CC BY
28
Влияние препарата «Граноцит» на мезенхимальные стволовые клетки костного мозга при моделировании вторичного иммунодефицита с помощью циклофосфана в эксперименте
БайковА.НШахов В.П.2, Шелгаев Н.Ю.3, СеребряковаВ.А.1
Effectof Granotsit preparation on mesenchymal bone marrowstem cells in experimental model of secondary immunedeficiency with the aid of cyclophosphan
BaikovA.N,ShakhovV.P,ShelgaevN.Yu,Serebryakoa V.A.
1 Сибирскийгосударственныймедицинскийунивератет,г. Томск
2 Медицинааяпромы1шленнаякомпанш<<Электропульс>>,г. Томск
3 Челябинскийоблаатнойкожноеенерологическийдиспансер, г. Челябинск
© БайковА.Н., Шахов В.П., Шепгаев Н.Ю., Серебрякова В А.
Проведены опыты на 60 мышахлинии Balb/ обоего попа массой is—21 г. Все манипуляции, эвтаназия (эфиром)осуществпялись в рамках утвержденных правил проведения работ с использованием экспериментальныхживотных Мышей распределили на четыре группы по 15 животных В первой серии осуществляли введение физиологического раствора, во второй — циклофосфана, в третьей— препарата« Граноцит» (рекомбинантный гранулоцитарный котниестимулирук1Щ1йфактор) , в четвертой— циклофосфанаи препарата «Граноцит». Исследовали общее количестволейкоцитовв крови, клеточность костного мозга, содержания гранулоцитарномакрофагаль-ных колониеобразукшихклеток и мезенхимальныхпрекурсоров с помошьюкультуры ткани in vitro Установлено, что препарат «Граноцит» обладаетспособностьюстимулироватьмиелопоэз (прямоеспецифическоедействие, и мезенхимопоэз (непрямое, опосредованное действие, норме, При введении цитостатика исследуемый цитокин оказывает протекторноедействиепо отношениюкак к миелоидным, так и мезенхимальнымпрекурсорамкостного мозга.
Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, мезенхимопоэз, иммунсдефициты, гранулоцитарный котниеспимулирую-щий фактор.
Experiments with 60 male and female mice of Balb/c line with mass of 18 — 2 1 g have been carried out. All manipulations, i ncluding ether euthanasia, were performed within the framework of approved rules for experiments with experimental animals. The mice were divided into four groups each of 15 animals. The groups were injected with physiological salt solution (first group), cycliphosp ha n (second group), Granotsit preparation (recombinant granulocytic colony-stimulating ,actor) (third group), and cycliphosphan i n Granotsit preparation (fourth group). We have studied the total number of leucocytes in blood, bone marrow cellularity, content of granulocytic- macrophage colony-forming cells and mesenchymal precursors with the aid of tissue culture i n vitro. I t has been found that the Granotsit preparation can stimulate myelopoiesis (direct specific action) and mesenc hy mopo iesis (indirect action) i n norm. When a cytostatic agent, the studied cytokine has a protective action on both myeloid and mesenchymal precursors of bone marrow.
Keywords: mesenchymal stem cells, mesenchymopoiesis, immune defficiency, granulocytic colony-stimulating ,actor.
УДК616.419013.395:615.37:616.15].С8
Введение
Вторичные иммунодефициты (ВИД)у детей и взрослых встречаются гораздо чаще, чем первичные) Патогенез ВИД сложен и разнообразен) они могут вызываться различными факторами: вирусными и бактериальными инфекциями) влиянием цитостатиков, гормонов, действием ионизирующей радиации) стресса) злокачественными новообразовани-
ями, патологией обмена веществ, беременностью и т.п. [1, 4, 9]. Часто мишенью выступают плюрипотентные гемопоэ-тические стволовые клетки (ПГСК) ) из которых образуются как миелоидные, эритроидные, мегакариоцитарные, так и лимфоидныеэлементы [7]. Процессы пролиферации и диф-ференцировки ПГСК контролируются гемопоэзинщуцирук-щим микроокружением (ГИМ) [6, 7]. В построении ГИМ
БайковА.Н.ЩсховВЛ.,ШелгаевНЮ.,СеребряковаВА.
большую роль играют мезенхимальные стволовые клетки (МСК) [7, 11]. Поражение МСКприводитк поломкеструктуры и функции ГИМ. В результате этого процесса может произойти нарушение продукции как лимфоидных, так и ми-елоидныхклетокс последующимразвитием ВИД)
В настоящее время практически отсутствуют патогенетически обоснованныеметоды коррекции поврежденийсо стороны МСКи ГИМ ) В связи с этим болышойинтереспредставпяют работы, связанные с использованием цитокинов, в частности гранулоцитарного колшиестимутрующего фактора (Г-КСФ) , при лечении миелодепрессорн^1хсостояний ) вызванныхоблу-чением) действием цитостатиков при лечении онкологических заболеваний [з, 12]. Однако большинство исследований направлено на изучение протекторного действия Г-КСФ на стволовые клетки белого ростка крови. В них не определяли способность данного цитокина регулировать морфофункци-ональные свойства МСК. О потенциальной возможности действия Г-КСФ на мезенхимопоэз свидетельствует тот факт, что его введение приводит к мобилизации МСК из костного мозга в кровь [з]. Тем не менее вопрос о том, обладает ли данный фактор способностью активировать МСК костного мозга при развитии ВИД) остается открытым )
В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение изменений, происходящих со стороны пула МСК костного мозга при моделировании вторичных и ммуно дефицитных состояний с помощью цитостатика — цикло-фосфана)
Материал и методы
Опыты были проведены на 60 мышахлинии Baib/ь обоего пола массой 18—21 г в осенне-зимний период, в утренние часы для уменьшения влияния суточных и сезонных колебаний) Передначапомисспедованийвсе животныепроходили 2-недельный карантин. Содержание мышей, все манипуляции) эвтаназия (эфиром) осуществлялись в рамках утвержденных правил проведения работ с использованием эксперименталь ныхживотных
Животнькраспредепяпи по следующимсериям) 1 -я группа (контрольная)— мыши) получавшие в течение 4 сут физиологический раствор ( 15 животных)) 2-я — животные, которым подкожно вводили препарат «Граноцит» («Aventis Pharma Spécialités for Nycomed», Франция) (рекомбинантный человеческий Г-КСФ) в дозе 1 о мкг/кг массы тела в течение 4 сут (15 особей) ; з-я — мыши с ВИД) вызваннымоднократ-ным внутрибрюшинным введением циклофосфана (ОАО «Биохимик», Россия) в дозе 100 мг/кг массы) тела (15 животных)) 4-я — животные) получившиеоднократнуюинтраперито-
Влияние препарата«Граноцит»...
неальную инъекцию циклофосфана в дозе 100 мг/кг массы тела с последующим подкожным введением препарата «Граноцит» в дозе 10 мкг/кг массы тела в течение 4 сут (15 мышей) . На каждую точку приходилось по з животых в каждой серии экспериментов.
Дозы. циклофосфана (ЦФ ) и граноцита были подобраны. на основании предварительные исследований и данныхли-тературы. [з, 7].
Общее количество лейкоцитов в периферической крови и клеточность костного мозга определяли по описанному Е.Д. Гольдбергом и соавт. меланжерному методу в камере Горяева [2].
Жизнеспособность клеток исследовали с помощью метода включения в клетки 0,1%- го раствора трипанового синего на 200 кариоцитах в камере Горяева («Sigma», США)
[2].
Культивирование гранулоцитарномакрофагальны1х ко-лониеобразующихединиц (ГМ-КОЕ) (клетоклредшественни-ков миелопоэза) производили по методу T.R. Bradley, D. Metca if [10] в модификации В.П. Шахова и соавт. [8]. Клетки костнюго мозга вымывали из бедренной кости 1—2 мл среды. McCoy's 5A («Sigma », США) в асептических условиях. Материал ресуспендировали и осторожно наслаивали на з мл раствора гистопака («sigma») р = 1,077 г/мл) , налитого в стерильную центрифужную пробирку. Клетки подвергали градиентному центрифугированию при 1 500 об/мин в течение 30 мин. Образовавшееся интерфазное кольцо, состоящее из мононуклеаров . собирали и еще два раза центрифугировали в среде McCoy's 5A для очистки от гистопака. Количество жизнеспособных клеток доводили до 5 • 10 5/мл в полной питательной среде, содержащей 20% эмбриональ ной телячьей сыворотки (ЭТС. («sigma»), 78,7% среды1 DI -mem, 1 % 100х раствора пенициллина, стрептомицина и l-глютамина («Sigma »), 5 • 10-5 моль 2-меркаГГГОЭтанопа (««Merck», Германия). 10 мкг/л рекомбинантного человеческого гра-нулоцитарного колониестимулирующего фактора ( препарат «Граноцит»). Затем добавляли 0,3%-й раствор бактоагара («Difco », США), охпlажденныlй до 40 °С. Материал быстро перемешивали и разливали в 12-луночные гпоскодонныlе планшеты фирмы «Costar» по 0,5 мл. После гелификацииага-ра в каждую ячейку добавляли 0,5 мл полной среды. Затем планшеты. помещали в СО-инкубатор (СО 5%, 37 °С, влажность 100%). Через 6—7 сут материал извлекали и с помощью инвертоскопа «Opton» (Германия) подсчитывали число образовавшихся ГМ-КОЕ. кпегочныхагрегатюв, содержащихбо-лее 50 кариоцитов. В контрольнойсерии Г-КСФ в культуру не добавляли.
изводили смену купьтурагьной среды. На 12—14-е сут подсчитывали число образовавшихся клонов — клеточных агрегатов, содержащих более 50 клеток. Часть материала окрашивали после фиксации метанолом азур-i -эозином для определения морфологии клеток (Новицкий В.В. и соавт., 2004). Для изучения прямого действия Г-КСФ на МСКв полную культуральнуюсредуна з-и сут после удаления неадгезирующих клеток добавляли препарат «Гра-ноцит» в дозахо, 50, 100, 150, 200 мкг/л.
Статистическую обработку осуществляли с помощью критерия Манна—Уиттни, определяли выборочное среднее значением, ошибку среднего m, уровень значимости pu, используя программ^а^^са 6.
Результаты и обсуждение
В результате проведенныхисследований было установлено, что введение циклофосфана приводит к угнетению миело- и мезенхимопоэза, снижениюобщего количества ми-елокариоцитов, ГМ-КОЕ и МСК в костном мозге и развитию лейкопении в периферической крови. Эти факты! свидетельствуют о том, что под действием цитостатика у животных формируется вторичный иммунодефицит (табл. 1, 2),
Введение Г-КСФ в течение 4 сут сопровождается выраженной стимуляциейбелого ростка крови как на уровне грану лоцитфномакрофагаль-ыхпрекурсоров, так и кариоцитовв костном мозге и периферической крови, что согласуется с даннымидругихавторов [з, 12].
Таблица i
Содержаниелейкоцитов в периферическойкрови, ОКК, ГМ-КОЕ и МСК в костноммозгемышей линии Balb/c после введения препарата «Граноцит» (Г-КСФ), циклофосфана, циклофосфана и препарата«Граноцит» (Х ± m)
Показатель Контрольная группаживотных, без примененияГ-КСФ 1- Ш т 4-е сут 6-е сут 10-есут 14-есут
Лейкоциты, • 09/П:
Г-КСФ 12 81 ± 0,30 12 ,73 ± 0 ,20 15 ,85 ± 0,41* 20 17 ± 0,45* 16 ,15 ± 1, 1 4* 11 90 ± 1,60
ЦФ 12 81 ± 0,30 7 ,79 ± 2 33 3 ,57 ± 0,21* 6 00 ± 0,43* 7 ,63 ± 0 23* 10 ,88 ± 0,91
Г-КСФ и ЦФ 12 81 ± 0,30 5 ,55 ± 1, 91* 15 ,83 ± 0,45* 10 59 ± 1,35 11 ,27 ± 0 75 11 10 ± 0,71
ОКК, 10 6:
на бедро+ Г-КСФ 19 53 ± 0,51 19 ,77 ± 0 ,35 22 ,65 ± 0,33* 24 00 ± 1,22* 23 ,91 ± 0 53* 21 10 ± 1,00
на бедро+ ЦФ 19 53 ± 0,51 4 ,12 ± 0 ,33* 6,00 ± 0,44* 6 83 ± 0,59* 10 ,11 ± 0 ,63* 15 30 ± 2,50
на бедро + Г-КСФ+ ЦФ 19 53 ± 0,51 10 ,92 ± 0 ,33* 15 ,57 ± 3,95 17 17 ± 0,75 16 ,93 ± 2 ,15 18 ,30 ± 0,71
ГМ-КОЕ, • 105
на бедро + Г-КСФ 35 ,11 ± 2,62 39 ,18 ± 3 35 65 ,89 ± 2,93* 46 25 ± 2,53* 34 81 ± 1 75 36 73 ± 2,2 1
на бедро + ЦФ 35 ,15 ± 2,68 11 ,19 ± 3 15* 16 ,37 ± 2,69* 17 93 ± 1,8 5* 27 ,53 ± 5 93 30 31 ± 1,41
на бедро + Г-КСФ+ ЦФ 35 ,15 ± 2,60 13 ,77 ± 3 63* 27 ,95 ± 3,05 31 57 ± 1,14 30 ,33 ± 2 79 37 ,90 ± 3,30
МСК, • 10 6:
на бедро + Г-КСФ 11 44 ± 0,65 9 ,93 ± 1, 57 14 ,35 ± 0,37* 15 15 ± 0,59* 13 ,35 ± 1, 37 12 ,91 ± 0,31
на бедро + ЦФ 11 45 ± 0,68 10 ,81 ± 0 ,55 9 ,74 ± 0,50* 7 83 ± 0,41* 9 ,40 ± 0 53* 10 71 ± 0,50
на бедро + Г-КСФ+ ЦФ 11 41 ± 0,61 9 ,59 ± 0 ,37 8 ,40 ± 2,46 10 68 ± 0,93 12 ,00 ± 0 69 10 50 ± 0,31
* fPj < 0,05.
Таблица 2
Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга исследовали по методу А.Я. Фриденштейна и Е.А. Лурие [6, 8] с некоторыми модификациями. Так, 1 мл полной питательной среды с помощью шприца из бедренной кости вымывали клетки костного мозга, ресуспендировали на льду. Полная питатепьнаясредасодержаг1а10% ЭТС («sigma»), 90% средь. d -mem с низким содержанием глюкозы, 200 ммоль l -глюта-мина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (все реактивы фирмы «sigma »). Конечную концентрацию жизнеспособных кариоцитов доводили до 1 • 10 6/мл, разливали в культуральные флаконы фирмы «Falcon » по 5 мл и помещалив CQ-инкубатор (CQ 5%, 37 °С, влажность 00%). Через з сут неадгезирующие клетки удаляли и заменяли 5 мл полной культуральнойсреды новой порцией. Спустяеще 5 сут про-
БайковА.Н.ЩаховВЛ.,ШелгаевНЮ.,СеребряковаВА.
Влияние препарата«Граноцит».
Количество колоний,выросшихиз мезенхимальныхстволовых клеток костного мозга интактныхмышей линии Balb/c при добавлении к культуре in vitroпрепарата«Граноцит» (Г-КСФ) (Х± m)
Граноцит. мкг/мл МСК Pu
0 11,41 ± 0,61
50 10,93 ± 0,69 <0,05
100 12,17 ± 0,75 <0,05
1 50 10,85 ± 0,89 <0,05
200 11,53 ± 0,75 <0,05
П р и м е ч а н ие. pu определяли по отношению к культуре МСК без добавленияпрепарата« Граноцит».
Интересно, что данный цитокин оказывает влияние не только на костномозговой пул миелоидных клетоклредше-ственников, но и мезенхимальныестволовые клетки, для которых, согласно общепринятым взглядам, он не является специфическимцитокином (см, табл. 1) [7, 8].
При этом установлено, что Г-КСФ оказывает свое сти-мулирующеевлияние на мезенхимопоэз не прямо, а опосредованно, так как добавление его непосредственно в культуру ткани in vitгоне приводит к усилению роста мезенхималь-ных колоний (табл, 2). Возможно, что данный эффектсвязан с тем, что часть МСКпри введении Г-КСФ покидаеткостный мозг [з]. При этом образовавшиеся свободные ««ниши» для мезенхимальныхстволовыхклеток через цитокиновуюсеть, интегрины, адгезины, элементы экстрацеллюлярного мат-рикса и другие факторы стимулируют образование новых МСК, Не исключено, что в данном процессе могут принимать участие и другие механизмы, например аутокринные и (или, паракринные [з, 5].
Обнаружено, что препарат « Граноцит» обладает способностью не только корригировать нарушениясо стороны лейкопоэза при моделировании ВИД с помощью циклофосфана, но и нормализовать уровень ГМ-КОЕ и МСК в костном мозге начиная с 4-х сут опыта (см, табл. 1). В свою очередь, репарация поврежденных МСК может сопровождаться реконструкцией гемопоэзиндуцирующего микроокружения, которое, как известно, страдает при действии ци-тостатиков [6, 7]. Восстановление ГИМ, очевидно, должно
способствовать регенерации ГМ-КОЕ через элементы экс-трацеллюлярногоматрикса костного мозга.
Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что препарат «Граноцит» (рекомби-нантный Г-КСФ) обладает способностью стимулировать ми-елопоэз (прямоеспецифическоедействие, и мезенхимопоэз (непрямое, опосредованное действие) у здоровых животных. При введении цитостатика Г-КСФ оказываетпротектор-ное действие как на миелоидные, так и мезенхимальные клетки-предшественники костного мозга.
Литература
1. ВолковА.Г, ТрофименкоС.Л. Клинические проявления вторичного иммунодефицита при заболеваниях ЛОРорганов: Рууко-водстводля врачей. Элиста. Джангар, 2007. 176 с.
2. ГольдбергЕ.Д, Дьгай А.М,ШаховВ.П. Методы культуры! ткани в гематологии . Томск. ТГУ, 1992.
3. КозловВ.А. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. физиологическая активность, патофизиологические и терапевтические проблемы. // Цитокины. и воспаление. 2004. Т. з. № 2.
С. 3—15.
4. МашковакийМ.Д Лекарственные средства. Минск: Беларусь,
1987. Т. 2. С. 384—387.
5. СимбирцевА.С. Цитокины: классификация и биологические функции//Цитокины. и воспаление. 2004. Т. з. № 2. С. 16—22.
6. ФриденштейнА.Я, ЛуриеЕ.А. Клеточные основы. кроветворного микроокружения. М.: Медицина. 1980. 213 с.
7. ЧертковИ.Л.,ФриденштейнА.Я. Клеточные основы1 кроветворного микроокружения. М.: Медицина. 1977. 272 с.
8. ШаховВ.П.,ХлуаовИ.А,ДамбаевГ.Ц. и др. Введение в методы. культуры. клеток, биоинженерииорганов и тканей / Отв. ред. В.В. Новицкий. Томск. stt, 2004. 386 с.
9. ШиринакийВ.С., СтароатинаН.М., СенниковаЮ.А, Малыше ваО.А. Проблемы диагностики и классификации вторичных иммунсдефицитов // Аллергология и иммунология. 2000. Т. 1. № 1. С. 62 — 70.
10. BradleyT.R, MetcalfD. // j. Exp. Biol. Med. sci. 1966. v. 44.
P. 287—300.
11. CongetP.,GordonS. Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells //J. Cell. Physiol. 1999. № 181. P. 67—73.
12. MetcalfD. The hemopoietic colony stimulating factors. Amsterdam , Elsevier. 1977. 420 p.
Поступилав редакцию19.06.2007 г.
Сведенияоб авторах
A.Н. Байков— д-р мед. наук, профессор, директор ЦНИЛ СибГМУ(г. Томск).
B.П. Шахов— д-р мед. наук, профессор, медицинская промышленнаякомпания«Электропульс» (г. Томск). Н.Ю. Шелгаев— врач, Челябинскийобластной кожно-венерологическийдиспансер (г. Челябинск).
В.А. Серебрякова— канд. мед. наук, докторант кафедры патофизиологии СибГМУ(г. Томск). Для корреспонденции
БайковАлександрНиколаевич тел. (3822) 52-73-99.
