CC BY
88
8. Уткин К.В., Кофиади И.А. и др. Установление генетических маркеров устойчивости и чувствительности человека к радиационному воздействию. Иммунология. 2013; 34(2): 80-4.
Поступила 29.09.15
referernces
1. Lederman M. The early history of radiotherapy: 1895-1939. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 1981; 7(5): 639-48.
2. Cardis E., Gilbert E.S. et al. Effects of low doses and low dose rates of external ionizing radiation: cancer mortality among nuclear industry workers in three countries. Radiat Res. 1995; 142(2): 117-32.
3. Omar R.Z., Barber J.A., Smith P.G. Cancer mortality and morbidity among plutonium workers at the Sellafield plant of British Nuclear Fuels. Br. J. Cancer. 1999; 79(7-8): 1288-301.
4. Travis L.B., Fossa S.D. et al. Second cancers among 40,576 testicular cancer patients: focus on long-term survivors. J. Natl. Cancer Inst. 2005; 97(18): 1354-65.
5. Luckey T.D. Physiological benefits from low levels of ionizing radiation. Hlth Phys. 1982; 43(6): 771-89.
6. Akleev A. V. Chronic Radiation Syndrome Among Residents of the Coastal Villages of the Techa River. [Khronicheskiy luchevoy sindrom u zhiteley pribrezhnykh sel reki Techa]. Chelyabinsk: Kniga; 2012. (in Russian)
7. McBride W.H., Chiang C.S. et al. A sense of danger from radiation. Radiat Res. 2004; 162(1): 1-19.
8. Utkin K. V., Kofiadi I. A. et al. Establishment of genetic markers of resistance and sensitivity of a person to radiation. Immunologiya. 2013; 34(2): 80-4. (in Russian)
Received 29.09.15
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 612.017.1.083
Талаев В.Ю., Плеханова М.В., Воронина Е.В., Бабайкина О.Н.
созревание т-фолликулярных хелперов in vitro
ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора, 603950, г Нижний Новгород
Исследовали созревание Т-хелперов человека при стимуляции наивных CD4+ Т-лимфоцитов различными алло-генными антигенпрезентирующими клетками in vitro. Наивные CD4+ Т-клетки и В-лимфоциты выделяли иммуно-магнитной сепарацией, дендритные клетки получали из моноцитов in vitro. Показано, что В-лимфоциты индуцируют преимущественное созревание Т-клеток, фенотипически идентичных Т-фолликулярным хелперам. Эти клетки лишены CCR7, несут на мембране CXCR5, CD40L, 0X40 и обладают высоким уровнем экспрессии ICOS и PD-1. Часть этих клеток содержит ядерный фактор Bcl-6. Стимуляция наивных Т-лимфоцитов дендритными клетками не индуцирует образование типичных Т-фолликулярных хелперов, но стимулирует созревание Т-хелперов с высоким уровнем экспрессии молекул для межклеточной кооперации и различными наборами хемокиновых рецепторов.
Ключевые слова: наивные Т-лимфоциты; Т-хелперы; В-лимфоциты; дендритные клетки; миграция.
Для цитирования: Иммунология. 2015; 36(6): 336-343.
Talayev V.Yu., Plehanova M.V., Voronina E.V., Babaykina O.N. MATURATION OF T FOLLICULAR HELPER CELLS IN VITRO
Federal Budget Institution of Science "Nizhny Novgorod Scientific and Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after Academician I.N. Blokhina", Federal Service on Surveillance for Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor), 603950, Nizhny Novgorod, Russian Federation
Human T helper cell maturation at naïve CD4+ T lymphocytes stimulation with various allogeneic antigen-presenting cells in vitro were studied. Naïve CD4+ T cells and B lymphocytes were isolated using immunomagnetic separation. Dendritic cells were generated from monocytes in vitro. It was shown that B cells induced predominantly the maturation of T lymphocytes phenotypically identical to T follicular helper cells. These cells were CD4+CCR7-CXCR5+CD40L+OX40+PD-1hiIC0Shi. Some of these cells expressed nuclear factor Bcl-6. Naïve CD4+ T lymphocytes stimulation with dendritic cells did not induce the formation of typical T follicular helper cells but stimulated the maturation of T helper cells with high level expression of intercellular cooperation molecules and various sets of chemokine receptors.
Keywords: naïve T cells; T helper cells; B cells; dendritic cells, migration.
citation: Immunologiya.2015; 36(6): 336-343.
Для корреспонденции: Талаев Владимир Юрьевич, talaev@ inbox.ru
For correspondence: Talayev Vladimir Yur'evich, talaev@ inbox.ru
Введение. В середине 1980-х годов Mosmann Т^. с со-авт. разработали концепцию, согласно которой Т-лимфоциты хелперы (Тх) разделены на две конкурирующие субпопуляции - Тх1 и Тх2, отвечающие за развитие клеточных и гуморальных иммунных реакций, соответственно [1]. Дальней-
шие исследования существенно дополнили эту концепцию, и по современным представлениям наивный CD4+ Т-лимфоцит имеет больший выбор путей созревания в различные типы Т-хелперов. Из них наиболее охарактеризованы Тх1 - стимуляторы клеточных иммунных реакций [2-4], Тх17 - стимуляторы нейтрофилов и В-лимфоцитов [4, 5], Т-фолликулярные хелперы (Тфх) - основные стимуляторы гуморального иммунного ответа [6-8], и Тх2, которые стимулируют эози-нофилы, тучные клетки и продукцию IgE, но не являются критически необходимыми для секреции других изотипов иммуноглобулинов [9-11]. Наивные Тх осуществляют выбор пути созревания в зависимости от цитокиновой атмосферы и ко-стимулирующих сигналов, которые они получают от антигенпрезентирующей клетки (АПК) в ходе распознавания клоноспецифического антигена. При созревании Т-хелперы начинают синтезировать определенный набор цитокинов, характерный для конкретной субпопуляции, и экспрессируют мембранные молекулы, необходимые для межклеточной кооперации. В частности, они экспрессируют рецепторы ОХ40 (CD134) и ICOS (CD278), воспринимающие стимулирующий сигнал от АПК (дендритной клетки или В-лимфоцита) [6, 12], молекулу CD40L, которая передает стимулирующий сигнал в дендритную клетку (ДК) или В-лимфоцит [6, 7] и молекулу PD-1 (CD279), которая ограничивает активность зрелых Т-клеток [13, 14]. Кроме того, созревание эффектор-ных Т-клеток ведет к утрате хемокинового рецептора CCR7 и селектина cD62L, необходимых для хоминга в Т-клеточные зоны лимфоидных органов, и вызывает экспрессию молекул, необходимых для миграции в зону выполнения эффекторных функций. Для Тфх такой зоной являются В-клеточные фолликулы лимфоидных органов, миграцию в которые обеспечивает рецептор CXCR5 [6-12]. Соответственно, типичные зрелые Тфх, выделенные из лимфоидных органов человека, имеют фенотип CD4+CD45RO+CCR7-CXCR5+, экспрессируют большое количество ICOS и PD-1, несут ОХ40, CD40L, cD84 и обладают дифференциальной экспрессией ядерных белков, управляющих их созреванием: репрессора транскрипции Bcl-6 и фактора транскрипции c-maf [6, 14]. Тфх критически необходимы для формирования зародышевых центров и стимуляции событий, которые происходят в этих образованиях: переключение изотипов иммуноглобулинов, созревание аффинитета антител, образование В-клеток памяти и долгоживущих плазмоцитов [6-12]. Несмотря на то, что мишенью стимулирующего действия Тфх являются В-лимфоциты, эти же клетки необходимы для полноценного созревания (или дозревания) самих Тфх. Так, искусственно созданный дефицит В-лимфоцитов или отсутствие на них молекул, необходимых для взаимодействия с Т-клетками, угнетает процесс образования Тфх при инфекции [6, 15, 16], а культивирование В-лимфоцитов с CD4+CCR7+CXCR5+ центральными Т-клетками памяти индуцирует у Т-клеток функциональные свойства Тфх [17]. Тем не менее дискуссионным остается вопрос о начальных этапах дифференцировки Тфх, и часть авторов считает, что первые этапы созревания Тфх осуществляются в Т-клеточной зоне лимфоидного органа, где в качестве АПК выступают дендритные клетки, а контакт с В-лимфоцитами необходим лишь для терминального созревания этих клеток [6, 12, 15, 18, 19].
В данной работе исследовали возможности созревания Тх при стимуляции наивных CD4+ Т-лимфоцитов человека различными АПК in vitro. Показано, что стимуляция наивных Т-клеток аллогенными В-лимфоцитами в отсутствие других АПК и дополнительных стимуляторов ведет к образованию зрелых Т-клеток, фенотипически идентичных Тфх. Стимуляция наивных Т-лимфоцитов дендритными клетками вызывает созревание CD45RO+ Тх с высоким уровнем экспрессии молекул ICOS, ОХ40, PD-1 и CD40L и различными наборами хемокиновых рецепторов, но не приводит к образованию Тфх с типичным фенотипом.
Материал и методы. Для исследования созревания Т-хелперов использовали аллогенные смешанные культуры клеток, в которых наивные CD4+ Т-лимфоциты стимулирова-
лись незрелыми ДК (нДК), зрелыми ДК или В-лимфоцитами. Исходным материалом для получения компонентов смешанных культур были мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) взрослых здоровых доноров. Наивные Т-хелперы и В-лимфоциты выделяли с помощью иммуно-магнитной сепарации из неприлипающей к пластику фракции МНПК. Для иммуномагнитной сепарации использовали наборы EasySep® Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit и EasySep® Human В Cell Enrichment Kit (Stemcell technologies, США) в соответствии с инструкциями производителя. Чистоту полученных популяций контролировали с помощью лазерной проточной цитометрии по экспрессии типичных молекул и отсутствию линейных маркеров других групп клеток. Для этого использовали конъюгаты моноклональных антител (МКА) к молекулам CD3, CD4, CD14, HLA-DR (Сорбент, Москва), CD45, CD19, CD16, CD56 (BD Biosciences, США), CD45RA и CD45RO (eBioscience, США). В работе использовали популяции лимфоцитов с чистотой не менее 95%.
Дендритные клетки получали, как описано ранее [20], из моноцитов (прилипающей фракции МНПК), культивируя их в среде RPMI-1640 (Gibco, Paisley, Великобритания) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) (PAA Laboratories, Австрия), 20 нг/мл интерлейкина-4 (ИЛ-4) (R&D, США) и 100 нг/мл гранулоцитарно-макрофагального колониести-мулирующего фактора (ГМ-КСФ) (R&D, США). ИЛ-4 и ГМ-КСФ повторно добавляли в культуры в той же концентрации на 3 день культивирования. На 7 день, полученные из моноцитов нДК засевали в свежую RPMI-1640 с 10% ЭТС. Для получения зрелых ДК в культуры добавляли 25 нг/мл ИЛ-ф, 25 нг/мл ИЛ-6, 50 нг/мл фактора некроза опухоли-a и 1 мкг/мл простагландина E2 и культивировали клетки 2 суток. Качество полученных ДК оценивали лазерной проточной ци-тометрией с использованием МКА к молекулам HLA-DR, CD14 (Сорбент, Москва), CD80, CD83 и CD86 (eBioscience, США).
При засеве смешанных культур использовали соотношение Т-лимфоцитов и ДК, равное 5:1, а Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов - 1:5. Смешанные культуры выращивали в круглодонных 96-луночных планшетах в среде RPMI 1640 c 10% ЭТС в течение 5 суток. Затем клетки собирали и оценивали процесс созревания Тх по изменению экспрессии молекул CD45RO, CD40L, CD134 (0Х40), CD279 (PD-1), CD278 (ICOS), CCR7 и CXCR5 с помощью лазерной проточной цитометрии. Для этого использовали МКА, меченные фико-эритрином, аллофикоцианином и PerCP-eFluor 710 (eBioscience, США). Для гейтирования Тх использовали МКА к CD4, меченные флюоресцеинизотиоционатом (Сорбент, Москва). Для оценки экспрессии ядерного фактора Bcl-6 после окрашивания поверхностных маркеров клетки фиксировали и их мембраны пермеабилизировали с помощью набора реагентов Foxp3 Fixation/Permeabilization Kit (eBioscience, США) согласно рекомендациям производителя для окрашивания ядерных белков. После этого клетки окрашивали МКА к Bcl-6, конъюгированными с аллофикоцианином (eBiosci-ence, США).
Окрашенные пробы анализировали на проточном ци-тофлюориметре FacsCalibur (BD Biosciences, США). При анализе результатов цитометрии клетки последовательно выделяли в гейт лимфоцитов или в гейт лимфобластов в соответствии с профилем прямого и бокового светорассеива-ния, затем - в гейт CD4+ клеток, а затем - в гейты клеток с различной экспрессией хемокиновых рецепторов CCR7 и CXCR5. Результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения CellQuest, оценивая процент клеток, несущих маркер, и плотность экспрессии маркера по геометрической средней интенсивности флюоресценции окрашенных клеток. Статистический анализ проводили с использованием /-теста Стьюдента для независимых выборок. Данные на гистограммах представлены, как M ± m.
Результаты. Для изучения созревания Тх использовали смешанные культуры, в которых наивные CD4+ Т-лимфоциты стимулировались аллогенными ДК или В-лимфоцитами.
Рис. 1. Характеристика клеток, использованных для создания смешанных культур.
а - контроль чистоты наивных CD4+ Т-клеток. Выделенные пробы содержат более 95% CD3+CD4+ клеток и CD45RA+CD45RO" клеток; б - средние показатели экспрессии хемокиновых рецепторов и молекул, ассоциированных с функцией Тх, на наивных CD4+ Т-клетках (процент клеток с фенотипами, обозначенными под гистограммой); в - экспрессия мембранных молекул на нДК (гистограммы с серым полем) и ДК-ЦТК (толстая линия). Тонкая линия - контроль окрашивания; г - характеристика очищенных В-лимфоцитов. Выделенные пробы содержат более 98% CD19+HLA-DR+ В-лимфоцитов и не содержат Т-клеток, естественных киллеров и моноцитов. Названия маркеров обозначены у осей графиков, доля клеток целевых популяций - в соответствующих квадрантах.
Наивные CD4+ Т-лимфоциты выделяли из неприлипающей фракции МНПК с помощью иммуномагнитной сепарации с негативной селекцией. Доля целевой субпопуляции CD3+CD4+CD45RA+CD45RO" клеток в изолятах составляла от 95,1 до 98,4% (рис. 1, а). Подавляющее большинство свеже-выделенных CD4+ наивных Т-лимфоцитов экспрессировало хемокиновый рецептор CCR7 и не экспрессировало CXCR5, CD40L и OX40 (рис. 1, б). Треть клеток несла молекулу ICOS и 11% клеток - молекулу PD-1, но плотность экспрессии этих молекул на мембране была крайне низкой: геометрическая средняя интенсивности флюоресценции ICOS+ клеток составляла 32,8 ± 0,5 , а PD-1+ клеток - 25,9 ± 1,4.
В-лимфоциты также выделяли с помощью иммуномаг-нитной сепарации, и в работе использовали изоляты, содержащие от 97 до 98,9% В-клеток с фенотипом CD19+HLA-DR+CD3-CD4-CD14-CD16-CD56- (рис. 1, г).
Незрелые ДК получали традиционным способом, культивируя моноциты с ИЛ-4 и ГМ-КСФ. Затем нДК стимулировали коктейлем провоспалительных цитокинов и простаглан-дина Е2 для получения зрелых ДК. Такие стимулированные цитокинами клетки далее обозначены ДК-ЦТК. При созре-
вании моноцитов в нДК клетки утрачивали моноцитарный маркер СБ14 и увеличивали экспрессию молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса HLA-DR и ко-стимулирующих молекул СD80 и СD86. Созревание ДК-ЦТК индуцировало экспрессию молекулы СD83, маркера зрелых ДК, а также приводило к дополнительному росту интенсивности флюоресценции окрашенных молекул HLA-DR, СD80 и СD86 (рис. 1, в).
При создании смешанных культур использовали соотношение В-лимфоцитов и Т-лимфоцитов 5:1, воспроизводящее преобладание В-клеток в фолликулах и перифолликулярном пространстве, и соотношение ДК и Т-лимфоцитов 1:5, воспроизводящее преобладание Т-клеток над АПК в Т-клеточной зоне лимфоидных органов. Стимуляция аллогенными АПК приводила к олигоклональной активации Т-лимфоцитов и превращению части клеток в лимфобласты. К пятым суткам культивирования лимфобласты значительно увеличивались в размерах, что позволяло четко отделять их от покоящихся лимфоцитов в соответствии с профилем прямого светорассе-ивания (Т^С) и бокового светорассеивания (SSС) (рис. 2, а). Анализ экспрессии вариантов молекулы СD45 показал, что
Рис. 2. а - стимуляция наивных CD4+ Т-лимфоцитов аллогенными АПК приводит к появлению в культуре лимфобластов (гейт R2). Лимфоциты выделены в гейт R1. В культурах, стимулированных нДК и ДК-ЦТК (гистограмма б) или В-лимфоцитами (в), созревающие CD45RO+ Т-клетки локализованы в гейте лимфобластов. Экспрессия CD45RO определялась на клетках, выделенных в гейты лимфоцитов или лимфобластов, а затем - в гейт CD4+ клеток. На гистограммах г и д - количество CD4+ Т-клеток, несущих хемокиновые рецепторы CCR7 и CXCR5, в смешанных культурах. Типы клеток обозначены под гистограммами (б-д) и на графиках светорассеивания (а). Контрольные наивные CD4+ Т-клетки без АПК обозначены Тх. Т-клетки из смешанных культур с нДК обозначены Тх + нДК, из культур с ДК-ЦТК - Тх + ДК-ЦТК, из культур с В-лимфоцитами - Тх + В. * - достоверные отличия от контрольных наивных CD4+ Т-клеток без АПК (р < 0,05).
практически все созревшие СБ45ЯО+ Тх сосредоточены в гейте лимфобластов, причем доля СБ45ЯО+ клеток среди СБ4+ лимфобластов весьма высока. Так, в смешанных культурах Тх с нДК и культурах Тх с В-лимфоцитами более половины СБ4+ лимфобластов экспрессировали СБ45ЯО, а в культурах Тх с ДК-ЦТК почти 90% СБ4+ лимфобластов несли эту молекулу (рис. 2, б, в).
Изменения экспрессии хемокиновых рецепторов, сопровождающие созревание Тх, также наблюдались среди лимфобластов и практически не затрагивали клетки в гейте покоящихся лимфоцитов (рис. 2, г, д). Характер этих изменений зависел от типа АПК. ДК индуцировали появление СХСЯ5 на существенной части созревающих Тх и лишь незначительно снижали экспрессию ССЯ7 (см. рис. 2, г). В-лимфоциты вызывали экспрессию СХСЯ5 и потерю ССЯ7 большинством СБ4+ лимфобластов (см. рис. 2, д).
Распределение СБ4+ Т-клеток смешанных культур по 4
группам с различной экспрессией ССЯ7 и СХСЯ5 представлено на рис. 3. Практически все покоящиеся СБ4+лимфоциты смешанных культур Тх с ДК сохраняли набор хемокиновых рецепторов, характерный для наивных Тх: ССЯ7+СХСЯ5-. В культурах Т-хелперов с В-лимфоцитами большинство Т-клеток лимфоцитарного гейта также сохраняли фенотип ССЯ7+СХСЯ5-, но, при этом, появлялась относительно небольшая группа клеток, лишенная обоих рецепторов.
Созревающие СБ4+ лимфобласты в культурах с ДК формировали две большие группы (рис. 3, а, б). Одна группа по набору определяемых хемокиновых рецепторов не отличалась от исходных наивных Т-хелперов (ССЯ7+СХСЯ5-), другая группа одновременно экспрессировала оба хемокиновых рецептора (ССЯ7+СХСЯ5+). Кроме того, при стимуляции Т-клеток зрелыми ДК-ЦТК появлялась небольшая, но четко определяемая группа ССЯ7-СХСЯ5- Т-хелперов.
В смешанных культурах с В-лимфоцитами распределе-
CD4+ лимфоциты Ш CD4+ лимфобласты
Рис. 3. Содержание групп СЭ4+ Т-клеток, различающихся по экспрессии ССR7 и СXСR5, среди лимфоцитов и лимфобластов смешанных культур, стимулированных незрелыми ДК (а), зрелыми ДК-ЦТК (б) и В-лимфоцитами (в). Фенотип групп клеток обозначен под гистограммами, принадлежность к лимфоцитам или лимфобластам - в легенде.
Достоверные различия между лимфоцитами и лимфобластами обозначены * - при р < 0,05 и ** - при р < 0,005.
ние СD4+ лимфобластов по группам оказалось другим (рис. 3в). Большинство лимфобластов этих культур распределялось между группами с фенотипом ССR7-СXСR5+ и ССR7-
СXСR5-, тогда как содержание ССR7+СXСR5- клеток было незначительным (см. рис. 3, в). Анализ распределения молекул, ассоциированных со степенью зрелости Т-хелперов, по-
Рис. 4. Характеристика CD4+ лимфобластов из смешанных культур Т-клеток и В-лимфоцитов.
а - экспрессия CCR7 и CXCR5 и пример гейтирования CCR7"CXCR5" клеток (гейт R10), CCR7"CXCR5+ клеток (R11) и CCR7+CXCR5" клеток (R12); б - экспрессия молекул ICOS, PD-1, CD40L и 0X40 в зависимости от наличия CXCR5; в - интенсивность экспрессии молекул ICOS, PD-1, CD40L и 0X40 на CCR7-CXCR5+ Т-лимфобластах (гистограммы с серым полем), CCR7-CXCR5- лимфобластах (толстая черная линия) и CCR7+CXCR5- (гистограммы с черным полем); г - экспрессия Bcl-6 в CD4+ лимфоцитах и лимфобластах в зависимости от наличия CXCR5. Пунктир - контроль окрашивания. Названия маркеров обозначены у соответствующих осей, а типы клеток - под графиками.
Рис. 5. Экспрессия CCR7 и CXCR5 на CD4+ лимфобластах из смешанных культур Т-клеток с нДК (а) и с ДК-ЦТК (б). Выделены CCR7+CXCR5+ клетки (гейт R7), CCR7-CXCR5- клетки (R8) и CCR7+CXCR5- клетки (R9). Интенсивность экспрессии молекул ICOS, PD-1, CD40L и ОХ40 на группах CD4+ лимфобластов из культур Т-клеток с нДК (в) и с ДК-ЦТК (г). Группы CD4+ лимфобластов: CCR7+CXCR5+ клетки (гистограммы с серым полем), CCR7+CXCR5- клетки (толстая черная линия) и CCR7-CXCR5- клетки (гистограммы с черным полем). Пунктир - контроль окрашивания. Названия маркеров обозначены у соотв. осей.
казал, что высокий уровень экспрессии ICOS, PD-1 и ОХ-40 после стимуляции В-лимфоцитами наблюдается на CXCR5+ Т-лимфобластах (рис. 4, б). Экспрессия ядерного фактора Bcl-6, характерного для Тфх, также наблюдалась, преимущественно, в CXCR5+ Т-лимфобластах (рис. 4, г).
Для оценки степени зрелости различных групп CD4+ лимфобластов, созревание которых было индуцировано В-лимфоцитами, применяли раздельное гейтирование CCR7-CXCR5+ , CCR7-CXCR5- и CCR7+CXCR5- клеток. Пример гейтирования представлен на рис. 4, а. Этот подход показал, что группа лимфобластов с фенотипом CCR7-CXCR5+ обладала наибольшим уровнем экспрессии молекул, характерных для зрелых Тх (рис. 4, в). CCR7-CXCR5- лимфобласты по степени зрелости занимали промежуточное положение. Они имели меньший уровень экспрессии ICOS и CD40L, низкий уровень экспрессии ОХ40 и демонстрировали признаки гетерогенности по экспрессии маркера PD-1, формируя подгруппы с промежуточным и низким уровнем экспрессии. Наконец, малочисленные CCR7+CXCR5- лимфобласты обладали низким уровнем экспрессии PD-1, были вариабельны по экспрессии ICOS и лишены молекул CD40L и 0X40. Соответственно, CCR7+CXCR5- клетки по фенотипу практически не отличались от исходных наивных Т-хелперов.
Раздельное гейтирование CCR7+CXCR5-, CCR7+CXCR5+ и CCR7-CXCR5- лимфобластов из культур с ДК показало, что все эти группы клеток обладают высоким уровнем экспрессии молекул, ассоциированных с созреванием Тх (рис. 5). Как в культурах с нДК, так и в культурах с ДК-ЦТК максимальный уровень флюоресценции окрашенных молекул
PD-1 и 0X40 и чрезвычайно высокий уровень экспрессии ICOS демонстрировали CCR7+CxCR5+ Т-лимфобласты. CCR7-CxCR5- лимфобласты, немногочисленные в культурах с нДК и образующие четко оформленную группу в культурах с ДК-ЦТК, имели относительно меньший уровень экспрессии ICOS, PD-1 и 0X40 и не отличались от CCR7+CXCR5+-клеток по экспрессии CD40L. Наконец, CCR7+CxCR5- лим-фобласты имели в своем составе небольшую часть клеток, лишенных молекул PD-1, CD40L и 0X40, однако большая часть CCR7+CXCR5-клеток демонстрировало фенотип зрелых Тх с высоким уровнем экспрессии ICOS, PD-1, CD40L и 0X40.
Обсуждение. В работе использовали аллогенные смешанные культуры, в которых наивные CD4+ Т-лимфоциты получали стимулирующий сигнал при распознавании чужих аллельных вариантов белков АПК. В результате активировалось небольшое количество клонов Т-лимфоцитов, тогда как большинство Т-клеток, не нашедших свой клоноспецифический антиген, не участвовало в процессе активации. Внешним проявлением активации было превращение мелких покоящихся лимфоцитов в крупные лимфобласты. При лазерной проточной цитометрии лимфобласты хорошо отделялись от покоящихся лимфоцитов по показателям светорассеивания. 0ценка экспрессии маркера зрелых Т-клеток CD45RO подтвердила, что практически все созревшие в культуре Т-клетки сосредоточены в гейте лимфо-бластов. Анализ распределения хемокиновых рецепторов показал, что большинство CD4+ Т-лимфобластов из смешанных культур с дендритными клетками разделено между двумя группами с фенотипом CCR7+CXCR5- и CCR7+CXCR5+. Определе-
ние экспрессии молекул, характерных для зрелых Тх, показало, что обе эти группы клеток обладают высоким уровнем экспрессии молекул ICOS, PD-1, CD40L и ОХ40. Таким образом, стимуляция дендритными клетками приводит к дифференци-ровке наивных CD4+ Т-лимфоцитов в зрелые Т-хелперы, подавляющее большинство которых сохраняет экспрессию CCR7. Известно, что зрелые CCR7+ Т-лимфоциты, остающиеся после иммунного ответа, образуют пул центральных Т-клеток памяти. После выхода в рециркуляцию такие клетки сохраняют склонность возвращаться в Т-клеточные зоны лимфоидных органов для поиска приносимых туда антигенов при повторении инфекции [17]. Около половины CCR7+ Т-лимфоцитов, созревших в культурах с ДК, ко-экспрессировали хемокино-вый рецептор CXCR5. Такие клетки также обнаруживаются в крови и в функциональном отношении представляют собой смесь Тх1 и клеток, совмещающих свойства Тх2 с Тфх или Тх17 с Тфх [21]. Часть этих клеток может эффективно оказывать помощь В-лимфоцитам после непосредственного контакта [21] или после индуцированного В-клетками дозревания [17]. Предполагают, что одновременная экспрессия двух хемокиновых рецепторов может направить эти клетки из кровотока в В-клеточную зону, где они дозревают в Тфх, или в Т-клеточную зону, где эти пластичные клетки могут дать начало другим субпопуляциям Т-хелперов.
В культурах, стимулированных зрелыми ДК, наряду с описанными выше субпопуляциями формируется относительно немногочисленная группа зрелых CD4+ лимфобла-стов, лишенных экспрессии как CCR7, так и CXCR5. По своему фенотипу, эти клетки, утратившие инструменты хоминга в лимфоидную ткань, соответствуют Т-клеткам-эффекторам и эффекторным Т-клеткам памяти, однако для подтверждения этого положения требуется анализ экспрессии молекул хоминга в периферические и воспаленные ткани и оценка цитокинового профиля этих лимфоцитов. Клеток с фенотипом типичных Тфх в смешанных культурах с дендритными клетками не образуется.
В то же время наиболее зрелая и многочисленная группа лимфобластов, образующаяся при культивировании наивных CD4+ Т-лимфоцитов с аллогенными В-клетками, по своему фенотипу соответствует Тфх. Эти клетки лишены CCR7, несут на мембране CXCR5, CD40L, OX40 и обладают высоким уровнем экспрессии ICOS и PD-1. Часть этих клеток содержит ядерный фактор Bcl-6. Кроме того, лимфобласты смешанных культур Т-клеток с В-лимфоцитами содержат минорную группу CCR7+CXCR5-клеток с низким уровнем экспрессии маркеров зрелых Тх, и CCR7-CXCR5- группу с промежуточным уровнем экспрессии этих молекул. По нашему предположению, эти группы не являются самостоятельными субпопуляциями, а отражают этапы созревания Тфх в культуре.
Таким образом, показано, что взаимодействие наивных Т-лимфоцитов с В-клетками индуцирует созревание Тфх. Однако такое взаимодействие возможно в фолликулах и межфолликулярном пространстве, т. е. в В-клеточной зоне и зоне смешанного расположения Т- и В-лимфоцитов в лимфоидном органе. В то же время известно, что наивные Т-лимфоциты за счет мощной экспрессии CCR7 преимущественно мигрируют в Т-клеточную зону - паракортекс. Однако недавно мы описали малую субпопуляцию наивных CD4+ Т-лимфоцитов крови человека, одновременно экспрессирующих хемокино-вые рецепторы CCR7, CXCR4 и CXCR5 [22]. Можно предположить, что такой набор рецепторов позволяет этим клеткам покидать кровоток как в паракортексе, так и в области фолликулов, что создает условия для их встречи с В-лимфоцитами и дифференцировки в Тфх.
Заключение. Показано, что наивные CD4+ Т-лимфоциты, стимулированные В-клетками in vitro, созревают в Тх, фенотипически идентичные Тфх. Этот процесс не требует участия других АПК и дополнительных стимулирующих воздействий. Стимуляция наивных Т-лимфоцитов дендритными клетками не индуцирует образование типичных Тфх, но стимулирует созревание Тх с
высоким уровнем экспрессии молекул для межклеточной
кооперации и различными наборами хемокиновых рецепторов.
Работа поддержана РФФИ, проект 13-04-00264.
литература
1. Mosmann T.R., Cherwinski H., Bond M. W., Giedlin M. A., Coffman R. L. Two types of murine helper Tcell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J. Immunol. 1986; 136: 2348-57.
2. Murphy K.M., Stockinger B. Effector T cell plasticity: flexibility in the face of changing circumstances. Nature Immunol. 2010; 11(8): 674-80.
3. McKinstry K.K., Strutt T.M., Swain S.L. The potential of CD4 T-cell memory. Immunology. 2010; 130: 1-9.
4. Damsker J.M., Hansen A.M., Caspi R.R. Th1 and Th17 cells: adversaries and collaborators. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2010; 1183: 211-21.
5. Annunziata F., Cosmi L., Santarlasci V., Maggi L., Liotta F., Mazzinghi B. et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J. Exp. Med. 2007; 204(8): 1849-61.
6. Ma C.S., Deenick E.K., Batten M., Tangye S.G. The origins, function, and regulation of T follicular helper cells. J. Exp. Med. 2012; 209(7): 1241-53.
7. Fazilleau N., Mark L., McHeyzer-Williams L.J., McHeyzer-Williams M.H. Follikular helper T cells: lineage and location. Immunity. 2009; 30(3): 324-35.
8. Топтыгина А.П. Лимфоидный фолликул - территория иммунного ответа. Иммунология. 2012; 33(3): 162-9.
9. Nurieva R.I., Chung Y., Martinez G.J., Yang X.O., Tanaka S., Matskev-itch T.D. et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 2009; 325: 1001-5.
10. O'Shea, J.J., Paul W.E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 2010; 327: 1098-102
11. Crotty S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu. Rev. Immunol. 2011; 29: 621-63.
12. Choi Y. S., Kageyama R., Eto D., Escobar T.C., Johnston R.J., Monticelli L. et al. Bcl6 dependent T follicular helper cell differentiation diverges from effector cell differentiation during priming and depends on the gene Icos. Immunity. 2011; 34(6): 932-46.
13. Del Rio M., Buhler L., Gibbons C., Tian J., Rodriguez-Barbosa J. PD-1/ PD-L1, PD-1/PD-L2, and other co-inhibitory signaling pathways in transplantation. Transplant. Int. 2008; 21(11): 1015-28.
14. Wang C., Hillsamer P., Kim C.H. Phenotype, effector function, and tissue localization of PD-1-expressing human follicular helper T cell subsets. BMC Immunol. 2011; 12: 53.
15. Poholek A.C., Hansen K., Hernandez S.G., Eto D., Chandele A., Weinstein J.S., et al. In vivo regulation of Bcl6 and T follicular helper cell development. J. Immunol. 2010; 185: 313-26.
16. Salek-Ardakani S., Choi Y.S., Rafii-El-Idrissi Benhnia M., Flynn R., Arens R., Shoenberger S. et al. B cell-specific expression of B7-2 is required for follicular Th cell function in response to vaccinia virus. J. Immunol. 2011; 186: 5294-303.
17. Chevalier N., Jarrossay D., Ho E., Avery D.T., Ma C.S., Yu D. et al. CX-CR5 expressing human central memory CD4 T cells and their relevance for humoral immune responses. J. Immunol. 2011; 186: 5556-68.
18. Baumjohann D., Okada T., Ansel K.M. Cutting Edge: Distinct waves of BCL6 expression during T follicular helper cell development. J. Immunol. 2011; 187: 2089-92.
19. Goenka R., Barnett L.G., Silver J.S., O'Neill P.J., Hunter C.A., Cancro M.P. et al. Cutting edge: dendritic cell-restricted antigen presentation initiates the follicular helper T cell program but cannot complete ultimate effector differentiation. J. Immunol. 2011; 187: 1091-5.
20. Талаев В.Ю., Плеханова М.В., Заиченко И.Е., Бабайкина О.Н. Действие вакцин на экспрессию хемокиновых рецепторов дендритными клетками новорожденных и взрослых in vitro. Иммунология. 2013; 34(6): 318-23.
21. Rimpei M., Schmitt N., Bentebibel S., Ranganathan R., Bourdery L., Zurawski G. et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 2011; 34(1): 108-21.
22. Талаев В.Ю., Плеханова М.В., Бабайкина О.Н., Воронина Е.В. Характеристика малой субпопуляции наивных CD4+ Т-лимфоцитов, несущих хемокиновый рецептор CXCR5. Иммунология. 2015; 36(1): 9-13.
Поступила 02.04.15
references
1. Mosmann T.R., Cherwinski H., Bond M. W., Giedlin M. A., Coffman R. L. Two types of murine helper Tcell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J. Immunol. 1986; 136: 2348-57.
2. Murphy K.M., Stockinger B. Effector T cell plasticity: flexibility in the
face of changing circumstances. Nature Immunol. 2010; 11(8): 674-80.
3. McKinstry K.K., Strutt T.M., Swain S.L. The potential of CD4 T-cell memory. Immunology. 2010; 130: 1-9.
4. Damsker J.M., Hansen A.M., Caspi R.R. Th1 and Th17 cells: adversaries and collaborators. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2010; 1183: 211-21.
5. Annunziato F., Cosmi L., Santarlasci V., Maggi L., Liotta F., Mazzinghi B. et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J. Exp. Med. 2007; 204(8): 1849-61.
6. Ma C.S., Deenick E.K., Batten M., Tangye S.G. The origins, function, and regulation of T follicular helper cells. J. Exp. Med. 2012; 209(7): 1241-53.
7. Fazilleau N., Mark L., McHeyzer-Williams L.J., McHeyzer-Williams M.H. Follikular helper T cells: lineage and location. Immunity. 2009; 30(3): 324-35.
8. Toptygina A.P. The lymphoid follicles - the immune response zone. Im-munologia. 2012; 33 (3): 162-9. (in Russian)
9. Nurieva R.I., Chung Y., Martinez G.J., Yang X.O., Tanaka S., Matskev-itch T.D. et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 2009; 325: 1001-5.
10. O'Shea, J.J., Paul W.E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 2010; 327: 1098-102.
11. Crotty S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu. Rev. Immunol. 2011; 29: 621-63.
12. Choi Y. S., Kageyama R., Eto D., Escobar T.C., Johnston R.J., Monticelli L., et al. Bcl6 dependent T follicular helper cell differentiation diverges from effector cell differentiation during priming and depends on the gene Icos. Immunity. 2011; 34(6): 932-46.
13. Del Rio M., Buhler L., Gibbons C., Tian J., Rodriguez-Barbosa J. PD-1/ PD-L1, PD-1/PD-L2, and other co-inhibitory signaling pathways in transplantation. Transplant. Int. 2008; 21(11): 1015-28.
14. wang C., Hillsamer P., Kim C.H. Phenotype, effector function, and tissue
localization of PD-1-expressing human follicular helper T cell subsets. BMC Immunol. 2011; 12: 53.
15. Poholek A.C., Hansen K., Hernandez S.G., Eto D., Chandele A., Weinstein J.S. et al. In vivo regulation of Bcl6 and T follicular helper cell development. J. Immunol. 2010; 185: 313-26.
16. Salek-Ardakani S., Choi Y.S., Rafii-El-Idrissi Benhnia M., Flynn R., Arens R., Shoenberger S. et al. B cell-specific expression of B7-2 is required for follicular Th cell function in response to vaccinia virus. J. Immunol. 2011; 186: 5294-303.
17. Chevalier N., Jarrossay D., Ho E., Avery D.T., Ma C.S., Yu D. et al. CX-CR5 expressing human central memory CD4 T cells and their relevance for humoral immune responses. J. Immunol. 2011; 186: 5556-68.
18. Baumjohann D., Okada T., Ansel K.M. Cutting Edge: Distinct waves of BCL6 expression during T follicular helper cell development J. Immunol. 2011; 187: 2089-92.
19. Goenka R., Barnett L.G., Silver J.S., O'Neill P.J., Hunter C.A., Cancro M.P. et al. Cutting edge: dendritic cell-restricted antigen presentation initiates the follicular helper T cell program but cannot complete ultimate effector differentiation. J. Immunol. 2011; 187: 1091-5.
20. Talayev V.Yu., Plekhanova M.V., Zaichenko I.Ye., Babaykina O.N. Effect of vaccines on the expression of chemokine receptors on dendritic cells of new-borns and adults in vitro. Immunologia. 2013; 34(6): 318-23. (in Russian)
21. Rimpei M., Schmitt N., Bentebibel S., Ranganathan R., Bourdery L., Zurawski G. et al. Human blood CXCR5+CD4+ T cells are counterparts of T follicular cells and contain specific subsets that differentially support antibody secretion. Immunity. 2011; 34(1): 108-21.
22. Talayev V. Yu., Plekhanova M. V, Babaykina O. N., Voronina E. V. Characterization of a small subpopulation of naive CD4 T-lymphocytes bearing chemokine receptor CXCR5. Иммунология. 2015; 36(1): 9-13. (in Russian)
Recieved 02.04.15
ТРАНСПЛАНТОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 616.36-089.843-053.2-078.33
Шевченко О.П12, Цирульникова О.М.1-2, Курабекова Р.М.1, Цирульникова И.Е.1, Олефиренко Г.А.1, Готье С.В.1,2
уровень трансформирующего фактора роста в1 в плазме крови детей-реципиентов печени и его связь с функцией трансплантата
1ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России, г. Москва; 2Кафедра трансплантологии и искусственных органов; 3ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова», 119991, г Москва
Трансформирующий фактор роста Р1 (TGF-p1) оказывает плейотропное действие на печень и может играть важную роль в развитии иммунной толерантности и фиброза трансплантированной печени. Цель исследования -анализ взаимосвязи уровня TGF-p1 в плазме крови детей-реципиентов печени с клиническими характеристиками пациентов до, через месяц и год после трансплантации. Обследовано 130 детей в возрасте от 3 до 73 месяцев с терминальной стадией печеночной недостаточности: 101 пациенту пересажен фрагмент печени от идентичного или совместимого по системе АВ0 донора, а 29 - от несовместимого донора. Концентрацию TGF-p1 определяли в образцах плазмы крови методом ИФА. Обнаружено, что трансплантация печени приводит к увеличению уровня TGF-p1 в плазме крови реципиентов через месяц и год после трансплантации. Содержание TGF-p1 в плазме крови реципиентов печени до, через месяц и год после трансплантации не коррелировало с полом, возрастом, диагнозом, тяжестью заболевания печени и совместимостью с донором по полу и группе крови по системе АВ0. Также не обнаружено взаимосвязи уровня TGF-p1 до, через месяц и год после трансплантации с развитием в раннем послеоперационном периоде различных осложнений: желчных свищей, тромбозов и кровотечений, кризов отторжения, вирусных и бактериальных инфекций. Однако развитие в раннем послеоперационном периоде дисфункции трансплантата обратно коррелировало с уровнем TGF-p1 до трансплантации. Возможно, что низкий уровень цитокина (2,0 ± 1,3 нг/мл) до трансплантации печени у детей может служить негативным предиктором развития дисфункции трансплантата.
Ключевые слова: трансформирующий фактор роста в1; дети-реципиенты печени; трансплантация печени; биомаркеры; АВО-несовместимая трансплантация; цитокины.
Для цитирования: Иммунология. 2015; 36(6): 343-347.
Для корреспонденции: Шевченко Ольга Павловна, transplant2009@mail.ru For correspondence: Shevchenko Ol'ga Pavlovna, transplant2009@mail.ru
