CC BY
82
УДК 797.322+611.7
СТИМУЛЯЦИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И КОСТНОМОЗГОВОГО ГЕМОПОЭЗА с помощью ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ПРИ ДЕЗАДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА
Я.В. Латюшин, Н.Ю. Шелгаев**, В.И. Павлова* В.П. Шахов ***
'Челябинский государственный педагогический университет, г. Челябинск; **Государственное учреждение здравоохранения Челябинский областной кожно-венерологический диспансер, г. Челябинск;
***Томский политехнический университет, г. Томск
Исследовалось влияние стресса, вызванного 12-часовой иммобилизацией мышей линии Ва1Ь/с на систему гемопоэза и мезенхимальные стволовые клетки костного мозга. Экстремальное воздействие приводит к развитию дезадаптации со стороны костномозгового кроветворения как на уровне гемопоэтических, так и мезенхимальных стволовых клеток. После лейкоцитоза (1 сутки) наблюдается депрессия лейкопоэза и снижение общего количества миелокариоцитов в костном мозге. Введение гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при стрессе оказывает защитное действие на кроветворение. Граноцит можно использовать как профилактическое средство лицам, подверженным частым стрессам и дисадаптации.
Ключевые слова: стволовые клетки, стресс, адаптация, гемопоэз, мезенхимопоэз, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.
Адаптация организма к действию экстремальных факторов включает в себя сложный механизм, включающий в себя слаженную работу ключевых гомеостатических систем (нейроэндокринная, иммунная, кроветворная и др.). В зависимости от силы экстремального воздействия или патологического процесса, наблюдается повышение общей устойчивости организма или ее снижение. Причем переход от одного состояния к другому может иметь колебательную форму [9, 4, 5, 11, 1]. Особая роль в данном механизме принадлежит мезенхимальным стволовым клеткам (МСК) [5, 8, 14, 16]. Именно им также принадлежит важная роль в формировании специфического микроокружения многих органов, включая костный мозг. Они являются основной матричной единицей, так называемых «ниш», которая регулирует процессы пролиферации и дифференцировки, окружающих мезенхимальный элемент, стволовых клеток других гистогенетических линий, в частности гемопоэтических прекурсоров [17, 20]. В свою очередь гемо-поэтические стволовые клетки дают начало более дифференцированным потомкам миелопоэза, эри-тропоэза и тромбоцитопоэза, из которых формируются клетки крови [7, 13]. Дисбаланс в работе МСК и гемопоэтических клеток-предшественни-ков под действием стрессора сопровождается уменьшением общего количества кариоцитов, в результате чего развиваются лейкопения и (или) анемия и, как следствие, снижение резистентности организма к действию неблагоприятных факторов [5, 13]. С теоретических позиций для борьбы с
этим патологическим процессом можно использовать разного рода ростовые факторы, стимулирующие гемопоэз, включая цитокины, интерлейкины, колониестимулирующие факторы и т.п. [6, 10]. С этих позиций большой интерес представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), который является естественным ростовым фактором для миелопоэза как на уровне кроветворных клеток-предшественников, так и их более дифференцированных потомков - нейтро-филов и моноцитов. Кроме того, Г-КСФ может мобилизировать МСК из костного мозга в кровь. Однако эти работы касаются преимущественно заболеваний со стороны сердечно-сосудистой системы. Интегральное воздействие данного цитоки-на на мезенхимальные и гемопоэтические стволовые клетки костного мозга при стрессе остается неясным [6, 10, 18, 3].
В связи с этим, целью настоящего исследования явилось изучение роли действия гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на мезенхимопоэз и миелопоэз при действии на организм экстремальных факторов.
Материалы и методы. Опыты были проведены на 55 самцах мышей линии Ва1Ь\с массой 18-21 г. Животные в общепринятых условиях и стандартной диете. В опыты отбирались только здоровые животные, прошедшие двухнедельный карантин в условиях вивария. Все манипуляции с лабораторными животными осуществляли согласно существующей Хельсинской декларации.
Иммобилизационный стресс (ИС) вызвали
путем фиксации животных на спине в течение 12 часов как было описано ранее [5]. Контрольных животных содержали по 10-12 особей в обычных клетках.
В качестве Г-КСФ мы использовали рекомбинантный фармакологический препарат «Граноцит» фирмы «Aventus», который вводили подкожно в дозе 50 мкг/кг в течение 3 суток после иммобилизации [16].
На 1, 3, 5, 7 и 10 сутки после иммобилизации в периферической крови определяли содержание общего количества эритроцитов, лейкоцитов, с подсчетом лейкоцитарной формулы [12]. На 3, 5, 7 и 10 сутки часть животных забивали, подсчитывали общую клеточность костного мозга, делали миелограмму и культивировали клетки в системе in vitro. Определение общего количество мезенхимальных стволовых клеток осуществляли по стандартной методике [12]. Костный мозг вымывали из бедренной кости с помощью шприца средой DIMEM, доводили общее количества жизнеспособных кариоцитов до 1х106/мл в полной культуральной среде (ПКС), которая состояла из: 90 % среды DIМЕМ, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 200 мМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентами-цина (все реактивы фирмы «Sigma», США). Клетки разливали в 50 мл пластиковые флаконы фирмы «Falcon» (по 5 мл на флакон) и инкубировали при 37 °С, 100 % влажности, 5 % С02 в течение 3 суток в С02-инкубаторе. Затем удаляли не адгезирую-щие клетки и меняли полную питательную среду на свежую порцию. Материал культивировали в течение 14 суток с заменой полной питательной среды каждые 3 суток при 37 °С, 100 % влажности, 5 % С02 в течение 3 суток в С02-инкубаторе. После чего с помощью инвертоскопа подсчитывали число выросших колоний (агрегатов, содержащих более 50 клеток) с последующей окраской азур-П эозином [12].
Гранулоцитарные колониеобразующие клетки костного мозга исследовали по общепринятой ме-
тодике путем культивирования в полутвердом бак-тоагаре фирмы «Difco» (США), 35 мм чашках Петри фирмы «Falcon» при 37 °С, 100% влажности, 5 % С02 в течение 7 суток в С02-инкубаторе. В полную культуральную среду дополнительно добавляли 0,3 % бактоагара и препарат «Граноцит» в дозе 10 мкг/мл. На 7 сутки подсчитывали общее количество колоний и кластеров (колонии агрегаты, содержащие более 50 клеток, кластеры от 3 до 50) с последующим извлечением отдельных колоний и окраской их азур-П эозином [12].
Статистическую обработку полученных данных проводили с вычислением t-критерия Стью-дента при помощи компьютерной программы «Statistica 7» с определением М - выборочное среднее, m - ошибка среднего и р - достигнутый уровень значимости.
Результаты и обсуждение
В результате проведенных исследований было установлено, что иммобилизационный стресс вызывает развитие лейкоцитоза на 1 сутки опыта. При этом наблюдалось развитие нейтрофилеза (на 175,3 ± 12,1 % от фона, Pt < 0,05) и лимфопения (до 43,8 ± 5,3 % от фона, Pt < 0,001), затем сменяется лейкопенией, которая продолжается до 5 суток. К 10 суткам эксперимента общее количество лейкоцитов нормализуется (табл. 1).
В костном мозге наблюдается падение общего количества миелокариоцитов (ОКК), начиная с 1 по 5 сутки опыта, которое возрастает на 7 день, а затем возвращается к исходным величинам (10 сутки) (см. табл. 1). Содержание гранулоцито-макрофагальных колоние-и кластеробразующих единиц (ГМ-КОЕ, ГМ-КлОЕ) при иммобилизаци-онном стрессе снижается на 1,3 сутки, после чего наблюдается их гиперплазия (5,7 сутки) и последующая нормализация к 10 дню исследования до исходных параметров (табл. 1). Общее количество МСК снижается на 1 сутки опыта, после чего их количество достоверно увеличивается к 3,5,7 суткам, а на 10 день возвращается к исходным вели-
Таблица 1
Динамика общего количества лейкоцитов (ОКЛ) в периферической крови, общее количество кариоцитов (ОКК), количество ГМ-КОЕ, ГМ-КлОЕ, МСК в костном мозге мышей линии Ва!Ь\с до и после 12-часовой иммобилизации (Х±т, РЦ
Время после иммобилизации ОКЛ, х109/л ОКК в костном мозге, х109/л ГМ-КОЕк, х106 ГМ-КлОЕк, хЮ6 МСК, хЮ6
Контроль 23,3 ± 1,3 18,7 ±0,1 10,5 ±0,3 54,3 ± 1,7 1,4 ±0,1
1 сутки 27,7 ± 0,5 <0,05 11,5 ±0,5 < 0,001 4,3 ±1,7 < 0,001 31,5 ±2,3 < 0,001 0,3 ±0,1 <0,01
3 сутки 16,5 ±0,9 <0,05 13,4 ± 1,3 <0,01 5,1 ±0,7 < 0,001 35,1 ±4,1 <0,01 2,1 ±0,3 <0,05
5 сутки 17,8 ±2,1 <0,05 15,3 ±0,5 <0,05 16,2 ± 1,5 <0,05 66,1 ±2,1 <0,05 3,5 ± 0,5 <0,01
7 сутки 18,1 ±3,3 >0,05 23,1 ± 0,3 <0,05 15,6 ±0,3 <0,01 69,9 ± 1,1 <0,05 1,9 ±0,3 >0,5
10 сутки 22,9 ± 3,7 >0,5 19,3 ± 0,9 >0,5 11,5 ± 1,3 >0,5 55,9 ±3,1 >0,5 1,5 ±0,5 >0,5
Проблемы здравоохранения
чинам (табл. I, рис. 1). Эти данные свидетельствуют о том, что при стрессе в костном мозге после общей супрессии кроветворения и мезенхимопо-эза, наблюдаемой со стороны МСК и ГМ-КОЕ, ГМ-КлОЕ, происходит последовательный запуск регенераторного механизма, который направлен сначала на восстановление микроокружения костного мозга за счет мезенхимальных клеток, а затем -кроветворной ткани на уровне гемопоэтических прекурсоров и их дифференцированных потомков.
Рис. 1. Фрагмент мезенхимальной колонии, выросшей на 14 сутки культивирования в системе in vitro из клеток костного мозга мышей линии Balb/c на 7 сутки после иммбилизации. Фазовоконтрастная микроскопия, ув. 400х.
Введение Г-КСФ животным во время иммобилизации нивелирует негативные изменения как со стороны мезенхимальных, так и гранулоцито-макрофагальных стволовых клеток, а также состояние костномозгового кроветворения и картины крови. При этом резкого падения числа со стороны исследуемых родоначальных клеток стромы
и миелопоэза практически не происходит (табл. 2). Установлено, что препарат «Граноцит» оказывает протекторное действие на систему крови и элементы, формирующие микроокружение костного мозга - МСК. Количество МСК в костном мозге возрастает на 5 сутки более чем в 7 раз (см. табл. 2). При этом уже к 5 суткам опыта у животных нормализуется общее количество лейкоцитов в крови и ОКК костного мозга, после чего наблюдается выраженная гиперплазия данного органа (7 сутки опыта) (см. табл. 2). Полученные данные свидетельствуют о том, что Г-КСФ оказывает прямое стимулирующее действие на клетки белой крови, начиная с миелоидных прекурсоров, а также их более дифференцированных потомков - миелока-риоцитов костного мозга и лейкоцитов крови. При стрессе, вызванном иммобилизацией лабораторных животных, данный цитокин тоже оказывает не только протекторное, но и выраженное стимулирующее влияние на миелопоэз как на уровне ка-риоцитов костного мозга, так и их недифференцированных клеток-предшественников, включая мезенхимальные прекурсоры (см. табл. 2).
Раннее на модели цитостатической аплазии костного мозга нами было показано, что Г-КСФ не оказывает прямого стимулирующего действия на МСК [2]. Этот механизм, скорее всего, носит опосредованный характер. Очевидно, данный цитокин может активировать костномозговое кроветворение и через другие механизмы, например, с участием клеток эндотелия или других типов стро-мальных клеток [19, 15]. В результате чего, можно полагать, и происходит восстановление и даже активация процессов пролиферации и дифферен-цировки МСК (см. табл. 2).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что стресс, вызванный 12-часовой иммобилизацие, приводит к развитию дезадаптации костномозгового кроветворения как на уровне гемопоэтических, так и мезенхимальных стволо-
Таблица 2
Динамика общего количества лейкоцитов (ОКЛ) в периферической крови, общее количество карицоцитов (ОКК), количество ГМ-КОЕ, ГМ-КлОЕ, МСК в костном мозге мышей линии Ва1Ь\с до и после 12 часовой иммобилизации
на фоне введения препарата «Граноцит» (X ±т, РЦ
Время после иммобилизации + «Граноцит» ОКЛ, х109/л ОКК в костном мозге, х 109/л ГМ-КОЕк, х106 ГМ-КлОЕк, х106 МСК, х106
Контроль (без введения «Граноцита» 23,3 ± 1,3 18,7 ±0,1 10,5 ± 0,3 54,3 ±1,7 1,4 ±0,1
1 сутки 28,9 ± 1,1 < 0,05 14,3 ± 0,7 < 0,001 4,9 ±1,7 < 0,001 39,5 ± 3,7 < 0,001 0,5 ± 0,3 <0,01
3 сутки 21,1 ±0,5 >0,05 13,4 ± 1,3 <0,01 9,1 ± 0,7 >0,05 49,6 ± 5,3 <0,01 3,7 ± 0,2 <0,01
5 сутки 25,8 ± 1,1 < 0,05 15,3 ±0,5 <0,05 18,2 ± 1,5 <0,05 70,1 ±2,5 <0,05 3,5 ± 0,5 <0,01
7 сутки 27,1 ± 2,5 >0,05 25,3 ± 0,9 < 0,05 17,3 ±0,1 <0,05 65,7 ± 1,9 <0,05 2,5 ± 0,3 <0,05
10 сутки 23,5 ± 2,9 >0,5 20,1 ± 1,3 >0,05 12,3 ± 1,1 >0,5 61,9 ±3,1 >0,5 1,9 ±0,3 >0,5
вых клеток. При этом после кратковременного лейкоцитоза наблюдается депрессия лейкопоэза и снижение общего количества миелокариоцитов в костном мозге. Введение Г-КСФ при действии экстремальных факторов оказывает защитное действие на кроветворение. При этом стимулирующее влияние данного цитокина на пул мезенхимальных стволовых клеток носит, по-видимому, опосредованный характер. Его целесообразно использовать не только как фармакологический препарат при лечении лейкопении, лейкозов после химиотерапии или введения цитостатиков, но и как профилактическое средство лицам, подверженным частым стрессам и десинхронозам.
Литература
1. Абрамов, В.В. Возможные принципы интеграции иммунной и нейроэндокринной систем / В.В. Абрамов // Иммунология. -1996. - № 1. — С 60-61.
2. Влияние препарата «Граноцит» на мезенхимальные стволовые клетки костного мозга при моделировании вторичного иммунодефицита с помощью циклофосфана в эксперименте / А.Н. Байков,
В.П. Шахов, Н.Ю. Шелгаев, В.А. Серебрякова // Бюллетень сибирской медицины. — 2008. - Т. 7, № 3. - С. 5-8.
3. Влияние цитокинов и аутологичных моно-нуклеарных клеток костного мозга на процессы восстановительной регенерации при инфаркте миокарда / В.В. Рябов, В.А. Марков, Т.К. Суслова, Ю.С. Попонина, и др. // Сибирский медицинский журнал. - 2006. -№ 3. - С. 22-25.
4. Горизонтов, П.Д. Стресс и система крови / П.Д. Горизонтов, О.И. Белоусова, М.И. Федотова. -М., 1983.-240 с.
5. Дыгай, А. М. Роль межклеточных взаимодействий в регуляции гемопоэза / А. М. Дыгай,
B.П. Шахов. - Томск: ТГУ, 1989. - 224 с.
6. Кнорринг, Г.Ю. Цитокиновая сеть как мишень системной энзимотерапии /Г.Ю. Кнорринг // Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, № 4. -
C. 45-49.
7. Репин, B.C. Медицинская клеточная биология / B.C. Репин, Г.Т. Сухих. - М.: Медицина. -1998.-200 с.
8. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга и жировой ткани человека: получение, характеристика, возможности дифференцировки / Ю.А. Романов, А.Н. Даревская, Н.В. Мерзликина и др. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. -М3.- С. 158-163.
9. Селье, Г. Стресс без дистресса / Г. Селье. -М.: Прогресс, 1979. - 124 с.
10. Симбирцев, А. С. Цитокины: классификация и биологические функции / А. С. Симбирцев // Цитокины и воспаление. - 2004. - Т. 3, № 2. -
С. 16-22.
11. Судаков, К.В. Новые аспекты классической концепции стресса// Бюлл. экспер. биол. и мед. / КВ. Судаков. - 1997. - Т. 123, № 2. - С. 124-128.
12. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей / В.П. Шахов, И.А. Хлусов, Г.Ц Дамбаев и др.; отв. ред. В.В. Новицкий. - Томск: STT, 2004. - 386 с.
13. Ярыгин, КН. Роль резидентных и циркулирующих стволовых клеток в физиологической и репаративной регенерации / КН. Ярыгин // Патологическая физиология и экспериментальнапя терапия. - 2008. -№ 1. - С. 2-7.
14. Beyer, N. Mesenchymal stem cells: isolation, in vitro expansion and characterization / N. Beyer, S.L. Meirelles // Handb. Exp. Pharmacol. - 2006. -V. 174. -P. 249-282.
15. Coupling of endothelial injury and repair: an analysis using an in vivo experimental model /
S. Nogueras, A. Merino, R. Ojeda, J. Carracedo, M. Rodriguez, A. Martin-Malo, R Ramirez, P. Aljama // Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol - 2008. - V. 294. -М2.-P. 708-713.
16. da Silva, L.M. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells / L.M. da Silva, A.I. Caplan, N.B. Nardi // Stem Cells. - 2008. - V. 26, M9.-P. 2287-2299.
17. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche /
C. Lo Celso, H.E. Fleming, J. W. Wu et al //Nature. -2009. - V. 457. -P. 92-96.
18. Prophylactic granulocyte colony-stimulating factor and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor decrease febrile neutropenia after chemotherapy in children with cancer: A metaanalysis of randomized controlled trials / L. Sung, P.C. Nathan, B. Lange, J. Beyene, G. Buchanan // Journal of Clinical Oncology. - 2004. -V. 22, № 16. -P. 3350-3356.
19. Scadde, D.T. The stem-cell niche as an entity of action / D.T. Scadde // Nature. - 2006. - V. 441. -P. 1075-1079.
20. Detection of functional haematopoietic stem cell niche using real-time imaging / Y. Xie, T. Yin, W. Wiegraebe et al // Nature. - 2009. - V. 457. -P. 97-101.
Поступила в редакцию 20 апреля 2009 г.
