стимулировали in vitro с помощью фидерных клеток, несущих поверхностный CD40L, в присутствии экзогенного рекомбинантного интерлейкина (ИЛ) -21. Количество и фенотип стимулированных В-лимфоцитов определяли, используя многоцветную проточную цитометрию. Секрецию IgM и IgG в культурах В-лимфоцитов оценивали с помощью иммуноферментного анализа.
Результаты. С помощью лентивирусной трансдукции были получены клетки HEK293, K562 и A549, стабильно трансфецированные геном CD40L. Исходя из экспрессии молекулы CD40L, а также ростовых свойств для дальнейшего исследования в качестве фидера была выбрана линия трансфецированных клеток A549. При совместном культивировании фидерных клеток и В -лимфоцитов в присутствии экзогенного ИЛ-21 наблюдалась стимуляция В-лимфоцитов. В-лимфоциты начинали пролиферировать и через 7 дней их количество увеличивалось в среднем в 8 раз. Стимулированные В-лимфоциты изменяли свою морфологию. Они приобретали неправильную форму с псевдоподиями, группировались вокруг фидерных клеток и начинали активно передвигаться. При ИЛ-21/ CD40L-стимуляции В-лимфоциты изменяли свой поверхностный фенотип и к 10-му дню около 40 % В-клеток дифференцировались в плазмабласты (CD19+CD27+CD38+). При этом доля CD20+-клеток снижалась до 20 %. Процент клеток с поверхностной экспрессией Ig также снижался. Секреция IgM и IgG в процессе стимуляции, напротив, возрастала. К 12-му дню пролиферативный потенциал В-клеток исчерпывался и они погибали.
Заключение. Культивирование В-лимфоцитов in vitro в присутствии экзогенного ИЛ-21, а также фидерных клеток, экспрессирующих молекулу CD40L, является удобной системой для получения активированных В-лимфоцитов, которые могут использоваться для решения различных задач.
Для корреспонденции
Филатов Александр Васильевич -доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией иммунохимии ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: avfilat@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
Ключевые слова: культура клеток; B-лимфоциты; плазмабласты; ИЛ-21; CD40L
Статья поступила 10.09.2020. Принята в печать 16.10.2020.
Для цитирования: Бязрова М.Г., Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Васильева Ю.В., Прилипов А.Г., Филатов А.В. Стимуляция В-лимфоцитов человека in vitro с помощью HH-21/CD40L и их характеристика. Иммунология. 2020; 41 (6): 501-510. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-6-501-510.
Финансирование. Работа поддержана грантом Российского научного фонда № 19-15-00331.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Byazrova M.G.1, 2, Astakhova E.A.1, 2, Spiridonova A.B.1, Vasileva Yu.V.1' 3, Prilipov A.G.4, Filatov A.V.1, 2
IL-21/CD40L stimulation of human B-lymphocytes in vitro and their characteristics
1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 Lomonosov Moscow State University, 119991, Moscow, Russian Federation
3 Moscow Institute of Physics and Technology, 141701, Moscow Region, Dolgoprudny, Russian Federation
4 Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya, Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Cell lines and cultures are indispensable tools in cell physiology research. Cultures of B lymphocytes are essential for the study of B-cell response, antibody generation, as well as for the creation of therapeutic monoclonal antibodies. At the same time, the activation of B-lymphocytes and their long-term cultivation in vitro continues to be an unsolved problem.
The aim of the study - development of a protocol for the stimulation of human B lymphocytes in vitro, characterization of the phenotype and functional characteristics of stimulated B cells for the subsequent use of the protocol for determining the number of memory B cells, sequencing of Ig genes, as well as obtaining immortalized clones of B lymphocytes.
Material and methods. Cells stably transfected with the CD40L gene were generated by lentiviral transduction. B lymphocytes were isolated from human peripheral blood by centrifu-gation in a density gradient of ficoll-verografin with further enrichment by negative selection using magnetic beads. B lymphocytes were stimulated in vitro with feeder cells carrying surface CD40L in the presence of exogenous recombinant interleukin (IL) -21. The number and phenotype of stimulated B lymphocytes were determined using multicolor flow cytometry. The secretion of IgM and IgG in cultures of B lymphocytes was assessed using enzyme-linked immunosorbent assay.
Results. Using lentiviral transduction, HEK293, K562 and A549 cells stably transfected with the CD40L gene were obtained. Based on the expression of the CD40L molecule, as well as growth properties, the transfected A549 cell line was selected for further research as a feeder. When feeder cells and B lymphocytes were co-cultured in the presence of exogenous IL-21, stimulation of B lymphocytes was observed. B lymphocytes began to proliferate and after 7 days their number increased by an average of 8 times. The stimulated B lymphocytes changed their morphology. They acquired an irregular shape with pseudopodia, grouped around feeder cells, and began to move actively. Upon IL-21/CD40L stimulation, B lymphocytes changed their surface phenotype and by day 10, about 40 % of B cells had differentiated into plas-mablasts (CD19+CD27+CD38+). At the same time, the proportion of CD20+ cells decreased to 20 %. The percentage of cells with surface Ig expression also decreased. In contrast, the secretion of IgM and IgG increased during stimulation. By the 12th day, the proliferative potential of B cells was exhausted, and they died.
Сonclusion. In vitro cultivation of B lymphocytes in the presence of exogenous IL-21, as well as feeder cells expressing the CD40L molecule, is a convenient system for obtaining activated B lymphocytes that can be used in different applications.
For correspondence
Alexander V. Filatov -Dr.Sci., Professor, Head of the Laboratory of Immunochemistry, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: avfilat@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
Keywords: cell culture; B lymphocytes; plasmablasts; IL-21; CD40L
Received 10.09.2020. Accepted 16.10.2020.
For citation: Byazrova M.G., Astakhova E.A., Spiridonova A.B., Vasileva Yu.V., Prilipov A.G., Filatov A.V. IL-21/ CD40L stimulation of human B-lymphocytes in vitro and their characteristics. Immunologiya. 2020; 41 (6): 501-10. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-6-501-510. (in Russian)
Funding. The study was supported by the grant of Russian Science Foundation No 19-15-00331.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Введение
Трудно переоценить роль, которую культуры клеток и клеточных линий сыграли в изучении физиологии человека и млекопитающих. Это утверждение в полной мере относится к вкладу, который клеточные линий внесли в исследования В-лимфоцитов. Наиболее очевидным примером из этой области является использование так называемых плазмацитом MOPC (mineral oil-induced plasmacytomas) [1]. С их помощью были получены первые препараты моноклональных иммуноглобулинов, изучена структура и некоторые функции этих молекул. С помощью MOPC расшифрованы механизмы перестройки генов Ig. Наконец, гибридомная технология стала возможна благодаря использованию одного из вариантов MOPC [2]. К сожалению, эффективного партнера для слияния с В-клетками человека так и не найдено, несмотря на значительные усилия, затраченные в этом направлении. Полезными моделями В-клеток человека являются также многочисленные линии клеток, полученные из лимфом Беркитта и ходжкинских лимфом. Однако подобные линии клеток образуются спонтанно и их нельзя получать контролируемым образом из заранее определенных популяций клеток. В этом отношении выгодно отличаются линии клеток, получаемые путем иммортализа-ции с помощью вируса Эпштейна-Барр [3, 4]. Однако В-клетки, трансформированные этим вирусом, характеризуются ограниченным потенциалом роста, низкой эффективностью клонирования и невысоким уровнем продукции Ig, который быстро падает при культивировании [5-8].
Идеальным решением могла бы стать разработка метода получения клонов В-клеток, подобного тому, который существует для Т-лимфоцитов [9]. Периодическая рестимуляция Т-клеток дает возможность клонировать Т-лимфоциты и наращивать Т-клетки практически в неограниченных количествах. Полученные таким образом клоны Т-лимфоцитов с успехом используются не только в научных исследованиях, но также для иммунотерапии опухолей [10]. Однако этот подход сталкивается с многочисленными трудностями. Это связано с тем, что для стимуляции и пролиферации В-лимфоцитов требуется более широкий спектр стимулов. С переменным успехом для стимуляции роста В-лимфоцитов использовали самые разнообразные активаторы, начиная от различных интерлейкинов (ИЛ) (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10) и заканчивая лиган-
дами Toll-подобных рецепторов - TLR7/8 (R848) или TLR9 (CpG), а также золотистым стафилококком или антителами против Ig [11-13].
Наиболее привлекательной системой для активации В-лимфоцитов представляется комбинация ИЛ-21 и ли-ганда рецептора CD40, поскольку именно эти стимулы принимают участие в активации В-клеток при иммунном ответе, который развивается в зародышевых центрах лимфоузлов [12]. В качестве агонистов молекулы CD40 использовались антитела против этого рецептора, а также растворимые формы его натурального лиганда CD40L [14]. Основной проблемой при таком подходе являлась необходимость гексамеризации растворимых форм агонистов CD40. Это условие в наиболее полной мере достигается, когда CD40L находится на поверхности фидерной клетки, с которой взаимодействует В-лимфоцит.
Целями данного исследования являлись получение фидерных клеток, несущих поверхностный CD40L, отработка протокола стимуляции В-лимфоцитов человека in vitro с помощью ИЛ-21/CD40L, а также характеристика стимулированных В-лимфоцитов.
Материал и методы
Выделение лимфоцитов. В исследовании приняли участие 10 здоровых добровольцев в возрасте от 25 до 42 лет. Все добровольцы дали информированное согласие на проведение исследования. Периферическую венозную кровь собирали в гепаринизированные вакуумные пробирки. Мононуклеарные клетки крови выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (р = 1,077 г/см3). Эритроциты ли-зировали с помощью раствора FACS Lysis buffer (BD, США). В-лимфоциты выделяли из фракции мононукле-арных клеток путем отрицательной селекции с использованием набора для магнитной сортировки Dynabeads Untouched human B-cell kit (Thermo Fisher Scientific, США). Чистота выделенных В-лимфоцитов составляла не менее 98 %.
Получение фидерных клеток, стабильно экс-прессирующих CD40L. Фидерные клетки получали путем лентивирусной трансдукции [15]. Для получения лентивируса клетки HEK293T сеяли по 0,7 млн в лунку 6-луночного планшета за день до проведения трансфекции. На следующий день упаковочные плаз-миды pCMV-VSV-G (0,45 мкг), pCMV-A8.2R (1,45 мкг), а также трансферную плазмиду EX-G0117-Lv105
(2,2 мкг), кодирующую CD40L, разводили стерильной водой до 112,5 мкл. К полученному раствору плазмид добавляли 12,5 мкл 2,5 мМ CaCl2 и 125 мкл раствора, содержавшего 50 мМ HEPES, 1,5 мМ Na2HPO4, 280 мМ NaCl, 10 мМ KCl и 12 мМ сахарозы. Полученную смесь общим объемом 250 мкл распределяли по поверхности лунки, перемешивая содержимое несколькими орбитальными движениями. Через 5-8 ч среду меняли на свежую.
Через 2 дня после трансфекции супернатант культуры клеток HEK293T собирали, фильтровали через 0,45 мкм фильтр и центрифугировали при 30 000 g 2 ч 30 мин при температуре 4 °C. Осадок суспендировали в 200 мкл среды, делали несколько последовательных разведений с 2-кратным шагом и добавляли к клеткам HEK293T, K562 или A549 для трансдукции. За 1 день до трансдукции клетки-мишени высевали в объеме 250 мкл в лунки 24-луночного планшета по 0,1 млн/ лунку. Трансдуценты отбирали культивированием в селективной среде, содержавшей 10 мкг пуромицина.
Стимуляция лимфоцитов in vitro. Фидерные клетки в течении 2,5 часов обрабатывали 10 мкг/мл митомицина-С («Kyowa Hakko Kogyo Co.», Япония), после чего клетки 4 раза отмывали в среде DMEM и сеяли по 10 000 клеток на лунку в 96-луночный планшет. Выделенные В-лимфоциты добавляли в лунки с фидерными клетками по 10 000 клеток на лунку. В-лимфоциты культивировали в среде DMEM с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки, 24 мкг/мл гентамицина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES (все «ПанЭко», Россия) и 25 нг/ мл ИЛ-21 (Peprotech, США) при 37 °C в 5 % CO2. При рестимуляции лимфоциты собирали, подсчитывали концентрацию и высевали на новые лунки со свежими фидерными клетками и свежей порцией ИЛ-21.
Проточная цитометрия. Эксперименты по проточной цитометрии проводили на свежевыделенных В-лимфоцитах или B-клетках после стимуляции in vitro в системе ИЛ-21/CD40L с использованием проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США), оснащенного двумя диодными лазерами - 488 нм и 561 нм. Для окрашивания лимфоцитов использовали следующие антитела: CD19-PE (клон LT19), CD27-PECy5.5 (клон LT27), CD38-PECy7 (клон LT38), против человеческого IgG-FITC (клон CH1) и IgM-FITC (клон MA2). Указанные антитела были получены в нашей лаборатории [16, 17] и коньюгированы с соответствующими красителями по ранее описанному методу [18,19]. Для определения экспрессии маркера CD40L использовали антитело CD154 (клон 24-31, Exbio, Чехия). Окрашивание производили в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего клетки 2 раза отмывали в физиологическом растворе забуференном фосфатами. Перед измерением клеточную суспензию пропускали через ситечко с диаметром пор 40 мкм. Цитофлуориметри-ческие данные обрабатывали при помощи программы FlowJo (США).
Определение Ig методом иммуноферментного анализа (ИФА). Антитела против человеческого IgG
(клон 2A11) и IgM (клон CH2) в концентрации 10 мкг/мл сорбировали в лунках 96-луночных планшетов (Greiner, ФРГ), внося в лунку по 100 мкл раствора антител в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ). Планшеты инкубировали ночь при 4 °С, после чего трижды отмывали буфером PBS/Tween20. Лунки блокировали добавлением ФСБ, содержавшего 1 % бычьего сывороточного Ig, инкубировали в течение часа и 3 раза отмывали c помощью ФСБ с добавлением 0,1 % Твин 20 (ФСБ-Т). Тестируемые препараты разводили буфером для разведения антител, вносили в лунки планшета по 100 мкл и инкубировали в течение 1 ч. После инкубации лунки планшета отмывали три раза буфером ФСБ-Т. Для детекции IgM и IgG использовали вторичные антитела анти-IgG мыши, конъюгированные с пер-оксидазой хрена (клоны MA2 и СШ соответственно). После инкубации в течении 1 ч лунки промывали 3 раза с помощью ФСБ-Т, добавляли в лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина («Хема Медика», Россия), и инкубировали при комнатной температуре до появления окраски. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл серной кислоты. Реакцию учитывали с помощью фотометра BioRad iMark Microplate Absorbance Reader (США), данные анализировали с помощью программы Zemfira 4.0 (США).
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (версия 8.4.3 GraphPad Software, США). Значимость различий между выборками оценивали с помощью одномерного критерия Краскела-Уоллиса. Различия сравниваемых параметров считались статистически значимыми при p < 0,05. Данные на гистограммах показывают среднее значение и стандартную ошибку среднего.
Результаты
Получение фидерной линии, экспрессирующей поверхностный CD40L
В клетки HEK293, K562 и A549 с помощью ленти-вирусного вектора вводили ген CD40L. После селекции в среде с пуромицином трансдуцированные клетки демонстрировали высокий уровень экспрессии поверхностного CD40L. По данным проточной цитометрии его экспрессировали более 80 % клеток A549 (рис. 1). Исходя из ростовых свойств, а также способности ад-гезироваться на пластик мы выбрали линию A549, стабильно трансфецированную CD40L, которая получила название A549.40L и была использована во всех дальнейших экспериментах.
Пролиферация В-лимфоцитов при ИЛ-21/CD40L-стимуляции in vitro
Используя иммуномагнитную сепарацию из популяции мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров выделяли В-лимфоциты и рассе-вали их в лунки 96-луночного планшета по 10 000 клеток на лунку. В опытные лунки предварительно сеяли фидерные клетки A549.40L по 10 000 клеток на лунку, которые для предотвращения собственной пролифера-
ции были предварительно обработаны митомицином. В опытные лунки добавляли ИЛ-21 до концентрации 25 нг/мл. В контрольных лунках, которые не содержали ни фидерных клеток, ни ИЛ-21, лимфоциты не росли и погибали к 3-му дню культивирования. Обработанные митомицином фидерные клетки также погибали в течение 3-4 дней. В опытных лунках отчетливо наблюдался активный рост В-лимфоцитов. Для того чтобы оценить пролиферативный потенциал В-лимфоцитов, на 4, 8 и 12-й день делали рестимуляцию. Для этого 10 000 стимулированных лимфоцитов вносили в новые лунки 96-луночного планшета. Лунки для рестимуляции содержали свежепосеянные фидерные клетки (10 000 клеток на лунку) и ИЛ-21 (25 нг/мл). Динамика роста В-лимфоцитов для одного из доноров приведена на рис. 2А. К 4-му дню стимуляции количество В-лимфоцитов увеличивалось примерно в 2 раза. Максимальный рост В-лимфоцитов отмечался на 8-й день стимуляции, когда после пересева к 8-му дню количество В-лимфоцитов увеличивалось примерно в 4-5 раз. При рестимуляции на 12-й день В-клетки практически переставали делиться и примерно к 15-му дню В-лимфоциты погибали (см. рис. 2А). Используя эту схему, было проведено 9 независимых экспериментов по стимуляции В-лимфоцитов от разных доноров, которые подтвердили обнаруженные закономерности роста при ИЛ-21/СБ40Ь-стимуляции (рис. 2Б).
Изменение фенотипа В-лимфоцитов при ИЛ-21/ CD40L-стимуляции in vitro
При ИЛ-21/СБ40Ь-стимуляции изменялась морфология В-лимфоцитов. Если до стимуляции они имели шарообразную форму, то после стимуляции они приобретали неправильную форму с псевдоподиями, группировались вокруг фидерных клеток A549.40L и начинали активно передвигаться (рис. 3).
э
1 \ 99 %
J
□ CD40L
С Негативный контроль
СБ40Ь
Рис. 1. Экспрессия СБ40Ь на трансдуцированных клетках Клетки К562 (А), А549 (Б) и НЕК293Т (В) окрашивали антителом против СБ40Ь, а затем вторичными антителами против ^ мыши мечеными ¥!ТС. В негативном контроле клетки окрашивали только вторичными антителами.
В процессе стимуляции ИЛ-21/СБ40Ь В-лимфоциты изменяли свой поверхностный фенотип. Свежевыделен-ные или стимулированные В-лимфоциты окрашивали следующими комбинациями антител: СБ19-РЕ/ап11-
100 000 -,
о 80 000 -
s
я
60 000 -
s 40 000 -
¡2 20 000 -
Hn-21/CD40L Без стимуляции ^ Рестимуляции
4 5
8 10 Сутки
15
20
s
я
80 000 -
60 000 -
40 000 -
20 000 -
¥
• •
0 4 7 10
Сутки
Рис. 2. Увеличение количества лимфоцитов при стимуляции с помощью KH-21/CD40L
А - динамика роста В-лимфоцитов в одном эксперименте при рестимуляции на 4, 8 и 12-й дни; Б - результаты 9 независимых экспериментов при рестимуляции на 4-й и 7-й дни. Здесь и на рис. 4-7 приведены средние значения ± стандарные отклонения. Звездочки показывают значимую разницу между группами, которую определяли с помощью одномерного критерия Краскела-Уоллиса; *-p < 0,03; **** - p < 0,0001; ns - недостоверное отличие.
ns
0
0
Рис. 3. Микроскопия В-лимфоцитов А549.40Ь, стимулированных in vitro с помощью Rn-21/CD40L
Представлены два репрезентативных поля. Изображения получены с помощью инвертированного микроскопа Olympus 1X71, объектив 60х.
^С-ИТС/СВ27-РС5.5/СБ38-РС7, СБ19-РЕ/апЦ-^М-ИТС/ СБ27-РС5.5/СБ38-РС7, СБ19-РЕ/СВ20-ИТС/СВ27-РС5.5/ СБ38-РС7. На 4-й день стимуляции появлялась субпопуляция СВ27+СБ38+-В-лимфоцитов и процент этих клеток продолжал расти в ходе стимуляции, достигая максимума на 10-й день (рис. 4). По своему фенотипу эти клетки соответствовали плазмабластам и плазматическим клеткам [20].
Кроме того, СБ27+СБ38+-В-лимфоциты либо утрачивали экспрессию СБ20, либо экспрессировали его на низком уровне по сравнению с нестимулированными В-лимфоцитами (рис. 5).
В ходе эксперимента наблюдалось снижение доли клеток, несущих поверхностный или но в то
же время увеличивался процент лимфоцитов с внутриклеточным окрашиванием IgG, что косвенно может свидетельствовать о секреции IgG (рис. 6).
Секреция IgM и IgG в культурах В-лимфоцитов при ИЛ-21/СБ40Ь-стимуляции in vitro
Чтобы подтвердить предположение о том, что ИЛ-21/ CD40L-стимуляция индуцирует секрецию Ig, супернатанты В-клеточных культур на 4, 7 и 10-й дни были тестированы методом иммуноферментного анализа на наличие IgM и IgG. При стимуляции уровень иммуноглобулинов IgM и IgG возрастал по сравнению с культурой В-лимфоцитов без ИЛ-21/CD40L-стимуляции (рис. 7). Секреция IgM находилась на более высоком уровне, чем секреция IgG.
Q
О
80 -
60 -
40 -
20 -
CD27+CD38+ **
20
CD19+CD20+CD27+CD38+ **
100 -| • • -в- •
80 - Г1 т
60 -
а о •
о? 40 -
10
Сутки
Рис. 4. Увеличение процента плазмабластов и плазматических клеток при ИЛ-21/СБ40Ь-стимуляции В-лимфоцитов
Свежевыделенные или симулированные В-лимфоциты окрашивали антителами СБ19-РЕ, СБ27-РС5.5 и СБ38-РС7 и анализировали на проточном цитометре. Указан процент С027+СВ38+-клеток относительно всех В-лимфоцитов. ** - р < 0,002.
Рис. 5. Снижение процента В-клеток, экспрессирующих поверхностный СБ20, при ИЛ-21/СБ40Ь-стимуляции В-лимфоцитов
Свежевыделенные или симулированные В-лимфоциты окрашивали антителами СВ20-Е1ТС, СБ19-РЕ, СБ27-РС5.5 и СБ38-РС7 и процент С020+СВ27+СВ38+-В-лимфоцитов определяли с помощью проточной цитометрии.
0
0
э
CD19+IgM+
80 -,
О
о 60 H
Q
О
40-
20
é
47
Сутки
ï
10
Э
80
Q
Ö 60
Q
U
40 -
20
CD19+IgG+
i : - .
47
Сутки
10
Рис. 6. Снижение процента В-клеток, экспрессирующих поверхностный IgM и IgG, при ИЛ-21/CD40L-стимуляции В-лимфоцитов Свежевыделенные или стимулированные В-лимфоциты окрашивали антителами CD19-PE, анти-IgM-FITC (А) или CD19-PE, анти-IgG-FITC (Б) и процент позитивных клеток определяли с помощью проточной цитометрии.
0
0
Обсуждение
Нами были получены 3 линии фидерных клеток, которые стабильно трансфецированы геном CD40L. Все полученные клетки обладали высокой экспрессией поверхностного CD40L. Клетки К562 являются суспензионными, а клетки HEK293T слабо адгезируются к культуральному пластику. Это создает некоторые неудобства при пересеве и рестимуляции В-лимфоцитов. В отличие от этого клетки А549 хорошо адгезируются, поэтому при пересеве В-лимфоцитов они оставались в исходной лунке. С использованием фидерных клеток A549.40L в сочетании с экзогенным рекомбинант-ным ИЛ-21 нами был отработан протокол стимуляции В-лимфоцитов, выделенных из периферической крови человека. Использованная система стимуляции обеспечивала устойчивый рост В-лимфоцитов в течение пер-
Э
IgM *
30 000 -| 20 000 -10 000 -
-
s
™ 4000 -
О
2000-
Без 4 7
стимуляции _
Сутки
10
вых 8 дней культивирования in vitro. За это время количество В-лимфоцитов в среднем увеличивалось в 8 раз. Это соответствует одному клеточному делению примерно 1 раз в каждые 2,3 дня. ИЛ-21/CD40L-стимуляция вызывала изменение морфологии В-лимфоцитов и их поверхностного фенотипа. Заметное количество клеток приобретало фенотип плазмабластов, который характеризовался совместной экспрессией маркеров CD27 и CD38 при снижении экспрессии маркера CD20. Стимулированные В-лимфоциты начинали секретировать заметные количества IgG и IgM.
Таким образом, в результате HT-21/CD40L-стимуляции образуются активированные В-лимфоциты, которые можно использовать для решения различных задач. Стимулированные В-лимфоциты в отличие от наивных В-клеток, а также от покоящихся В-клеток
Э
IgG
**
о
1500 п
1000 -
500 -
Без 4 7
стимуляции
Сутки
10
Рис. 7. Секреция IgM и IgG при ИЛ-21/CD40L-стимуляции В-лимфоцитов in vitro
Секрецию IgM (А) и IgG (Б) определяли на 4, 7 и 10-й дни культивирования В-лимфоцитов. В качестве отрицательного контроля использовали супернатанты, полученные на 4-й день культивирования от лимфоцитов без ИЛ-21/CD40L-стимуляции.
0
0
памяти, начинают секретировать антитела, что делает возможным определение антиген-специфического ответа. Количество антиген-специфических лимфоцитов можно определять методом ЕЬ18ро1, а уровень секреции ]£ - с помощью иммуноферментного анализа.
При ИЛ-21/СБ40Ь-стимуляции в активированных В-клетках запускается активный синтез антител, который сопровождается повышением уровня мРНК, кодирующей ]£. Это в значительной мере упрощает амплификацию и последующее секвенирование генов ]£ из единичных В-клеток. Таким образом, ИЛ-21/ СБ40Ь-стимулированные лимфоциты являются удобным объектом для определения полных последовательностей ДНК сопряженных легких и тяжелых цепей ]£ и для создания на их основе новых человеческих моно-клональных антител.
При ИЛ-21/СБ40Ь-стимуляции пролиферативный потенциал В-клеток к 12-му дню исчерпывался и клетки погибали в результате апоптоза. Этот предел можно преодолеть путем репрограммирования В-клеток при введении генов транскрипционных факторов БСЬб и БСЬ-ХЬ [21, 22]. Фактор БСЬб удерживает В-клетки на стадии плазмабластов, а фактор БСЬ-ХЬ препятствует вхождению их в апоптоз. С помощью репро-граммирования В-клеток были получены иммортализо-ванные клоны В-лимфоцитов, которые секретировали человеческие моноклональные антитела против воз-
будителя столбняка и вируса гриппа, а также респира-торно-синцитиального вируса и парэховируса [23]. Отработанную нами процедуру ИЛ-21/CD40L-стимуляции В-клеток можно рассматривать как необходимый этап в создании иммортализованных клонов В-лимфоцитов.
Отработанный протокол стимуляции В-лимфоцитов был использован нами для определения коронавирус-специфических В-клеток памяти, образующихся во время острой фазы SARS-CoV-2-инфекции [24], а также для оценки уровня вирус-нейтрализующих антител, которые секретировали активированные В-клетки памяти.
Заключение
Таким образом, нами были получены фидерные клетки, экспрессирующие молекулу CD40L, и отработан протокол стимуляции В-лимфоцитов in vitro в присутствии экзогенного ИЛ-21 и фидерных клеток. Протокол обеспечивал получение активированных В-лимфоцитов, которые могут использоваться в других приложениях.
Вклад авторов
Сбор и обработка материала - Бязрова М.Г., Спиридонова А.Б., Астахова Е.А., Васильева Ю.В.; написание текста, редактирование - Бязрова М.Г., Прилипов А.Г., Филатов А.В.; окончательный вариант и целостность текста - Филатов А. В.
■ Литература
1. Gearhart P.J., Mock B.A., Casellas R., Cancro M.P. The reign of antibodies: A celebration of and tribute to Michael Potter and his homogeneous immunoglobulin workshops. J. Immunol. 2018; 200: 23-6. DOI: https://www.doi.org/10.4049/jimmunol.1701516.
2. Köhler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975; 256: 495-7. DOI: https://www.doi.org/10.1038/256495a0.
3. Küppers R. B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus. Nat. Rev. Immunol. 2003; 3: 801-2. DOI: https://www.doi.org/10.1038/nri1201.
4. Nilsson K. Human B-lymphoid cell lines. Hum. Cell. 1992; 5: 25-41. PMID: 1329931.
5. Crain M.J., Sanders S.K., Butler J.L., Cooper M.D. Epstein-Barr virus preferentially induces proliferation of primed B cells. J. Immunol. 1989; 143: 1543-8. PMID: 2547870.
6. Laffly E., Sodoyer R. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. Hum. Antibodies. 2005; 14: 33-55. PMID: 16424599.
7. O'Nions J., Allday M.J. Proliferation and differentiation in isogenic populations of peripheral B cells activated by Epstein-Barr virus or T cell-derived mitogens. J. Gen. Virol. 2004; 85: 881-95. DOI: https://www.doi.org/10.1099/vir.0.19704-0.
8. Steinitz M. Production of human monoclonal antibodies by the Epstein-Barr virus method. In: Steinitz M (ed). Methods Mol. Biol. Humana Press: Totowa, N.J. 2014; 1060: 111-22. DOI: https://www. doi.org/10.1007/978-1-62703-586-6_6.
9. Mossalayi M.D., Lecron J.C., Tanzer J., Goube de Laforest P. Relationship between IL-2 and human T cell colony formation. Clin. Exp. Immunol. 1986; 66: 532-8. PMID: 3494553.
10. Rohaan M.W., van den Berg J.H., Kvistborg P., Ha-anen J.B.A.G. Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma: a viable treatment option. J. Immunother. Cancer. 2018; 6: 102. DOI: https://www.doi.org/10.1186/s40425-018-0391-1.
11. Auladell M., Nguyen T.H., Garcillân B., Mackay F., Kedzier-ska K., Fox A. Distinguishing naïve-from memory-derived human B cells during acute responses. Clin. Transl. Immunol. 2019; 8. DOI: https://www.doi.org/10.1002/cti2.1090.
12. Banchereau J., Bazan F., Blanchard D., Brie F., Galizzi J.P., van Kooten C., Liu Y.J., Rousset F., Saeland S. The CD40 antigen and its ligand. Annu. Rev. Immunol. 1994; 12: 881-926. DOI: https:// www.doi.org/10.1146/annurev.iy. 12.040194.004313.
13. Huggins J., Pellegrin T., Felgar R.E., Wei C., Brown M., Zheng B., Milner E.C.B., Bernstein S.H., Sanz I., Zand M.S. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naive human B cells. Blood. 2007; 109: 1611-9. DOI: https://www.doi.org/10.1182/ blood-2006-03-008441.
14. Wiesner M., Zentz C., Mayr C.,Wimmer R., HammerschmidtW., Zeidler R., Moosmann A. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 2008; 3: e1464. DOI: https://www. doi.org/10.1371/journal.pone.0001464.
15. Филатов А.В., Лаврова О.И., Мазуров Д.В., Шевалье А.Ф. Экспрессия лимфоцитарного фосфатазо-ассоциированного белка на лимфоидных линиях человека. Иммунология. 2011; 32 (1): 30-4.
16. Filatov A.V., Krotov G.I., Zgoda V.G., Volkov Y. Fluorescent immunoprecipitation analysis of cell surface proteins: A methodology compatible with mass-spectrometry. J. Immunol. Meth. 2007; 319: 21-33. DOI: https://www.doi.org/10.1016/jjim.2006.09.014.
17. KhvastunovaA.N., Kuznetsova S.A.,Al-Radi L.S., Vylegzhani-na A.V., Zakirova A.O., Fedyanina O.S., Filatov A.V., Vorobjev I.A., Ataullakhanov F. Anti-CD antibody microarray for human leukocyte morphology examination allows analyzing rare cell populations and suggesting preliminary diagnosis in leukemia. Sci. Rep. 2015; 5: 12573. DOI: https://www.doi.org/10.1038/srep12573.
18. Berg E.A., Fishman J.B. Labeling antibodies with Cy5-phy-coerythrin. Cold Spring Harb. Protoc. 2019; pdb.prot099317. DOI: https://www.doi.org/10.1101/pdb.prot099317.
19. Vira S., Mekhedov E., Humphrey G., Blank P.S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal. Biochem. 2010; 402: 146-50. DOI: https://www.doi. org/10.1016/j.ab.2010.03.036.
20. Лушова А.А., Жеремян Э.А., Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Бязрова М.Г., Филатов А.В. Субпопуляции В-лимфоцитов:
функции и молекулярные маркеры Иммунология. 2019; 40 (6): 63-76. DOI: https://www.doi.org/10.24411/0206-4952-2019-16009.
21. Kwakkenbos M.J., Bakker A.Q., van Helden P.M., Wagner K., Yasuda E., Spits H., Beaumont T. Genetic manipulation of B cells for the isolation of rare therapeutic antibodies from the human repertoire. Methods. 2014; 65: 38-43. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j. ymeth.2013.07.002.
22. Kwakkenbos M.J., Diehl S.A., Yasuda E., Bakker A.Q., van Geelen C.M.M., Lukens M.V. van Bleek G.M., Widjojoatmodjo M.N., Bogers W.M.J.M., Mei H., Radbruch A., Scheeren F.A., Spits H., Beaumont T. Generation of stable monoclonal antibody-producing
B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat. Med. 2010; 16: 123-8. DOI: https://www.doi.org/10.1038/ nm.2071.
23. Kwakkenbos M.J., Helden P.M., Beaumont T., Spits H. Stable long-term cultures of self-renewing B cells and their applications. Immunol. Rev. 2016; 270: 65-77. DOI: https://www.doi.org/10.1111/ imr.12395.
24. Болдырева М.Н. Вирус SARS-CoV-2 и другие эпидемические коронавирусы: патогенетические и генетические факторы развития инфекций. Иммунология. 2020; 41 (3): 197-205. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-3-197-205.
■ References
1. Gearhart P.J., Mock B.A., Casellas R., Cancro M.P. The reign of antibodies: A celebration of and tribute to Michael Potter and his homogeneous immunoglobulin workshops. J. Immunol. 2018; 200: 23-6. DOI: https://www.doi.org/10.4049/jimmunol.1701516.
2. Köhler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975; 256: 495-7. DOI: https://www.doi.org/10.1038/256495a0.
3. Küppers R. B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus. Nat. Rev. Immunol. 2003; 3: 801-2. DOI: https://www.doi.org/10.1038/nri1201.
4. Nilsson K. Human B-lymphoid cell lines. Hum. Cell. 1992; 5: 25-41. PMID: 1329931.
5. Crain M.J., Sanders S.K., Butler J.L., Cooper M.D. Epstein-Barr virus preferentially induces proliferation of primed B cells. J. Immunol. 1989; 143: 1543-8. PMID: 2547870.
6. Laffly E., Sodoyer R. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. Hum. Antibodies. 2005; 14: 33-55. PMID: 16424599.
7. O'Nions J., Allday M.J. Proliferation and differentiation in isogenic populations of peripheral B cells activated by Epstein-Barr virus or T cell-derived mitogens. J. Gen. Virol. 2004; 85: 881-95. DOI: https://www.doi.org/10.1099/vir0.19704-0.
8. Steinitz M. Production of human monoclonal antibodies by the Epstein-Barr virus method. In: Steinitz M. (ed). Methods Mol. Biol. Humana Press: Totowa, N.J. 2014; 1060: 111-22. DOI: https://www. doi.org/10.1007/978-1-62703-586-6_6.
9. Mossalayi M.D., Lecron J.C., Tanzer J., Goube de Laforest P. Relationship between IL-2 and human T cell colony formation. Clin. Exp. Immunol. 1986; 66: 532-8. PMID: 3494553.
10. Rohaan M.W., van den Berg J.H., Kvistborg P., Ha-anen J.B.A.G. Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma: a viable treatment option. J. Immunother. Cancer. 2018; 6: 102. DOI: https://www.doi.org/10.1186/s40425-018-0391-1.
11. Auladell M., Nguyen T.H., Garcillân B., Mackay F., Kedzier-ska K., Fox A. Distinguishing naïve-from memory-derived human B cells during acute responses. Clin. Transl. Immunol. 2019; 8. DOI: https://www.doi.org/10.1002/cti2.1090.
12. Banchereau J., Bazan F., Blanchard D., Briè F., Galizzi J.P., van Kooten C., Liu Y.J., Rousset F., Saeland S. The CD40 antigen and its ligand. Annu. Rev. Immunol. 1994; 12: 881-926. DOI: https:// www.doi.org/10.1146/annurev.iy.12.040194.004313.
13. Huggins J., Pellegrin T., Felgar R.E., Wei C., Brown M., Zheng B., Milner E.C.B., Bernstein S.H., Sanz I., Zand M.S. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naive human B cells. Blood. 2007; 109: 1611-9. DOI: https://www.doi.org/10.1182/ blood-2006-03-008441.
14. Wiesner M., Zentz C., Mayr C.,Wimmer R., HammerschmidtW., Zeidler R., Moosmann A. Conditional immortalization of human B
cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 2008; 3: e1464. DOI: https://www. doi.org/10.1371/journal.pone.0001464.
15. Filatov A.V., Lavrova O.I., Mazurov D.V., Chevalier A.F. Expression of Lymphocyte Phosphatase-Associated Protein on human lymphoid lines. Immunologiya. 2011; 32 (1): 30-4. (in Russian)
16. Filatov A.V., Krotov G.I., Zgoda V.G., Volkov Y. Fluorescent immunoprecipitation analysis of cell surface proteins: A methodology compatible with mass-spectrometry. J. Immunol. Meth. 2007; 319: 21-33. DOI: https://www.doi.org/10.1016/jjim.2006.09.014.
17. KhvastunovaA.N., Kuznetsova S.A.,Al-Radi L.S., Vylegzhani-na A.V., Zakirova A.O., Fedyanina O.S., Filatov A.V., Vorobjev I.A., Ataullakhanov F. Anti-CD antibody microarray for human leukocyte morphology examination allows analyzing rare cell populations and suggesting preliminary diagnosis in leukemia. Sci. Rep. 2015; 5: 12573. DOI: https://www.doi.org/10.1038/srep12573.
18. Berg E.A., Fishman J.B. Labeling antibodies with Cy5-phy-coerythrin. Cold Spring Harb. Protoc. 2019; pdb.prot099317. DOI: https://www.doi.org/10.1101/pdb.prot099317.
19. Vira S., Mekhedov E., Humphrey G., Blank P.S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal. Biochem. 2010; 402: 146-50. DOI: https://www.doi. org/10.1016/j.ab.2010.03.036.
20. Lushova A.A., Zheremyan E.A., Astakhova E.A., Spiridono-va A.B., Byazrova M.G., Filatov A.V. B-lymphocyte subsets: functions and molecular markers. Immunologiya. 2019; 40 (6): 63-76. DOI: https://www.doi.org/10.24411/0206-4952-2019-16009. (in Russian)
21. Kwakkenbos M.J., Bakker A.Q., van Helden P.M., Wagner K., Yasuda E., Spits H., Beaumont T. Genetic manipulation of B cells for the isolation of rare therapeutic antibodies from the human repertoire. Methods. 2014; 65: 38-43. DOI: https://www.doi.org/10.1016Zj. ymeth.2013.07.002.
22. Kwakkenbos M.J., Diehl S.A., Yasuda E., Bakker A.Q., van Geelen C.M.M., Lukens M.V. van Bleek G.M., Widjojoatmodjo M.N., Bogers W.M.J.M., Mei H., Radbruch A., Scheeren F.A., Spits H., Beaumont T. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat. Med. 2010; 16: 123-8. DOI: https://www.doi.org/10.1038/ nm.2071.
23. Kwakkenbos M.J., Helden P.M., Beaumont T., Spits H. Stable long-term cultures of self-renewing B cells and their applications. Immunol. Rev. 2016; 270: 65-77. DOI: https://www.doi.org/10.1111/ imr.12395.
24. Boldyreva M.N. SARS-CoV-2 virus and other epidemic coronaviruses: pathogenetic and genetic factors for the development of infections. Immunologiya. 2020; 41 (3): 197-205. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-3-197-205. (in Russian)
Сведения об авторах
Бязрова Мария Георгиевна - м.н.с. лаборатории иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация; e-mail: mbyazrova@list.ru, https://or-cid.org/0000-0002-9858-7596
Астахова Екатерина Андреевна - лаборант лаборатории иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация; e-mail: ast_kat@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-4737-5892
Authors' information
Maria G. Byazrova - Junior Researcher at the Laboratory of Immunochemistry, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation; e-mail: mbyazrova@list.ru, https:// orcid.org/0000-0002-9858-7596
Ekaterina A. Astakhova - Technician at the Laboratory of Im-munochemistry, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation; e-mail: ast_kat@mail.ru, https://orcid. org/0000-0002-4737-5892
Спиридонова Анна Борисовна - интерн ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация; e-mail: anyuta.spiridonowa@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0003-4229-3377
Васильева Юлия Владимировна - м.н.с. лаборатории иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация; e-mail: vasileva.yuv@phystech.edu, https://orcid.org/0000-0001-5192-3073
Прилипов Алексей Геннадьевич - д.б.н., зав. лабораторией молекулярной генетики ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация; e-mail: a_prilipov@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-8755-1419
Филатов Александр Васильевич - д.б.н., проф., зав. лабораторией иммунохимии ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация; e-mail: avfilat@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
Anna B. Spiridonova - Intern, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation; e-mail: anyuta.spiridonowa@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0003-4229-3377
Yuliya V. Vasileva - Junior Researcher at the Laboratory of Im-munochemistry, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation; e-mail: vasileva.yuv@phystech.edu, https:// orcid.org/0000-0001-5192-3073
Alexei G. Prilipov - Dr.Sci., Head of the Molecular Genetics Laboratory, N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation; e-mail: a_prilipov@mail.ru, https://orcid. org/0000-0001-8755-1419
Alexander V. Filatov - Dr.Sci., Prof., Head of the Laboratory of Immunochemistry, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation; e-mail: avfilat@yandex.ru, https://orcid. org/0000-0002-6460-9427
