CC BY
31Стационарная кинетика индивидуального и совместного окисления фенотиазинов в присутствии пероксидазы хрена
Рогожина Т.В., Рогожин В.В. fvrogozhin@mail.ru )
Якутская государственная сельскохозяйственная академия
Трифтазин (ТФ) и тиопроперазин (ТП) относятся к нейролептическим препаратам. Основной особенностью препаратов этой группы является их седативное, успокаивающее действие при аффективных расстройствах и состояниях возбуждения. Они оказывают также антипсихотическое действие, снимая или уменьшая бред, галлюцинации, психические автоматизмы [1].
Трифтазин по седативному эффекту более активен, чем аминазин (АМ), является одним из наиболее активных нейролептических средств. Оказывает сильное противорвотное действие. Сравнительно с аминазином вызывает слабый адренолитический эффект. Меньше потенцирует действие снотворных средств, не обладает противогистаминной, спазмолитической и противосудорожной активностью. По химическому строению отличается от аминазина тем, что вместо атома хлора в положении 2 фенотиазинового ядра содержит группу CF3, а в боковой цепи - ядро пиперазина, замещенное при атоме азота в положении 4 группой ОИз [1,2].
У тиопроперазина в положении 2 фенотиазинового ядра в отличии от трифторметильной группы трифтазина располагается диметилсульфамидная группа. Тиопроперазин оказывает сильное противорвотное действие, обладает относительно слабым седативным эффектом, мало влияет на вегетативную нервную систему. Препарат преимущественно назначается при различных формах шизофрении [1]. Действие аминазина обусловлено его влиянием на биохимические системы мозга; он понижает чувствительность адренореактивных систем гипоталамуса и ретикулярной формации мозга к действию норадреналина.
Углубляет и пролонгирует действие гексенала, тиопентала, морфина, промедола, фенадона [3].
Ультрафиолетовые спектры 10-алкилпроизводных фенотиазина в этаноле имеют по два максимума поглощения в области 290-330 нм; у 10-ацилпроизводных наблюдается гипсохромное смещение обоих максимумов [4].
Производные фенотиазина легко окисляются кислородом воздуха. Реакции эти в большинстве своем мало специфичны и почти не изучены. Предполагается, что при окислении продукты реакции имеют нестабильную розовую окраску за счет окисления атома серы, а также за счет окисления ядра фенотиазина в положении 3 и 6. В зависимости от характера окислителя и условий выполнения реакции образуется смесь продуктов окисления, например 9^-оксид и 9,9-диоксид [2].
Пероксидазное окисление трифтазина и тиопроперазина не изучено. Возможно, что исследование этого процесса позволит разобраться в динамике их превращений в живых организмах и раскрыть особенности специфичного действия препаратов фенотиазинового ряда.
Целью данной работы являлось исследование кинетических характеристик трифтазина и тиопроперазина, как медленно окисляемых субстратов пероксидазы хрена, в стационарных условиях в широком диапазоне рН, а также изучение их влияния на окисление быстро окисляемого субстрата пероксидазы о-дианизидина (ОДН).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реактивы. В работе использовали пероксидазу хрена производства "Reanal" (Венгрия) со спектральным показателем чистоты RZ=1.0. Концентрацию фермента определяли спектрофотометрически при 403 нм (s=100 мМ-1 см-1 [5]) и по пиридингемохромогену [6]. Использовали аминазин, трифтазин и тиопроперазин ("Specia", Франция); их концентрацию определяли пользуясь молярным коэффициентом поглощения при 254 нм 29 мМ-1см-1, при 257 нм
28 мМ-1 см-1 и при 265 нм 39 мМ-1 см-1 соответственно. о-Дианизидин марки ч. очищали возгонкой в вакууме. Концентрацию перекиси водорода ("Реахим", Россия) определяли спектрофотометрически, используя молярный коэффициент поглощения при 230 нм 72,7 М-1 см-1 [7].
Методы. Реакцию окисления аминазина (14-112 мкМ), трифтазина (8,333,4 мкМ) или тиопроперазина (9,0-21,5 мкМ) перекисью водорода (0,64 мМ) проводили при 25° в среде 0,1 М натрий-ацетатного, рН 4,5-6,0, или 0,1 М Tris-НС1, рН 6,5-8,0, буферов объемом 2,5 мл при концентрации пероксидазы хрена 20-280 нМ. Окисление аминазина, трифтазина и тиопроперазина регистрировали по уменьшению поглощения на 254, 257 и 265 нм соответственно. Окисление о-дианизидина регистрировали по возрастанию поглощения при 460 нм (е=30 мМ-1см-1 [8]). Кинетические кривые снимали на двухлучевом спектрофотометре БМБ 100 Б фирмы Varian (США). За единицу активности фермента принимали его количество, окисляющее 1 мкмоль субстрата (аминазин, трифтазин, тиопроперазин или о-дианизидин) за 1 мин.
Кажущиеся константы скорости окисления субстратов пероксидазы определяли из данных по стационарной кинетике [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 показаны спектры трифтазина и тиопроперазина в 0,1 М натрий-ацетатном буфере при рН 4,5. Видно, что в спектрах производных фенотиазина проявляются три выраженных максимума поглощения в УФ- области (ТФ - 215, 257, 310 нм; ТП - 235, 265, 310 нм). В процессе пероксидазного окисления в спектре поглощения трифтазина появляются три максимума поглощения при 232, 303, 350 нм, а тиопроперазина - 243, 305, 355 нм. В течение первых минут проведения реакции спектры трифтазина и тиопроперазина изменялись -максимумы поглощения при 257 и 265 нм полностью исчезали. Поэтому определение скорости пероксидазного окисления трифтазина и тиопроперазина в присутствии пероксидазы хрена проводили, регистрируя уменьшение
Длина волны, нм
Рис. 1. Спектры поглощения трифтазина (а), тиопроперазина (б) и продуктов их пероксидазного окисления в 0,1 М натрий-ацетатном буфере, рН 4,5. Время реакции, мин: 1-0, 2-1,5, 3-3,5, 4-6,5, 5-19,5 (трифтазин); 1-0, 2-2,0, 3-5,5, 4-10,5, 5-37,0 (тиопроперазин). Концентрации: трифтазин - 17,4 мкМ; тиопроперазин -19,0 мкМ; пероксидаза - 30,0 нМ; перекись водорода - 0,64 мМ.
поглощения светопоглощения для трифтазина при 257 нм, а тиопроперазина - при 265 нм. В отсутствие фермента реакции не наблюдались.
В стационарных условиях начальная скорость пероксидазного окисления трифтазина и тиопроперазина подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен.
На рис. 2 показаны зависимости начальных скоростей пероксидазного окисления о-дианизидина в присутствии различных концентраций тиопроперазина. Графики в двойных обратных координатах при рН 4,0-5,5 имели вид параллельных прямых, что указывает на бесконкурентный или антиконкурентный характер ингибирования, различить которые можно построением в координатах Диксона [9]. Линеаризация в координатах Диксона свидетельствовала об антиконкурентном типе ингибирования. Величины константы ингибирования в зависимости от рН изменялись от 0,98 до 2,08 мМ. При рН 6 и выше наблюдалось последовательное окисление субстратов, причем вначале окислялся тиопроперазин, а затем происходило окисление о-дианизидина.
Показано, что в исследуемом диапазоне рН трифтазин не оказывал влияния на пероксидазное окисление о-дианизидина. При рН 4,5-7,5 окисление о-дианизидина и аминазина протекает последовательно. Причем вначале преимущественно окисляется аминазин, а затем начинает окисляться о-дианизидин. Последовательность реакций, по-видимому, задается доступностью функциональных групп аминазина к каналам электронного транспорта активных центров окисленных форм пероксидазы (Е1 и Е2).
Реакции пероксидазного окисления трифтазина и тиопроперазина характеризуются низкими значениями каталитических констант 0,3-124 и 0,129,8 с-1 соответственно, что позволяет отнести их к группе медленно окисляемых субстратов пероксидазы, таких как КЛОН [10] и ферроцианид калия [11].
На основании полученных данных индивидуальное окисление трифтазина и тиопроперазина можно описать следующей схемой 1.
16 -
12 -
8-
4
4
3 2 1
6
8
10
ОДН
12
, мМ-1
Рис.2. Зависимости начальной скорости пероксидазного окисления о-дианизидина от его концентрации, в двойных обратных координатах, при различных концентрациях тиопроперазина, мМ: 1-0, 2-0,45, 3-0,90, 4-1,35; пероксидаза - 0,14 нМ; перекись водорода - 0,64 мМ; 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,5.
Е + Н2О2 - Е1
S
E1 + S
Ï1-S
Eo
Р
: e2-s
E
Р
схема 1
E, E1, E2 - пероксидаза и ее окисленные формы; S - трифтазин или тиопроперазин; E1-S, E2-S - комплексы окисленных соединений пероксидазы с медленно окисляемыми субстратами.
1
Величины Кт для трифтазина и тиопроперазина мало различаются и составляют соответственно 10-330 и 22-196 мкМ в зависимости от рН. Значения Кт трифтазина и тиопроперазина при рН>6,0 примерно такие же, как у о-дианизидина [8].
Из рН-зависимостей \gkcat и ^кшГ/Кт реакций пероксидазного окисления трифтазина (рис. 3) и тиопроперазина (рис. 4) определяются ионогенные группы с рК 4,89, 5,64 и 5,43, 4,71 соответственно, депротонирование которых ухудшает каталитический процесс пероксидазного окисления соответственно трифтазина в 413 раз, а тиопроперазина в 82 раза. Аналогичные ионогенные группы была выявлены в реакциях пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты [12] и п-аминобензойной кислоты [13].
При значениях рН>6,0 имеет место отклонение опытных кривых рН-зависимостей для ^кш/Кт от теоретической для реакций пероксидазного окисления трифтазина и тиопроперазина, что, возможно, вызвано проявлением действия еще одной ионогенной группы свободного фермента, принимающей участие в связывании субстрата. Влияние аналогичной группы было выявлено в реакциях пероксидазного окислении о-дианизидина в работе [8].
В отличие от аминазина [14], у трифтазина и тиопроперазина, с увеличением рН Кт понижается. В кислых рН (4,5-5,5) трифтазин окисляется быстрее аминазина в 1,5-3 раза и в 9-12 раз эффективнее тиопроперазина. Константа Михаэлиса трифтазина в 2-2,5 раза больше, чем у аминазина и в 1,5-3,5
(N
О
M
Jg
VO
+
M
ад
О
ад
4н
^ 3-
2
Ц 1
0-
-1
3
2
1
8
pH
Рис. 3. рН-Зависимости lgkcat (1), lgKm (2) и lgkcaf/Km (3) для реакций пероксидазного окисления трифтазина. Пунктирные кривые рассчитаны с
использованием значений рКа=4,89, kcat(iim)=129 c-1; pKa=5,64, (kcat/Km)lim=51,8-104 c
1M-1.
4 п
3
+ 2
1
0
1
2
3
8
pH
Рис. 4. рН-Зависимости (1), ^кшГ/Кт (2) и ^кшГ (3) для реакций
пероксидазного окисления тиопроперазина. Пунктирные кривые являются теоретическими для рК=5,43, kCat(\im)=12,9 с-1; pKa=4,71, (kCat/Km)\im=30,5•104 с-1М-1.
раза - тиопроперазина. Однако при рН>6,0 Km трифтазина и тиопроперазина понижаются и становятся соизмеримы с Km для быстро окисляемого субстрата пероксидазы - о-дианизидина [15].
Пероксидазное окисление о-дианизидина достаточно хорошо изучено Лебедевой и Угаровой [8]. Показано, что индивидуальное окисление о-дианизидина протекает через образование фермент-субстратного комплекса, в котором предполагается комплексообразование E2 с радикалом полуокисленного субстрата о-дианизидина. Из рН зависимости каталитических констант (lgkcat, lgKm), определяется ионогенная группа в активном центре фермента с рК 6,5, депротонирование которой уменьшает kcat в 60 раз. Предполагают, что такой группой может быть имидазольная группа гистидина [16] или карбоксильная группа [17]. По-видимому, аналогичная группа проявляется в катализе медленно окисляемых субстратов пероксидазы трифтазина и тиопроперазина.
В биологических системах вероятнее всего протекают реакции совместного окисления субстратов пероксидазы. Экспериментами in vitro показано [18], что при совместном окислении различных субстратов пероксидазы наблюдаются эффекты взаимной активации и ингибирования. При этом ингибирование либо имеет конкурентный характер, либо связано с дифференцированным окислением субстратов в присутствии пероксидазы. Тогда как субстрат-субстратная активация сопровождается ускорением окисления медленно окисляемого субстрата быстро окисляемым. Изучение этих механизмов позволяет разобраться в сложном и до сих пор мало изученном механизме действия пероксидазы хрена.
Известно, что при совместном окислении о-дианизидина и ферроцианида калия, окисление последнего осуществляется не свободным радикалом о-дианизидина, а комплексом пероксидазы с полуокисленным субстратом. Несколько иной механизм наблюдается при совместном окислении о-дианизидина и гидрохинона [19]. Гидрохинон и о-дианизидин могут конкурировать за место связывания в активном центре фермента. Предварительное связывание о-
дианизидина улучшает последующее связывание гидрохинона, ускоряя процесс его пероксидазного окисления. При этом окисление о-дианизидина не происходит до полного окисления гидрохинона.
Широкая субстратная специфичность пероксидазы, по-видимому, обусловлена возможностью реализации ферментом нескольких различных каналов электронного транспорта с субстратов, контактирующих с поверхностью белковой глобулы, на железо гема [18]. Причем субстраты пероксидазы можно поделить на две группы: доноры электронов и доноры атома водорода. В первую группу входят ферроцианид-, сульфит-, нитрит-, тиоцианат-ионы и органические молекулы - НАДН [10], аскорбиновая кислота [12], аминазин [14], а во вторую -фенолы, амины и другие органические соединения [18]. Поэтому при совместном окислении быстро окисляемого субстрата пероксидазы (о-дианизидин) с медленно окисляемыми субстратами (аминазин, трифтазин и тиопроперазин) могут реализоваться различные пути переноса электронов [18].
Низкие константы скорости окисления фенотиазинов, возможно, как в случае с НАДН и аскорбиновой кислотой, в первую очередь обусловлены тем, что их окисление пероксидом водорода, протекает по одноэлектронному механизму, аналогично окислению неорганических субстратов пероксидазы. Поэтому при совместном окислении о-дианизидина и различных фенотиазинов, фермент реализует различные пути переноса электрона с окисляемого субстрата, выбор которых определяется доступностью функциональных групп субстрата каналам переноса электронов на поверхности белковой глобулы. Среди изученных фенотиазинов расположение функциональных групп аминазина, обеспечивает его преимущественное пероксидазное окисление по сравнению с о-дианизидином. При этом вначале полностью окисляется аминазин, а уж затем протекает реакция пероксидазного окисления о-дианизидина. В кислых рН тиопроперазин и о-дианизидин могут одновременно связываться в активном центре пероксидазы. Причем связывание тиопроперазина улучшает последующее связывание о-дианизидина, но замедляет скорость его пероксидазного окисления, что
проявляется в антиконкурентном типе ингибирования. При этом тиопроперазин связывается только с фермент-субстратным комплексом, и не связывается со свободным ферментом [9]. С возрастанием рН происходит депротонирование одной из функциональных групп активного центра фермента и это способствует переключению механизма переноса электронов с донора водорода о-дианизидина, на преимущественное окисление донора электронов -тиопроперазин.
Для объяснения кинетики ингибирования пероксидазы тиопроперазином в реакции окисления о-дианизидина может быть предложена схема 2.
Е + Н2О2 - Е1
Е1 + =Е1-& -Е2-Р' -Е + Р1
К I I Б2
^-Егй]
схема 2
и - о-дианизидин и тиопроперазин соответственно; Е1-Б1, Е2-Р' - комплексы окисленных соединений пероксидазы с о-дианизидином; 82-Е1-81 - комплекс пероксидазы с субстратами.
Противоположный эффект возникает при совместном окислении о-дианизидина и трифтазина. Последний возможно и связывается в активном центре фермента, однако его окисление не происходит, поскольку реализуется механизм окисления донора водорода - о-дианизидина.
Значение выявленных особенностей пероксидазного окисления фенотиазинов позволяет высказать предположения о возможных сроках нахождения фенотиазинов в организме человека, а также дать предположительную оценку эффективности их действия. Среди изученных фенотиазинов выраженное седативное действие трифтазина можно объяснить за счет того, что поскольку он в присутствии быстро окисляемого субстрата не окисляется пероксидазой, то он должен дольше сохранять свое функциональное
действие. Быстрее всех в организме может окисляться аминазин и его действие должно быть за счет этого не продолжительным.
ЛИТЕРАТУРА
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.:Медицина, Т.1, 1972.-С.40-57.
2. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. М.:Высш. школа, 1985.-768 с.
3. Черняков Д.К., Евдокимов П.Д., Вишкер А.С. Лекарственные средства в ветеринарии. М.:Колос, 1977.-496 с.
4. Азамасцев А.П., Яскина Д.С. Ультрафиолетовые и инфракрасные спектры лекарственных веществ. М.:Наука, 1975.-340 с.
5. Ogewa S., Shira Y., Morishima I. Calcium binding by horseradish peroxidase C and the heme enviromental structure.//Biochem. Biophys. Res. Commun.-1979.-V.90.-N2.-P.674-678.
6. Falk J.E. Porphyrins and Metalloporphyrins.//Amsterdam.-N.Y.-London etc.: Elsevier, 1964. 236 p.
7. George P. The chemical nature of the second hydrogen peroxide compound formed by cytochrome C peroxidase and horseradish peroxidase:-.Titration with reducing agents.//Biocem. J.-1953.-V.54.-N2.-P.267-276.
8. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена.//Биохимия.-1977.-Т.42.-№ 8.-C.1372-1379.
9. Березин И.В., Клесов А. А Практический курс химической и ферментативной кинетики, М.:МГУ, 1976. 320 с.
10. Лебедева О.В., Угарова Н.Н. Стационарная кинетика реакции окисления NADH пероксидом водорода в присутствии пероксидазы хрена//Биохимия.-1997.-Т.62.-№ 2.-C.249-253.
11. Угарова Н.Н., Лебедева О.В., Курилина Т.А., Березин И.В. Влияние нуклеофилов на кинетику реакций окисления, катализируемых пероксидазой// Биохимия.- 1977.- Т.42.-№ 9.-C.1577-1584.
12. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Аскорбиновая кислота - медленно окисляемый субстрат пероксидазы хрена//Биохимия.-1997.-Т.62.-№ 12.-C.1686-1690.
13. Dunford H.B., Stillman J.S. On the function and mechanism of action of peroxidase//Coord. Chem. Rev.-1976.-V.19.-N 3.-P.187-251.
14. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика пероксидазного окисления 2-хлор-10-(3-диметиламинопропил)-фенотиазина в присутствии пероксидазы хрена//Биохимия.-1998.-Т.63.-№ 5.-C.661-666.
15. Угарова Н.Н., Лебедева О.В., Савицкий А.П. Пероксидазный катализ и его применение. М.:МГУ, 1981. 92 с.
16. Jamada H., Makino R., Jamasaki J. Effect of 2,4-substituents of deuteroheme upon redox potentials of horseradish peroxidases//Arch. Biochem. and Biophys.-1975.-V.169.-P.344-353.
17. Кутузова Г.Д., Рогожин В.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. Фунционально важные карбоксильные группы пероксидазы хрена// Докл. АН СССР.-1983.-Т.270.-№ 4.-С.994-998.
18. Лебедева О.В., Угарова Н.Н. Механизм пероксидазного окисления. Субстрат-субстратная активация в реакциях, катализируемых пероксидазой хрена//Известия РАН. Сер. химическая.-1996.-№ 1.-C.25-32.
19. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного пероксидазного окисления гидрохинона и о-дианизидина в присутствии пероксидазы хрена//Биохимия.-1999.-Т. 64.-№ 2.-С. 219-224.
