Физиолого-биохимические механизмы формирования гипобиотических состояний высших растений Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Сибирское отделение Сибирский институт физиологии и биохимии растений

На правах рукописи УДК 581.1:547.281.2+577.1

РОГОЖИН Василий Васильевич

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ГИПОБИОТИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Специальность: 03.00.12 - Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Иркутск 2000

http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/044.pdf Работа выполнена в лаборатории исследования биологически активных

веществ Якутской государственной сельскохозяйственной академии

Официальные оппоненты: академик ААО, профессор,

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится 19 апреля 2000 г. в 10°° часов на заседании диссертационного совета Д.003.25.01. по защите докторских диссертаций при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033 г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 а/я 1243. СИФИБР

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН

Автореферат разослан 10 февраля 2000 г. Ученый секретарь диссертационного

доктор биологических наук И.Э. Илли,

доктор биологических наук Ю.М. Константинов, доктор химических наук А.А. Семенов.

совета кандидат биологических наук

Акимова Г.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Гипобиоз - это состояние пониженной функциональной активности живых организмов, обусловленное факторами среды (низкая и высокая температуры, отсутствие влаги и т.д.), при сохранении их высокой жизнеспособности. Однако после восстановления нормальных условий для существования организмов происходит возобновление активной деятельности всех его функциональных систем. В реализации гипобиотических состояний используются адаптационные механизмы, обусловливающие приспособление к условиям окружающей среды растений и животных, которые заложены в их анатомо-морфологические, молекулярно-генетических и физиолого-биохимических особенностях строения. В основе действия механизмов покоя проявляется функционирование различных физиолого-биохимических процессов. Регулирование этих процессов осуществляется комплексом биологически активных веществ, которые участвуют в росте и развитии растительного организма, обеспечивая сохранение его жизнеспособности. Вхождение в состояние покоя сопровождается понижением активности биосинтетических процессов и дыхания митохондрий, последнее вызывается разобщением окислительного фосфорилирования, переключением аэробных метаболических процессов на анаэробные (Скулачев, 1994). При этом скорость протекания анаэробных метаболических систем начинает преобладать над активностью аэробных процессов. Показателями анаэробных метаболических процессов могут служить ферменты глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и алкогольдегидрогеназа, а аэробных - пероксидаза. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа является ключевым ферментом пентозофосфатного пути превращения углеводов, катализирует реакции окисления глюкозо-6-фосфата в присутствии NADP, который необходим для метаболизма липидов (жирных кислот и стероидов) (Путилина, 1982). При этом известно, что стероидные гликозиды могут в организме выполнять роль антиоксидантов, регулировать проницаемость мембран и активировать процессы деления и роста клеток (Богатский и др., 1960; Кинтя, 1988). Алкогольдегидрогеназа катализирует обратимые реакции окисления алифатических спиртов с участием NAD (Sund, Theoreil, 1963). Отношение концентраций альдегида к спирту отражает уровень протекания анаэробных биоэнергетических процессов. Снижение этого соотношения должно со про во ждаться активацией катаболических процессов, а повышение -углублением гипобиотического состояния (Кершенгольц, 1991). Однако этот регуляторный механизм в семенах культурных и дикорастущих растений недостаточно изучен.

Интенсивность аэробных процессов может быть оценена по активности пероксидазы, которая совместно с СОД и каталазой входит в единую систему антиоксидантной защиты живых организмов, предотвращающих разрушительное действие активных форм кислорода (Fridovich, 1986; Halliwell, 1982). Фермент способен катализировать реакции окисления различных биологически активных соединений (NADH, ИУК, аскорбиновая кислота, флавоноиды и др.), среди которых следует выделить антиоксиданты, соединения способные подавлять образование свободных радикалов, ингибировать ПОЛ.

Таким образом, между пероксидазой и антиоксидантами

должна наблюдаться взаимная зависимость, которая, к сожалению, недостаточно изучена.

Семена культурных растений в отсутствие воды и при низкой температуре находятся в состоянии вынужденного покоя. Однако с возрастанием оводненности в семенах активируются основные метаболические процессы и повышается дыхание до максимального уровня, характеризующие их рост и развитие (Николаева и др., 1985). Период прорастания делится на три этапа: 1) активация метаболизма (этап физического набухания); 2) подготовка к началу роста растяжением (наклевывание семян за счет перехода к растяжению клеток осевых органов зародыша); 3) собственно рост органов проростка (Обручева, Антипова, 1997). Известно, что для нормального прорастания в воздушно-сухих семенах должны присутствовать все компоненты белок-синтезирующей системы: рибосомы, тРНК, факторы инициации и элонгации, аминокислоты и аминоацил-тРНК-синтетазы, все ферменты метаболизма, белки теплового шока и их мРНК (Гумелевская и др., 1995). Во влажных семенах наблюдается активное потребление кислорода, который может вызывать окислительное повреждение тканей. В развитии окислительного стресса играют роль активные формы кислорода (АФК): 02\ Н202, HO-, НОС1 и др. (Ursini et al., 1989). Накопление АФК в клетках приводит к нарушению протекания процессов транскрипции и репликации, изменяет состав липидов мембран (Rubanyi, 1988; Allen, Baiin, 1989). Супероксидные радикалы модифицируют белки, нарушают структуру ДНК, разрушают гормоны и другие функционально активные вещества (Коган и др., 1992). Поэтому изучение проявления компенсаторных механизмов в семенах на действие АФК является общебиологической задачей.

В живых организмах существует физиологически нормальный уровень свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов, необходимый для регулирования липидного состава, проницаемости мембран, и ряда биосинтетических процессов (Бурлакова и др., 1991). Контроль за содержанием АФК в семенах осуществляют антиоксиданты. В генерировании свободных радикалов может принимать участие и пероксидаза. Однако инициирующая роль фермента в процессах прорастания семян практически не изучена. Набухание и прорастание семян всегда сопровождается активированием оксидазных процессов. УФ-облучение семян может инициировать возрастание ПОЛ, регулируемое в живых организмах компонентами антиоксидантной системы (Рогожин, Курилюк, 1996). Однако взаимодействие их основных метаболитов, принимающих участие в формировании гипобиотических состояний у живых организмов, обитающих в экстремальных условиях мало исследовано. Поэтому актуальность и значимость изучения биохимических механизмов формирования

гипобиотических состояний позволили нам сформулировать цель и задачи данной работы.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования - изучить закономерности протекания основных метаболических процессов и роль антиоксидантной системы при формировании гипобиотических состояний.

В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить физико-химические свойства пероксидазы, алкоголь- и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ растений; выявить особенности структурной организации каталитических центров этих ферментов и способы реализации заложенных в них адаптационных возможностей, которые могут проявляться при формировании гипобиотических состояний.

2. Провести сравнительный анализ кинетических свойств ферментов в зависимости от функционального состояния и видовой принадлежности растительного организма.

3. Изучить участие пероксидазы, алкоголь- и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ и их метаболитов в обеспечении устойчивости и поддержании высокой жизнеспособности семян дикорастущих и культурных растений.

4. Исследовать влияние высоких положительных температур на резистентность и всхожесть семян растений, выявить отличительные особенности в проявлении ферментативной активности у семян культурных и дикорастущих растений при действии стрессирующих факторов.

5. Исследовать влияние ультрафиолетового облучения семян на процессы перекисного окисления липидов в проростках пшеницы, а также роль малых доз ультрафиолетового излучения на динамику активности ферментов зерновок пшеницы.

6. Изучить роль стероидных гликозидов и аскорбиновой кислоты в сезонной динамике развития растений.

7. Изучить закономерности взаимного влияния компонентов антиоксидантной системы при прорастании семян.

8. Установить роль аскорбиновой кислоты в механизмах формирования гипобиотических состояний.

9. Изучить возможности регулирования глубины гипобиотического состояния с помощью варьирования концентраций антиоксидантов.

Научная новизна. Проведенные исследования дают описание общих закономерностей пероксидазного окисления антиоксидантов (аскорбиновой кислоты, гидрохинона, кверцетина, дигоксина и др.) в реакциях индивидуального и совместного окисления. Показано, что в действии пероксидазы заложен сложный регуляторный механизм, который позволяет в реакциях совместного окисления повышать скорость пероксидазного окисления медленно окисляемого субстрата более чем на два порядка, тогда как избыток антиоксидантов понижает активность фермента. Предложено, что данный механизм может быть использован в живых организмах при формировании гипобиотических состояний. При этом пероксидаза может являться показателем протекания аэробных метаболических процессов в семенах. Активность фермента увеличивается при прорастании семян, понижение активности пероксидазы служит критерием углубления их покоя. Поэтому антиоксиданты (аскорбиновая кислота и гидрохинон) в высоких концентрациях, понижая активность пероксидазы, могут способствовать переключению аэробных метаболических процессов на анаэробные, что будет проявляться в углублении покоя семян и понижении всхожести. Тогда как низкие концентрации субстратов пероксидазы при их

совместном присутствии могут активировать фермент, увеличивая скорость протекания метаболических процессов, обеспечивая переход семян из покоя в активное состояние, увеличивая их энергию прорастания и всхожесть. Показано, что АДГ, Г6ФДГ и пероксидаза участвуют в адаптационных механизмах растений, произрастающих в экстремальных условиях. При этом ферменты необходимы, прежде всего, для сохранения жизнеспособности семян и при запуске процессов, связанных с их прорастанием. При прорастании происходит интенсификация аэробных биоэнергетических процессов, активация оксидаз, включая пероксидазу. Причем у не проросших семян, остающихся в покое, активность АДГ возрастает, а пероксидазы понижается, в то время как в прорастающих семенах отмечается обратная зависимость, что свидетельствует об активном участии фермента в формировании пусковых механизмах прорастания семян пшеницы. В реакциях пероксидазного окисления различных субстратов, в том числе и антиоксидантов, могут образовываться свободные радикалы, способные ускорять процессы свободнорадикального окисления, инициирующие ПОЛ на начальных этапах прорастания семян пшеницы. Таким способом пероксидаза осуществляет контроль за уровнем перекиси водорода и содержанием антиоксидантов в семенах и в проростках пшеницы, а антиоксиданты накапливаясь в тканях участвуют в реакциях подавления образования свободных радикалов, избыток которых может ингибировать фермент. Взаимное влияние компонентов АОС реализуется в "пинг-понг"-механизме. При этом в процессе метаболизации антиоксидантов изменяется их концентрация, что может проявляться в регулировании активности пероксидазы и осуществлении общего контроля над деятельностью системы антиоксидантной защиты. Поэтому действие низких положительных температур на семена во время их замачивания, характеризующееся изменением активности пероксидазы и содержанием АО в прорастающих семенах и проростках пшеницы, может свидетельствовать о проявлении реактивности проростков на действующий фактор. Следовательно, в совокупности эти показатели могут быть предложены в качестве критериев адаптированности проростков к стрессирующим факторам.

Сформулированные в работе научные положения развивают новое направление в исследовании механизмов эмбриогенеза, состоящее в выявлении закономерностей функционирования антиоксидантной системы при формировании гипобиотических состояний и на начальных этапах прорастания семян.

Практическая значимость работы. В результате исследований в соответствии с тематическими планами академии и Министерства сельского хозяйства Республики Саха (Якутия), разработана научно-обоснованная программа использования биологически активных веществ в предпосевной обработке семян для повышения урожайности злаковых культур. Раскрыты особенности протекания биохимических адаптационных механизмов растений при действии на них стрессирующих факторов (УФ-облучение, температура).

Разработан высокочувствительный и селективный метод спектрофото-метрического титрования активных центров алкогольдегидрогеназы ртуть

содержащнмн соединениями (НМВ, СМВ), для исследования функциональной роли 8Н-групп в механизме действия фермента.

Предложено использовать при проведении лабораторных исследований усовершенствованные способы определения содержания сердечных гликозидов пикратом натрия (заявка на изобрет. N 95115784), концентрации мало но во го диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты (патент РФ N 2112241, общего содержания антиоксидантов в биологическом материале (патент РФ N 97111918), общей антиокислительной активности (патент РФ N97111917)), содержания флавоноидов в биологическом материале (патент РФ N 97111921) и антиокислительной активности биологического материала (заявка на изобрет. N 96114003).

Разработаны эффективные способы иммобилизации биологически активных веществ экстрактов растений на биогенном носителе (патент РФ N 2112241 и заявка на изобрет. N 97104995).

Материалы научных исследований использованы при создании простого, чувствительного и специфического метода определения этанола в биологических жидкостях и выдыхаемом воздухе на основе выделенного и стабилизированного препарата алкогольдегидрогеназы из семян пшеницы (а.с.СССР, N 1666956).

Для сельскохозяйственного производства предложены два способа консервации эерна на фураж (патенты РФ N 2111677, N 2111676), способ консервации кормов двухуглеродными соединениями (патент РФ N 1800954) и четыре способа консервации пантов оленя органическими соединениями (патенты РФ N 95121681, N 95121684, N 95121119 и N 96104419), которые обеспечивают длительное сохранение в зерне, зеленой массе и в пантах северного оленя функционально активных веществ.

Предложено для повышения урожайности зерновых культур насыщать семена различными ксенобиотиками, что способствует повышению их посевных качеств и сопротивляемости семян и растений к экзогенным патогенным факторам (действию низкой и высокой температуры, микробам и др.). Выявлена наиболее оптимальная продолжительность замачивания семян в растворах БАВ - четыре часа. Замачивание семян в течение этого времени не наносит им существенного вреда и не влияет на посевные качества. Обработка семян пшеницы биологически активными веществами в первые два часа способствует повышению их всхожести. Полученные результаты могут быть рекомендованы для практического использования в сельскохозяйственном производстве для повышения сопротивляемости семян и проростков пшеницы к действию неблагоприятных факторов среды и урожайности.

Результаты исследований отражены в учебных пособиях, которые используются при чтении лекционного курса и при проведении лабораторно-практических занятий по предмету "Биологическая химия", проводимых в Якутской государственной сельскохозяйственной академии. Защищаемые положения. 1. Молекулярные механизмы, заложенные в структуре ферментов (пероксидаза, алкоголь- и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы), обуславливают их избирательное участие в механизмах формирования гипобиотических состояний. 2. Состояние гипобиоза

обеспечивается за счет поддержания высокой активности ферментов анаэробных процессов, а выход из состояния покоя обусловлен активацией ферментов аэробных процессов, среди которых инициирующая роль принадлежит пероксидазе; продукты окисления фермента могут активизировать процессы ПОЛ, вследствие этого возрастает интенсивность дыхания, а, следовательно, реализуется выход системы из состояния покоя. 3. Компоненты антиокислительной системы принимают непосредственное участие в механизмах формирования гипобиотических состояний, а их взаимное влияние, обеспечивает поддержание нормальной жизнедеятельности семян в состоянии покоя, при прорастании и при действии на них стрессирующих факторов. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на международных, всероссийских и республиканских съездах, симпозиумах и конференциях: IV Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1979), III Всесоюзном научном симпозиуме "Получение и применение иммобилизованных ферментов в научных исследованиях, промышленности и медицине" (Ленинград, 1980), III Всесоюзной конференции по химии и биохимии порфиринов" (Самарканд, 1982), IV Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Киев, 1983), XI Всесоюзном симпозиуме "Биологические проблемы Севера" (Якутск, 1986), Международном конгрессе ИСТА (Новосибирск, 1990), Первой международной конференции "Знание - на службу нуждам Севера" (Якутск, 1996), II съезде Биохимического общества (Москва, 1997); Международном симпозиуме "Химия и химическое образование АТР, 21 век" (Владивосток, 1997); Межвузовских конференциях преподавателей физиологии и биотехнологии растений (Москва, МСХА, 1994, 1997); региональной научной конференции "Северо-восток России: проблемы экономики и народонаселения" (Магадан,

1998), II и III Циркумполярных сельскохозяйственных конференциях (Тромс, Норвегия, 1995; Анкоридж, Аляска, США, 1998), IV и V Международных конференциях "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, МСХА, 1997,

1999), IX Международном симпозиуме по новым кормовым растениям (Сыктывкар, 1999), 6-и региональных конференциях, теоретических семинарах Якутского института биологии, Якутской государственной сельскохозяйственной академии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 88 печатных работ, в том числе 31 статья, 15 патентов, 3 положительных решения на заявки и учебное пособие. Материалы легли в основу шести научных отчетов. Объем и структура работы. Диссертационная работа представляет собой рукопись, изложенную на 468 страницах машинописного текста, включает 39 таблиц, 93 рисунка, а также список цитируемой литературы из 540 наименований. Диссертация состоит из введения, 10 разделов, заключения, выводов и приложения.

Список используемых сокращений. АДГ - алкогольдегидрогеназа, АО -антиоксиданты, АК - аскорбиновая кислота, АОА - антиоксидантная активность, АОС - антиокислительная система, Г6ФДГ - глюкозо-6-

-7-

фосфатдегидрогеназа, ИЦДГ-NADP - изоцитратдегидрогеназа NADP-зависимая, ИУК - индолил-3 -уксусная кислота, ОДН - о-дианизидин, СМВ -хлор- и НМВ -гидроксимеркурибензоат, G6P - глюкозо-6-фосфат, ПОЛ -перекисное окисление липидов, ПО - пероксидаза, СГ - сердечные (стероидные) гликозиды, МДА -малоновый диальдегид, ТБК -тиобарбитуровая кислота, УФ - ультрафиолетовое излучение, СФ - строфантин.

Материал и методы исследования

Основными объектами исследований служили различные по происхождению семена пшеницы (Triticum aestivum L.) и травянистые растения, выращенные в разные годы в условиях Республики Саха (Якутия) (опытные поля ИБПК СО РАН и Якутского НИИСХ).

Влажность, всхожесть, жизнеспособность семян злаковых культур определяли по методам Гостстандартов СССР: всхожесть - ГОСТ 12038 - 66; жизнеспособность - ГОСТ 12039-66; сила роста - ГОСТ 12040-66; влажность -ГОСТ 12041-66 и бобовых (караганы древовидной) - (ГОСТ 13056.6-75). Жизнеспособность семян исследовали тетразольно - топографическим методом (Методические указания по определению жизнеспособности семян тетразольно-топографическим методом. Л.:ВИР, 1980).

Семена пшеницы (Triticum aestivum L.), овса (Avena L.), ячменя (Hordeum L.) и караганы древовидной (Caragana arborescens Lam.) предварительно замачивали в растворах БАВ в течение 24 ч, а затем проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри. Число семян в одной чашке - 100, число повторностей в каяедом варианте - 4, число опытов - 4.

Перекисное окисление липидов в семенах индуцировали полным светом ртутно-кварцевой лампы БНП02-30-001УЗ,5 ("Спектр-2", Россия) с интенсивностью энергетического облучения 30 Вт/м2, расположенной на расстоянии 25 см от облучаемого объекта (/.,„,,,=254 нм).

Для анализа продуктов ТБК 1 г сырой массы проростков гомогенизировали в фарфоровой ступке с 3 мл 50%-ного этанола, полученный гомогенат центрифугировали 10 мин при 7000 g.

За накоплением продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида - следили по реакции с тиобарбитуровой кислотой при 532 нм, £=155 мМ"1 см"1 (Владимиров, Арчаков, 1972) с нашими модификациями. К 0,5 мл экстракта последовательно добавляли 0,5 мл 1%-ного раствора тритона X-100, 0,2 мл 0,6 М раствор НС1 и 0,8 мл 0,06 М рабочий раствор ТБК. Смесь нагревали в кипящей водяной бане в течение 10 мин. Реакцию останавливали путем охлаждения пробы при температуре 15°С в течение 30 мин. Для стабилизации окраски добавляли 0,2 мл 5 мМ раствор трилонаБ и 5-10 мл 96%-ного этанола. Оптическую плотность измеряли при 532 нм. Контрольные пробы инкубировали параллельно с опытными, в которые добавляли вытяжку и ТБК. Содержание МДА в проростках выражали в мкмоль/г или нмоль/г сухой массы.

Определение антиоксидантов проводили по методике (Ермаков, 1987). В пробирку последовательно вносили 2,2 мл 50%-ного этанола, 0,4 мл

экстракта, 0,1 мл 25 мМ раствора о-фенантролина, а затем после перемешивания по каплям приливали 0,3 мл 123 мМ раствора FeCl3 и выдерживали в темноте 10 мин. Оптическую плотность измеряли при 505 нм. Для построения калибровочного графика использовали кверцетин. Количество антиоксидантов, содержащихся в проростках, рассчитывали в мг/г сухой массы.

Концентрацию пероксидазы определяли спектрофотометрически по поглощению при 403 нм (е=102 мМ"1 см"1 (Ogewa et al., 1979) или с использованием пиридингемохромогена (Falk, 1964).

Хроматографию нативной и модифицированной пероксидазы на СМ-целлюлозе проводили, нанося 5 мл раствора фермента (1 мг/мл) в 5 мМ Na-ацетатном буфере (рН 5,0) на колонку с СМ-целлюлозой (1X12 см), предварительно уравновешенную тем же буфером. Элюцию проводили в линейном градиенте концентрации ацетатного буфера (рН 5,0) от 0,005 до 1,5 М (объем смесителя 100 мл, скорость злюции 22 мл/ч).

Активность нативной и модифицированной пероксидазы определяли при 22°С по начальной скорости окисления в их присутствии о-дианизидина перекисью водорода (Лебедева и др., 1977). К 2,1 мл 0,01 М Na-фосфатного буфера, содержащего 0,1 М KN03 (рН 7,0), добавляли 0,2 мл 5 нМ раствора пероксидазы и 0,1 мл 0,43 мМ о-дианизидина в 96%-ном этаноле. Реакцию инициировали введением 0,1 мл 16 мМ Н2Ог. Окисление о-дианизидина регистрировали по увеличению поглощения раствора при 460 нм (е=30 мМ"1 см" 1). За единицу активности фермента принимали его количество, окисляющее 1 мкмоль о-дианизидина за 1 мин.

Реакцию окисления АК (2,2-352,0 мкМ) и гидрохинона (1,0-1,6 мМ) перекисью водорода (0,64 мМ) проводили при 25°С в среде 0,1 М натрий-ацетатного, рН 4,0-6,0, или натрий-фосфатного, рН 6,0-8,0, буферов, в присутствии пероксидазы хрена. Окисление АК регистрировали по уменьшению поглощения при 265 нм, е=7,0 мМ"1 см"1 (Досон и др., 1991), а гидрохинона при 290 нм, е=2,2 мМ"1 см"1. За единицу активности фермента принимали его количество, окисляющее 1 мкмоль субстрата (аскорбиновой кислоты или гидрохинона) за 1 мин.

Активность АДГ в прямой реакции определяли по скорости окисления этанола и образования NADH при 340 нм (е=6,22 мМ^см"1). К 2,2 мл 0,1 М глицин-NaOH буфера рН 10 добавляли 0,1 мл 36 мМ раствора NAD и 0,1 мл 0,41 М раствора этанола. Реакцию инициировали введением 0,1 мл 2,5 мкМ раствора АДГ. Активность АДГ в реакции восстановления ацетальдегида наблюдали при 340 нм по убыли NADH в процессе реакции. В кювету вносили 2,2 мл 0,1 М Na-фосфатного буфера, рН 6,0, добавляли 0,1 мл

раствора NADH 11,3 мМ и 0,1 мл 2,5 мкМ фермента. Реакцию инициировали 0,1 мл 0,1 М раствора ацетальдегида. За меру активности фермента принимали количество микромолей NADH, восстановленного или окисленного за 1 мин.

Активности NADP-зависимой изоцитратдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и дегидрогеназы 6-фосфоглюконовой кислоты определяли по (Путилина, 1982), содержание стероидных гликозидов - по

(Ермаков, 1987), аскорбиновой кислоты - по (Полевой, Максимова, 1978).

Концентрацию АДГ находили спектрофотометрически по спектру поглощения комплекса фермента с NAD в присутствии пиразола (Einarsson et al., 1976) или с помощью титрования хлор- и гидроксимеркурибензоатом (Рогожин и др., 1988).

Спектральные измерения выполняли на двухлучевом спектрофотометре DMS 100 S фирмы "Vanan" (США). Кажущиеся константы скорости реакций окисления субстратов пероксидазы, АДГ и Г6ФДГ определяли из данных по стационарной кинетике (Березин, Клесов, 1976).

При расчете каталитических констант использовали пакет прикладных программ по анализу и обработке кинетических данных ферментативных реакций. Все полученные количественные результаты подвергнуты статистической обработке с учетом критерия Стьюдента при р<0,05-0,01. Статистическую ошибку средней определяли по методике (Лакин, 1990), используя ПИИ Снедекор V2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Молекулярные механизмы регулирования активности ферментов основных метаболических процессов гипобиоза

В действии ферментов живых организмов заложены сложные регуляторные механизмы, управление которыми позволяет обеспечивать выполнение определенной функции, возложенной на данный фермент в клетке. Знание этих механизмов позволяет разобраться в особенностях действия ферментов, направленных на выполнение их специализированной функции в живом организме.

Нами изучены физико-химические свойства пероксидазы, алкоголь- и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ, которые являются ключевыми ферментами метаболических процессов, принимающих участие в формировании гипобиотических состояний.

Пероксидаза относится к гемсодержащим белкам, активный центр которой представлен преимущественно гидрофобными аминокислотными остатками (Газарян и др., 1997). Нами изучено строение активного центра фермента, установлена природа функциональных групп, участвующих в катализе. Показано, что вблизи активного центра располагаются функционально важные карбоксильные группы, модификация которых влияет на каталитические свойства фермента, в частности, на процесс переноса электронов с органического субстрата - донора водорода - на промежуточные формы El и Е2 полуокисленные соединения пероксидазы. В то же время модификация этих групп не оказывала влияние на скорость окисления неорганического субстрата пероксидазы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в механизме действия фермента могут быть реализованы различные пути переноса электрона с субстрата на железо гема.

По скорости окисления субстраты пероксидазы можно разделить на быстро и медленно окисляемые. Однако особое значение приобретает исследование реакций пероксидазного окисления функционально важных соединений, обладающих полифункциональным действием. К таким

соединениям относятся аскорбиновая кислота, кверцетин, гидрохинон, стероидные гликозиды, ИУК.

Показано, что аскорбиновая кислота является медленно окисляемым субстратом пероксидазы. В механизме пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты заложен сложный регуляторный механизм, имеющий биологическое значение. Установлено, что при связывании двух молекул АК процесс пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты будет ускоряться, а избыток АК понижает каталитическую активность фермента.

Исследованные антиоксиданты (дигоксин, гидрохинон, кверцетин и аскорбиновая кислота) могут ингибировать пероксидазное окисление быстро окисляемого субстрата о-дианизидина, катализируемое пероксидазой хрена. Дигоксин связываясь с фермент-субстратным комплексом, в котором образуется стабильный полуокисленный продукт о-дианизидина, ингибирует пероксидазу по антиконкурентному типу. Проявляя свойства антиоксиданта дигоксин подавляет свободнорадикальное окисление о-дианизидина. Кверцетин ингибирует пероксидазу по смешанному типу. При связывании с ферментом кверцетина понижается сродство и эффективность превращения о-дианизидина. Наблюдаемый эффект отмечается за счет того, что кверцетин является медленно окисляемым субстратом пероксидазы, скорость окисления которого в присутствии быстро окисляемого субстрата возрастает, что и создает конкуренцию. Аскорбиновая кислота при индивидуальном окислении является медленно окисляемым субстратом пероксидазы. Однако в присутствии быстро окисляемого субстрата наблюдается их дифференцированное окисление. Причем АК окисляется полуокисленным промежуточным фермент-субстратным комплексом пероксидазы аналогично ферроцианиду. Скорость пероксидазного окисления АК в присутствии ОДН может превышать скорость индивидуального окисления аскорбиновой кислоты более чем на два порядка, а о-дианизидина - в 1,5-2,0 раза.

Результаты исследования имеют важное биологическое значение, поскольку раскрывают регуляторную роль антиоксидантов в пероксидазном окислении быстро окисляемых субстратов. Выявленные закономерности позволяют предположить, что увеличение содержания антиоксидантов в исследуемом биообъекте может ингибировать пероксидазу, тогда как возрастание концентрации фермента будет способствовать быстрому их окислению.

При совместном окислении АК и гидрохинона, осуществляется упорядоченный процесс окисления субстратов, который определяет преимущественное окисление медленно окисляемого субстрата. Очередность задается тем, что связывание АК с окисленными формами пероксидазы почти на два порядка лучше, чем связывание гидрохинона. Таким образом, предварительное связывание АК в активном центре фермента улучшает в 28-420 раз последующее связывание молекул гидрохинона. Однако связавшись гидрохинон не оказывает влияния на связывание второй молекулы АК, что проявляется в неконкурентном типе активирования. Присутствие гидрохинона в активном центре фермента способствует ускорению окисления молекул АК в 4-41 раз. Особенно этот эффект

проявляется при pH 5,5-7,0. Оптимум активирования приходится на pH 7,0. Высокие концентрации АК ингибируют фермент как в реакциях индивидуального, так и совместного с гидрохиноном пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты. Причем, если в реакциях индивидуального окисления АК фермент ингибируется при pH 6-7 6-9 молекулами субстрата, то в реакциях совместного окисления АК и гидрохинона ингибирование пероксидазы возможно двумя молекулами аскорбиновой кислоты.

Пероксидаза хрена способна катализировать окисление органических соединений не только перекисью водорода, но в отдельных случаях и кислородом воздуха (Березин и др., 1975). Высказывается предположение, что для выполнения столь разнообразных функций у фермента имеется два различных активных центра (Siegel, Galston, 1967). В некоторых реакциях для проявления каталитической активности пероксидазе требуются ионы металлов, таких как Mn, Zn, Си, Ca и др. или сложные органические соединения, вступающие во временное взаимодействие с ферментом. Появление ответной реакции пероксидазы на различные соединения, которые могут активировать или ингибировать фермент позволяет отнести его к числу регуляторных (Андреева, 1988). Поэтому активирование пероксидазы в реакциях индивидуального и совместного пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты высокими концентрациями субстрата и гидрохинона позволяет предположить наличие вблизи активного центра регуляторного участка, связывание с которым субстратов может повышать или понижать активность фермента.

Следует особо подчеркнуть биологическое значение наблюдаемого эффекта активации пероксидазы в реакциях окисления медленно окисляемого субстрата в присутствии быстро окисляемого и ингибирование активности фермента высокими концентрациями субстрата. Выявленные закономерности позволяют понять механизм действия большого количества соединений, используемых в предпосевной обработке семян и обладающих стимулирующим, ретардантным, ингибирующим действием в отдельности, а также в различных сочетаниях (Михно и др., 1997). Пероксидаза входит в состав ферментов катализирующих окисление различных соединений, используемых в аэробных метаболических процессах, интенсивность которых возрастает в процессе набухания и прорастания семян. До сих пор спорными являются вопросы относительно эффектов активирования всхожести семян низкими концентрациями соединений и механизмы понижения всхожести семян высокими концентрациями веществ. На основании полученных данных мы можем предложить механизм участия пероксидазы в этих процессах. Так как фермент является показателем протекания аэробных метаболических процессов в семенах, активность которого увеличивается при их прорастании, понижение активности пероксидазы служит критерием углубления покоя семян. Поэтому аскорбиновая кислота и гидрохинон в высоких концентрациях понижая активность пероксидазы, могут способствовать переключению аэробных метаболических процессов на анаэробные, что будет проявляться в углублении покоя семян и понижению

всхожести. Тогда как низкие концентрации субстратов пероксидазы при их совместном присутствии могут активировать фермент, увеличивая скорость протекания метаболических процессов, обеспечивая переход семян из покоя в активное состояние, увеличивая их энергию прорастания и всхожесть. Для подтверждения высказанных предположений возникает необходимость в проведении экспериментов по изучению влияния антиоксидантов на механизмы прорастания семян, что и было сделано нами в дальнейших исследованиях, описанных ниже.

Индолил-3-уксусная кислота входит в группу природных фитогормонов -ауксинов. Наиболее богаты содержанием ИУК растущие части растительного организма: верхушки стебля, молодые части листьев, почки, завязи, прорастающие семена, пыльца (Якушкин, 1993). В конце роста растяжением усиливается лигнификация клеточных стенок, накапливаются ингибиторы фенольной природы и абсцизовая кислота, возрастает активность пероксидазы и оксидазы ИУК, снижающие общее содержание ауксина в тканях (Grierson, Covey, 1984). Участие пероксидазы в этих процессах обусловлено тем, что ИУК является субстратом фермента. Известно, что окисление ИУК пероксидазой протекает через образование тройного комплекса фермент-ИУК-кислород. Исследование механизма окисления ИУК пероксидазой растений показало, что на поверхности белковой глобулы должен располагаться участок связывания ауксина (Park, 1987; Metodiewa et al., 1992), который может находиться в составе дистального домена фермента (Савицкий и др., 1998). Пероксидаза катализирует окисление ИУК как в присутствии, так и в отсутствие перекиси водорода. В процессе оксидазного окисления ИУК образуются супероксид анион-радикал и катион-радикал ИУК, последний в кислой среде декарбоксилируется, превращаясь в радикал скатола (Gazaryan, et al., 1996, Савицкий и др., 1998).

Конкурентный тип ингибирования реакции пероксидазного окисления о-дианизидина ИУК позволяет предположить, что ОДН и индолил-3-уксусная кислота связывается в одном и том же месте активного центра фермента. При этом связывание ИУК препятствует как связыванию, так и превращению о-дианизидина. Тогда как по отношению к гидрохинону тип ингибирования несколько другой. ИУК и гидрохинон связываются в различных местах активного центра, однако, если индолил-3-уксусная кислота связывается на поверхности фермента, то дальнейшее превращение гидрохинона становится невозможным. Это может наблюдаться вследствие удаленности мест связывания эффектора и субстрата или в результате конформационных изменений глобулы фермента при связывании ингибитора. Используя ИУК можно предположить место расположения участка связывания молекул АК в активном центре пероксидазы. По-видимому, таким участком также является дистальная область активного центра пероксидазы. Связывание ИУК в этой области при низких концентрациях субстрата создает конкуренцию за участок связывания, проявляемую в реакциях пероксидазного окисления АК, когда в активном центре фермента связывается по крайней мере одна молекула субстрата. Тогда как при связывании двух и более молекул АК с пероксидазой наблюдается ускорение реакции окисления АК,

что, возможно, вызвано кооперативными взаимодействиями между участками связывания этих двух молекул субстрата. Использование ИУК позволяет высказать предположение, что участки связывания молекул АК пространственно удалены, поэтому проявляется неконкурентный характер ингибирования пероксидазы ИУК при окислении АК в присутствии второй молекулы субстрата. При этом связывание ИУК в активном центре создает препятствие для протекания реакции пероксидазного окисления АК. Однако ингибитор проявляет неконкурентный характер ингибирования при окислении двух и более молекул АК. Это, возможно, обусловлено отрицательным кооперативным влиянием различных участков активного центра фермента. Выявленные эффекты влияния ИУК на пероксидазное окисление органических субстратов, катализируемое пероксидазой, имеет важное биологическое значение. ИУК, по-видимому, может регулировать пероксидазное окисление медленно окисляемых субстратов, имея специфичный участок связывания в составе дистального домена активного центра пероксидазы. Возможно, избирательность типов ингибирования пероксидазы ИУК, обусловлена специализированностью ауксина служить оксидазным субстратом фермента. При этом ИУК может изменять направленность реакций пероксидазы с одного типа на другой, меняя специфичность фермента с пероксидазного на оксидазный, превращая пероксидазу в высокоспецифичную оксигеназу, генерирующую свободные радикалы, необходимость в которых может возникать у растений в процессе развития. Таким образом, ИУК может выполнять роль "триггера" в реакциях окисления, катализируемых пероксидазой. Действие ауксина может проявляться, например, при выходе семян растений из состояния вынужденного покоя. В этот период в семенах резко возрастает активность пероксидазы, которая активирует процессы прорастания. Возможным механизмом действия фермента в этих процессах может быть его способность к генерированию свободных радикалов, необходимых на конечных этапах эмбриогенеза для активизации механизмов прорастания.

В функционировании другого важнейшего фермента гипобиоза - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы нами выявлен сложный регуляторный механизм, который осуществляется за счет действия вбР, ЫАЭР и рН на процесс окисления глюкозо-6-фосфата в тройном фермент-субстратном комплексе. Высокие концентрации вбР активируют фермент, а избыток ЫАЭР приводит к его ингибированию. В связывании и превращении субстрата и кофермента принимают участие четыре функциональные группы с рК 7,0, 8,0, 9,0 и 9,5. Среди этих групп важнейшее значение имеет группа с рК 9,5, протонирование которой может понизить каталитическую активность, уменьшить активацию фермента избытком субстрата и вызвать ингибирование глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы большими концентрациями ЫАЭР. По-видимому, данный регуляторный механизм способствует выполнению важной функциональной роли фермента в обеспечении состояния гипобиоза семян пшеницы и при их прорастании. Выход семян из состояния покоя сопровождается активизацией процессов гидролиза крахмала, в результате чего образуется большое количество вбР, который

активируя глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, ускоряет протекание в прорастающих зерновках пентозофосфатного цикла превращения углеводов, и тем самым создаются условия для ускорения синтеза стероидов и информативных молекул (ДНК и РНК).

Поддержание высокой жизнеспособности семян, в период вынужденного покоя, обеспечивается за счет слаженной работы ферментов анаэробных процессов. Одним из таких ферментов является алкогольдегидрогеназа, состоящая из двух субъединиц. Фермент характеризуется широкой специфичностью, действует на алифатические и ароматические спирты (первичные и вторичные), альдегиды, на ароматические кетоны (Кочетов, 1980).

Основными субстратами АДГ являются этанол и ацетальдегид, превращение которых протекает в присутствии восстановленного и окисленного NAD.

к(кат!)

СН3СН2ОН + NAD « СН3СНО + NADH

к(кат2)

к(кат1), к(ках2)- каталитические константы реакций окисления этанола и восстановления ацетальдегида соответственно.

Нами показано, что высокие концентрации этанола и NAD способны активировать АДГ в интервале рН 6,0-7,9. Предложен механизм активации АДГ, основанный на существовании отрицательной кооперативности субъединиц фермента по связыванию этанола и NAD. Показано, что благодаря отрицательной кооперативности субъединиц АДГ является саморегулирующейся системой и обладает адаптационной мобильностью к повышению концентрации этанола. При низких концентрациях этанола фермент хорошо его связывает и, не обладая высокой каталитической активностью, не образует в высоких концентрациях ацетальдегид. При больших концентрациях этанола фермент активируется. Благодаря этому клетка получает возможность быстрее перерабатывать этанол, повышая концентрацию ацетальдегида, который может способствовать углублению гипобиотического состояния. Поэтому выявленные закономерности в действии АДГ могут реализоваться для обеспечения длительного поддержания покоя семян.

В качестве кофактора АДГ может использоваться и NADP, восстановленная форма которого (NADPH) при рН 6,5 в 2 раза медленнее окисляется, чем NADH, каталитические константы равны 11,2 и 22,5 мин"1 соответственно. При этом NADPH в 2,7 раза хуже связывается с ферментом, чем NADH. Окисленные формы NAD и NADP имеют равные при рН 10 значения k(Kaxi)=40 мин"1, однако NAD связывается в 200 раз лучше, чем NADP. Поэтому в дегидрогеназных реакциях катализируемых АДГ может участвовать в основном восстановленная форма кофермента. Использование ферментом различных коферментов, позволяет предположить об огромных адаптационных возможностях, заложенных в механизме действия АДГ,

которые могут быть реализованы для поддержания высокой жизнеспособности семян с различными формами покоя.

Используя ртутьсодержащие соединения (НМВ и СМВ) показано, что в активном центре АДГ семян пшеницы имеются функционально важные 8Н-группы, химическая модификация которых полностью ингибирует фермент. Установлено, что число 8Н-групп, принимающих участие в катализе равно двум. При этом 8Н-группы участвуют как в реакциях окисления этанола, так в реакциях восстановления ацетальдегида. Наличие неконкурентного типа ингибирования свидетельствует о том, что связывание ингибитора не происходит в месте связывания субстратов АДГ (этанола и ацетальдегида). Однако связывание ингибиторов вызывает существенные изменения в конформации фермента, в результате чего нарушается нормальное взаимодействие субстрата с активным центром фермента. Поэтому местом локализации 8Н-групп, по-видимому, является кофермент связывающий участок, а их модификация НМВ и СМВ может оказывать влияние как на связывание кофермента, так и на его превращение, проявляясь в смешанном типе ингибирования АДГ ртутьсодержащими соединениями. Использование ртутьсодержащих соединений позволило нам разработать селективный метод титрования активных центров АДГ, что может быть использовано при определении содержания фермента в различных биогенных тканях.

Известно, что АТФ и другие нуклеозидфосфаты способны регулировать активность ключевых метаболических ферментов. К таким ферментам относятся гексокиназа, пируваткиназа, фосфофруктокиназа и др. Поэтому мы изучили влияние АТФ, АДФ и АМФ на кинетику реакций окисления этанола и восстановления ацетальдегида, катализируемых АДГ. Показано, что нуклеозидфосфаты способны конкурентно ингибировать АДГ. Причем АТФ и АДФ сильнее ингибируют фермент в реакции восстановления ацетальдегида чем АМФ. При этом АТФ и АДФ более избирательно действуют на АДГ в реакции восстановления ацетальдегида, что, по-видимому, связано с преимущественным использованием, образующегося ацетальдегида в анаболических реакциях для синтеза функционально активных соединений, активизации аутоиммунных реакций за счет модификации ЫН2 - и других групп белков и частично для синтеза АТФ. В случае накопления АТФ в чрезмерно высоких концентрациях, нуклеотиды способны ингибировать и прямую реакцию, предотвращая использование ацетальдегида в синтетических процессах, в том числе и в реакциях синтеза АТФ. Следовательно, АДГ семян при физиологических рН преимущественно способна катализировать реакцию накопления этанола, который в покоящихся семенах может выполнять роль основного энергетического субстрата метаболических процессов. За счет генерации этанола в семенах поддерживается их высокая жизнеспособность и длительная сохранность. При этом реакция восстановления ацетальдегида находится под контролем эндогенных нуклеозидфосфатов (АТФ и АДФ), избыток которых, по-видимому, может ингибировать фермент, регулируя таким образом уровень эндогенных этанола и ацетальдегида в семенах, находящихся в состоянии вынужденного покоя. Тогда как при прорастании семян активизируются

метаболические процессы, увеличивающие концентрацию АТФ в проростке, в результате содержание нуклеозидфосфатов начинает накапливаться в системе. Избыточное содержание АТФ в проростках приводит к ингибированию АДГ, что и проявляется в виде понижения активности фермента при прорастании проростков пшеницы. Следовательно, АТФ может выполнять роль регулятора алкогольдегидрогеназной активности, осуществляя направленное переключение процессов с анаэробных на аэробные, при повышении функциональной активности митохондрий.

Выявленные закономерности позволяют предположить, что в действии основных ферментов гипобиоза заложены регуляторные механизмы, которые обеспечивают запрограммированное управление их функциональной деятельностью в нормальных условиях и эти же механизмы начинают проявляться при возникновении условий угрожающих жизнедеятельности системы в экстремальных условиях. Причем регулирование деятельности ферментов, может осуществляться с помощью естественных субстратов метаболических процессов, которые помимо своей основной функции могут в экстремальных ситуациях регулировать активность ферментов, осуществляя направленное протекание метаболических процессов, обеспечивающих формирование гипобиотических состояний.

Таким образом, основные молекулярные механизмы формирования гипобиотических состояний заложены в особенностях структуры ферментов и в регулировании их каталитической активности с помощью субстратов и биологически активных веществ, обладающих полифункциональной деятельностью в клетках живых организмов.

2. Роль ферментов, функционально активных веществ и условий среды в формировании гипобиотических состояний

Сравнение каталитических свойств АДГ семян культурного растения (пшеницы) и дикорастущего (пырея ползучего), позволяет оценить степень участия фермента в формировании устойчивости семян к экстремальным факторам среды и их адаптационный потенциал.

В таблице 1 представлены величины Кт алкогольдегидрогеназ пшеницы и пырея ползучего. Наибольшие различия в значениях констант связывания этанола и ацетальдегида наблюдаются в физиологической области рН 6,0-7,5. Показано, что алкогольдегидрогеназой пшеницы ацетальдегид связывается в 10 раз эффективнее этанола, тогда как величины констант связывания кофакторов NAD и NADH различаются незначительно. Алкогольдегидрогеназа пырея ползучего связывает ацетальдегид в 8-10 раз лучше этанола, a NADH в 5-8 раз эффективнее по сравнению с NAD.

Такие различия в связывании субстратов этанола и ацетальдегида АДГ пшеницы обеспечивает определенную направленность дегидрогеназной реакции, в которой при физиологических рН осуществляется преимущественное превращение ацетальдегида в этанол и генерация последнего в покоящихся семенах для обеспечения, по-видимому, их энергетических потребностей. В семенах пырея ползучего накопление этанола

Таблнца 1. Величины Кт (мМ) реакций окисления этанола и восстановления ацетальдегида алкогольдегидрогеназами семян пшеницы и пырея ползучего при различных рН.

рН АДГ пшеницы АДГ пырея ползучего

KmNAD Кщэтанол KmNADH Km альд KmNAD Кщэтанол KmNADH Km альд

5,8 0,42 14,3 0,13 2,0 - - - -

6,5 0,20 17,0 0,25 0,7 0,58 20,0 0,11 0,6

7,0 0,19 20,0 0,52 1,8 0,32 11,0 0,05 1,2

7,5 0,35 16,0 0,54 1,6 0,31 11,0 0,07 1,0

7,9 0,43 - 0,67 - 0,27 9,0 0,13 1,3

8,0 - 14,7 - - - - - -

8,5 0,33 - - 1,56 0,29 14,0 0,10 8,3

9,0 0,18 15,0 20,0 40,0 0,27 16,0 0,21 6,0

10,0 0,19 12,0 - - 0,27 15,0 0,14 9,6

10,7 0,22 17,0 - - 0,86 13,5 0,12 -

11,0 0,34 20,0 - - - - - -

может происходить еще интенсивнее, поскольку АДГ способна в 8-10 раз лучше связывать как ацетальдегид, так и NADH. Причем связывание NADH алкогольдегидрогеназой пырея ползучего в физиологической области рН (6,0-7,5) в 7-10 раз эффективнее, чем АДГ пшеницы. При этом особые различия между алкогольдегидрогеназами пшеницы и пырея ползучего наблюдаются в щелочной области рН 8,0-11,0. При этих рН АДГ пырея ползучего связывает NADH в 2-4 раза лучше NAD, а ацетальдегид в 2-3 раза

эффективнее этанола. АДГ пшеницы в этой области рН NADH и ацетальдегид практически вообще не связывает (табл. 1).

Показано, что оптимумы каталитических констант алкогольдегидрогеназ пырея ползучего и пшеницы в реакции окисления этанола находятся в области рН 8,0 - 11,5 (рис. 1, кривые 2, 3) с различиями в величинах к(кат1) в 3-4 раза. В реакции восстановления ацетальдегида АДГ пшеницы имеет оптимум к(кат2) при рН 6,5-7,0, а АДГ пырея ползучего при рН 8,0-9,5 (рис. 1, кривые 1, 4). Причем, если соотношение к(кат2)/к(кат1) АДГ пырея ползучего равно 5-6 во всем физиологическом интервале рН (6,0-8,0), то у АДГ пшеницы оно постепенно понижается приобретая следующие значения при рН 6,0 12-14, рН 7,0 - 4-5 и рН 8,0 - 0,1-0,2. Это указывает на то, что за счет особенностей строения каталитического участка активного центра АДГ семян пырея ползучего во всем интервале рН от 6,0 до 9,5 равновесие в системе спирт -альдегид смещено в сторону этанола, тогда как в семенах пшеницы при рН 8,0 равновесие алкогольдегидрогеназной реакции смещено в сторону образования альдегида, содержание которого определяет, по-видимому, глубину гипобиотического состояния семян. Однако при подкислении среды до рН 6,0 равновесие алкогольдегидрогеназной реакции начинает смещаться в сторону образования этанола. При этом в семенах пшеницы это происходит в 2-2,5 раза быстрее, чем в семенах

Рис. 1. рН - зависимость kcat восстановления ацетальдегида (1,4) и окисления этанола (2,3) алкогольдегидрогеназами семян пшеницы (3,4) и пырея ползучего (1,2). Условия: 23°С, буферные растворы 0,1 М: Na-фосфатные рН 6,0-8,0; глицин/NaOH рН 8,5-11,0. Концентрации: этанол - 1,2-40,0 мМ, ацетальдегид -0,8-16,0 мМ, NAD - 1,44 мМ, NADH - 0,45 мМ, АДГ пшеницы - 0,42 мкМ, АДГ пырея ползучего - 0,2-0,56 мкМ.

пырея ползучего. Последнее, вероятно, определяет повышенную легкость выхода семян пшеницы из состояния покоя по сравнению с семенами пырея ползучего.

АДГ пшеницы и пырея ползучего в реакции окисления этанола имеют температурный оптимум в диапазоне 40-50°С (рис. 2) с разницей максимальных значений к(кат1) в 3,2-3,5 раза. В реакции восстановления ацетальдегида АДГ пшеницы имеет температурный оптимум к(кат2) в диапазоне 55-60°С (рис. 3), тогда как АДГ пырея ползучего - при 40-50°С. Причем величины каталитических констант (к(кат2)) АДГ пшеницы по ацетальдегиду во всем изученном интервале температур были в 2-10 раз выше, чем у пырея ползучего.

Интересно отметить, что в области низких положительных температур (<10°С) величины к(кат2) АДГ пшеницы и пырея ползучего сближаются, а значения к(кат1) АДГ пшеницы остается в 2,5-4,5 раза выше к(кат2) АДГ пырея ползучего. Это, вероятно, связано с тем, что при низких положительных температурах для обеспечения покоя и сохранения потенциальной жизнеспособности и тех и других семян необходимо не только накопление этанола, но и поддержание определенной концентрации ацетальдегида, тем

ксаь мин"1

Рис.2.Температурные зависимости кса1 реакции окисления этанола алкоголь-дегидрогеназами семян пшеницы (1) и пырея ползучего (2). Условия: ОД М глицин/ЫаОН буфер рН 10,0. Этанол-16,4 мМ^АБ-1,44мМ, АДГ пшеницы - 0,11 мкМ, АДГ пырея ползучего -0,4 мкМ,

ксаь мин"1

Рис.3. Температурные зависимости кса1 реакции восстановления ацеталь-дегида алколгольдегидрогеназами семян пшеницы (1) и пырея ползучего (2). Условия: 0,1 М №-фосфат-ный буфер рН 7,0. ^БН - 0,45 мМ, ацетальдегид-4,0 мМ, АДГ пшеницы 0,59 мкМ, АДГ пырея ползучего -0,58 мкМ

большей, чем меньше степень гипобиоза семян. Таким образом, при низких положительных температурах для поддержания покоя семенам необходим не ацетальдегид, а преимущественно этанол, который обеспечивает продолжительность гипобиотического состояния в этих условиях.

Существенная разница в к(ках2) реакции восстановления ацетальдегида алкогольдегидрогеназой пшеницы и пырея ползучего при температурах от 5 до 60°С позволяет предположить, что при более эффективном связывании ацетальдегида АДГ пырея ползучего скорость его превращения в активном центре фермента (в особенности при низких температурах) в 5-10 раз медленнее, чем АДГ пшеницы. Это позволяет накапливать ацетальдегид в семенах пырея в большей степени, чем в семенах пшеницы, что, по-видимому, определяет более высокую степень гипобиоза семян пырея, меньшую скорость их прорастания, зато повышает их адаптивный потенциал.

Таким образом, в семенах злаковых растений отношение содержания ацетальдегида к этанолу отражает уровень протекания анаэробных биоэнергетических реакций, понижаясь при активации катаболических процессов и повышаясь при формировании гипобиотических состояний. Для проверки высказанных предположений мы изучили влияние экзогенной

обработки семян различными концентрациями этанола и ацетальдегида на их жизнеспособность и устойчивость к стрессирующим факторам среды.

С помощью 10 мМ растворов этанола мы предприняли попытку вывести из состояния покоя семена пшеницы сорта Якутянка 224, жизнеспособность которых по тетразолиевому методу была 100, а лабораторная всхожесть - 68%. Испытывались методы замачивания семян в 10 мМ растворе этанола при 4 и 20°С с последующим выдерживанием на воздухе при 4°С. Лучшие результаты, всхожесть 100%, были получены при инкубации семян 15 ч в 10 мМ растворе этанола при 4°С с последующим выдерживанием их на воздухе 4,5 ч также при 4°С. То есть в этом случае этанол усилил эффект холодовой стратификации семян.

Семена пырея ползучего, относящегося к дикорастущим злакам, могут находиться длительное время в состоянии послеуборочного покоя. Они имели высокую жизнеспособность (77+3%), но низкую всхожесть (12+2%). При замачивании в 10 мМ растворе этанола при комнатной температуре всхожесть семян увеличивалась в 1,5 раза, а дополнительное выдерживание их при температуре 4 - 5°С повышало всхожесть в 2,5 раза.

Таким образом, малые концентрации этанола могут активизировать ростовые процессы и увеличивать всхожесть жизнеспособных семян как культурных, так и дикорастущих растений.

Выявив на физиологическом уровне положительное влияние низких концентраций этанола и ацетальдегида на жизнеспособность и всхожесть семян, мы попытались изучить некоторые биохимические механизмы этого явления.

Если подойти к вопросам сохранения и повышения жизнеспособности семян растений с позиций биоэнергетики, то можно предположить, что жизнеспособность семян базируется на сохранении на оптимальном уровне активности катаболических дегидрогеназных и аэробных систем. Поэтому мы изучили изменения активности ряда ключевых дегидрогеназ и пероксидазы на ранних этапах прорастания семян, при длительном хранении и влияние на них различных экзогенных концентраций этанола и ацетальдегида.

В покоящихся семенах пшеницы активности АДГ и пероксидазы соизмеримы (рис. 4). При прорастании семян с появлением корней и побегов активность АДГ резко снижается к шестому дню практически до нуля, а активность пероксидазы повышается в надземной части в 1,8-2,0, в корнях в 12-14, а в зерне в 4-5 раз.

В покоящихся семенах пшеницы сорта Скороспелка улучшенная урожая разных лет изучены активности не только пероксидазы и АДГ, но и некоторых других резервных катаболических и анаболических дегидрогеназ: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и NADP-зaвиcимoй изоцитратдегидрегеназы. Как видно из результатов, приведенных в табл. 2, с понижением жизнеспособности семян коррелирует уменьшение активности изученных дегидрогеназ, а снижение активности пероксидазы - с понижением всхожести семян. Полученные данные позволили сделать вывод, что дегидрогеназы, в том числе и АДГ, необходимы прежде всего для сохранения

Уадг, мкмоль/минт Упо? мкмоль/минт

Время, дни

Рис. 4. Активность АДГ (1) и пероксидазы зерен (2) проростков (3) и корней (4) пшеницы сорта Якутянка 224 в зависимости от времени проращивания.

Таблица 2. Активность ферментов (мкмоль/мин г сухой массы) семян пшеницы сорта Скороспелка улучшенная в зависимости от сроков сбора урожая.

Срок Жизне- Всхо- Активность ферментов, (%)

хранения способ- жесть,

семян, год ность, % % АДГ ПО Г6ФДГ ицдг

1 99+1 96+2 2,89 3,15 1,75 2,83

(100) (100) (100) (100)

3 88+2 79+5 1,56 1,59 1,22 2,11

(53,9) (50,5) (68,6) (74,6)

5 56+2 24+2 1,26 0,75 0,78 1,39

(43,6) (23,8) (44,6) (49)

жизнеспособности семян и при запуске процессов, связанных с их прорастанием. Далее при прорастании происходят интенсификация аэробных биоэнергетических процессов, активация оксидаз, включая пероксидазу. При этом резкое возрастание активности пероксидазы может свидетельствовать о том, что фермент участвует в активизации пусковых механизмов прорастания семян, инициируя реакции свободнорадикального окисления, которые через активизацию ПОЛ могут способствовать возрастанию дыхательной активности митохондрий.

Для проверки высказанного предположения был проведен следующий эксперимент. Семена пшеницы сорта Скороспелка улучшенная (всхожесть- 44, жизнеспособность - 70%) проращивались в течение трех дней и дифференцировались на проросшие и непроросшие семена. У семян этих двух групп определялась активность АДГ и пероксидазы. Из табл. 3 видно, что у непроросших семян активность АДГ возрастает на 13-21%, а пероксидазы почти не изменяется, в то время как в прорастающих семенах наблюдается снижение активности АДГ на третий день прорастания в 5,4 раза при увеличении активности пероксидазы в 2,0 раза. Эти результаты указывают, на то что для прорастания семян необходима

не просто активация всех биоэнергетических процессов, а переключение дегидрогеназных реакций на аэробные.

Таблица 3. Активность АДГ и пероксидазы (мкмоль/мин г сухой массы) в жизнеспособных прорастающих и находящихся в состоянии покоя семенах пшеницы сорта Скороспелка улучшенная.

Семена Время прорастания семян, сут АДГ Пероксидаза

Контроль(сухие) - 3,8+0,3 3,0+0,3

Проросшие 1 2,1+0,3 7,2+0,7

3 0,7+0,1 8,5+0,8

Непроросшие, 1 4,3+0,4 2,4+0,2

жизнеспособные 3 4,6+0,4 3,5+0,2

Мы предположили, что малые концентрации этанола или ацетальдегида оказывают свое влияние именно на эти механизмы.

Результаты, приведенные в табл. 4, подтверждают сделанное предположение. Увеличение всхожести семян пшеницы наблюдается в тех случаях, когда обработка малыми концентрациями этанола способствует активации пероксидазы и снижению активности АДГ. Тогда как активация пероксидазы, не сопровождающаяся уменьшением активности АДГ (50 - 65 мМ ацетальдегид), приводит к снижению всхожести. В случае если отмечается совместное уменьшение активности пероксидазы и АДГ, то это может служит показателем снижения жизнеспособности семян.

Таблица 4. Влияние обработки семян пшеницы сорта Скороспелка улучшенная растворами этанола и ацетальдегида на их жизнеспособность, всхожесть, активность АДГ и пероксидазы (мкмоль/мин г сухой массы) на 4-тые сутки после начала проращивания.

Реагенты Концентрация, мМ Жизнеспособность,% Всхожесть, % Активность ферментов

АДГ ПО

Контроль(сухие) - - - 2,6±0,3 2,3±0,2

Вода 92+2 79+5 1,0+0,1 6,8+0,4

Этанол 1,0 93+2 91+3 0,6+0,1 8,0+0,4

10,0 93+2 89+3 0,3+0,1 8,5+0,3

100,0 89±3 76±6 1,3±0,1 6,2±0,3

500,0 88+4 70+5 1,8+0,2 5,9+0,4

1000,0 43±4 25±5 3,0±0,3 3,7±0,4

Ацетальдегид 0,1 92+2 80+3 1,0+0,1 7,1+0,4

10,0 92+2 82+4 1,1+0,1 6,6+0,3

25,0 91±3 75±5 1,5±0,1 6,0±0,3

50,0 88+6 56+4 2,0+0,2 4,8+0,2

65,0 70+4 44+4 2,9+0,3 3,3+0,2

80,0 20±5 3±1 0,8±0,1 2,2±0,1

Известно, что устойчивость живого организма зависит как от природы, так и интенсивности и продолжительности действия стрессирующего фактора. При условии, если компенсаторные силы организма способны противостоять воздействию, то метаболическая система организма после окончания воздействия возвращается к исходному уровню, быстро восстанавливая возникшие нарушения, мобилизуя свой адаптационный потенциал. Однако, если воздействие выходит за рамки толерантности биологической системы, то это может приводить к серьезным структурным нарушениям, без возможности последующей регенерации нарушенных метаболических процессов, завершающихся гибелью организма.

Для проверки выдвинутых предположений нами изучена резистентность и реактивность семян пшеницы сорта Якутянка 224 и караганы при температуре 65°С. Воздействию подвергались семена караганы 95-97 и пшеницы 98-100%-ной жизнеспособности. Показано, что процент всхожих семян пшеницы в течение 6-ти часов воздействия колеблется в пределах 78-98 (рис. 5,а), с резким понижением всхожести семян в конце температурного воздействия до 35-38%. У караганы отмечены колебания во всхожести в пределах 20-92, с понижением до 5-8% (рис. 5,6). Тогда как жизнеспособность семян пшеницы снижается после 6-ти, а караганы - 3-х часов температурного воздействия (рис. 5). При этом активность АДГ пшеницы в течение 6-ти часов изменялась в пределах 2,9-3,3 мкмоль/мин г

А,%

а

А, %

б

т

юо

0 2 4 6 8

0 2 4 б а

Время, ч

Рис. 5. Влияние температуры (65°С) на всхожесть (1) и жизнеспособность (2) семян пшеницы сорта Якутянка 224 (а) и караганы (б).

(рис. 6,а), с возрастанием в конце воздействия до 3,5 мкмоль/мин г, а активности пероксидазы - 3,5-4,3, с понижением в конце до 0,9 мкмоль/мин г. У караганы отмечались аналогичные колебания в активности АДГ и пероксидазы, но с более значительными отклонениями в 26,5 - 31,8 и 23,5 - 31,4 мкмоль/мин г соответственно (рис. 6,6). В конце воздействия активность АДГ соответствовала 28, а пероксидазы - 0,15 мкмоль/мин г.

В зависимости от продолжительности стрессового воздействия, представленного на рисунке 5, на кривой всхожести семян можно выделить три временных периода. В начальный период, продолжительностью 1,5-2 часа, отмечается повышение всхожести семян пшеницы на 10-18, а у караганы на 27-45% от исходной, в этот период отмечается снижение активности как АДГ, так и пероксидазы (рис. 6). Во второй период, продолжительность которого обычно составляет 4-5 часов, всхожесть семян может как повышаться, так и понижаться, причем у пшеницы она колеблется в пределах 75-98, а у караганы - 15-75%. При этом, как видно из рис. 5, жизнеспособность семян в этот период поддерживается на высоком уровне и не подвержена сильным изменениям. Однако активности ферментов в этот период приобретают колебательный характер, причем в семенах караганы активность АДГ может повышаться до 24,0-32,0, а пероксидазы - 0,1-3,6 мкмоль/мин г. Тогда как в зерновках пшеницы активность АДГ изменяется от 0,4 до 2,7, а пероксидазы - 2,0-4,0 мкмоль/мин г. В третий период, продолжительностью 1-2 часа, в семенах пшеницы и караганы отмечается резкое падение как всхожести, так и жизнеспособности, при этом наблюдается незначительное повышение активности АДГ и понижение активности пероксидазы. В этот

АЦГ

№ 3,0 ЪО 10

а

'по

- 5,0

Время, ч

Рнс. 6. Динамика активности алкогольдегидрогеназы (1) и пероксидазы (2) (мкмоль/мин г сухой массы) семян пшеницы сорта Якутянка 224 (а) и караганы (б) от времени их прогрева при температуре 65°С.

период сила действующего фактора, возможно, выходит за пределы толерантности организма и компенсаторные механизмы семян не способны регенерировать возникшие нарушения, вследствие чего наступает их гибель.

Таким образом, воздействие температуры может приводить к резким изменениям в протекании метаболических процессов в покоящихся семенах. Причем, у семян караганы реактивность на температуру оказывается выше, чем у семян пшеницы, что выражается в более резких колебаниях во всхожести семян и активности ферментов, но устойчивость к температуре ниже, что отмечается в значительном понижении как всхожести семян, так и активности изученных ферментов.

Известно, что процесс набухания семян и последующий рост надземной части и корней проростков, сопровождаются активацией аэробных метаболических процессов. Условиями для прорастания всех семян являются достаточная влажность, доступ кислорода и благоприятная температура (Николаева и др., 1985). По мере поступления воды в семена в них активизируются метаболические процессы. Причиной положительного влияния кислорода на прорастание семян может быть активизация и поддержание на достаточном уровне процессов дыхания, а также активное окисление веществ, тормозящих процесс прорастания (Якушкина, 1993). Поступающий в митохондрии кислород инициирует протекание окислительного фосфорилирования, обеспечивающего синтез АТФ. Наличие которого будет определять интенсивность анаболических (синтетических) процессов.

Нами изучена динамика активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы и пероксидазы семян пшеницы сорта Приленская 19 в

течение 24 часов набухания. Показано, что в увеличении активности ферментов отмечается индивидуальная периодичность, зависящая от их природы и места локализации. Аналогичная периодичность в увеличении скорости биосинтеза макромолекул была отмечена на 6-9-м и 14-20-м часах прорастания семян гороха (Калинин, 1986). Поэтому наблюдаемая нами периодичность активности ферментов, возможно, обусловлена интенсивностью процессов биосинтеза белков, в том числе и ферментов, и активностью протеолитических ферментов, осуществляющих гидролитическое расщепление белков в клетке.

Наибольшая активность ферментов отмечается в зародыше, а затем по убывающей в щитке и эндосперме. Величины максимальной активности Г6ФДГ, АДГ и пероксидазы в зародыше выше активности ферментов эндосперма в 5, 20, 9,7, а щитка - 3,5, 6, 7,9 раз соответственно.

Показано, что малые дозы УФ-излучения могут изменять активность ферментов в зерновках пшеницы со сдвигом их экстремумов на более раннее время. При этом максимальная активность АДГ и пероксидазы эндосперма понижается на 17-30 и 8-27, щитка - 78-82 и 80-90, зародыша - 75-86 и 70-75 процентов соответственно, при незначительном, всего на 10-25%, снижении активности Г6ФДГ в этих частях семян пшеницы. При снижении общей активности АДГ и пероксидазы в зародыше в 3-4, а в щитке - 5-6 раз. Вероятно, в семенах подвергнутых УФ-излучению скорость протеолиза возрастает преимущественно в щитке и зародыше, а в эндосперме, возможно, из-за наличия высокого содержания антиоксидантов, способных ингибировать свободнорадикальные реакции и таким образом предотвращать разрушение лизосом и выход протеаз, скорость протеолиза может несколько понизиться. Возрастание протеолиза в зерновке после УФ-облучения семян пшеницы приводит к понижению активности АДГ и пероксидазы в щитке в 3-7, 2,5-6 и зародыше - 1,3-1,5, 3-5 раз соответственно. Одной из причин увеличение протеолиза в щитке и зародыше, по-видимому, является возрастание концентрации гидролитических ферментов из поврежденных ультрафиолетом лизосом.

Выход из покоя семян обуславливается интенсивностью биосинтетических процессов прежде всего в зародыше и щитке семян пшеницы. Снижение этих процессов может приводить к понижению всхожести и энергии прорастания зерновок практически до нуля, что мы наблюдали у пшеницы сорта Скороспелка урожая 1983 года. Хотя жизнеспособность зерновок пшеницы сохранялась на уровне 56-60%.

Таким образом, малые дозы УФ-излучения, провоцируя свободнорадикальные реакции могут изменять скорость синтетических процессов в семенах, ускорять биосинтез ферментов в начальный период набухания. Особенно это заметно для мембранных структур, к которым относится щиток. Понижение активности дегидрогеназ и оксидаз в щитке приводит к утрате его функциональной активности, что, возможно, сказывается на его избирательную регуляторную функцию и в целом на всхожесть зерновок пшеницы.

Набухание и прорастание семян всегда сопровождается активированием оксидазных процессов (Гумилевская и др., 1997). УФ-облучение семян может инициировать возрастание ПОЛ, регулируемое в живых организмах компонентами антиоксидантной системы. В инициировании ПОЛ может принимать участие пероксидаза. Действие фермента заключается в том, что субстратами ПО являются органические вещества, окисление которых приводит к образованию в организме свободных радикалов. Контроль за уровнем ПОЛ осуществляется с помощью антиоксидантов, которые также могут окисляться в пероксидазных реакциях. Таким образом, между исследуемыми компонентами должна наблюдаться взаимная зависимость, которую и предстояло выяснить в дальнейших исследованиях.

На рис. 7 показана динамика накопления малонового диальдегида и антиоксидантная активность в зародыше, щитке и эндосперме в процессе набухания семян пшеницы в дистиллированной воде. В течение 24 часов набухания в различных частях семени отмечается плавное возрастание АОА только в эндосперме в 3,3 раза, зародыше - 2,7 раза, а в щитке отмечается понижение антиоксидантной активности на 22-35% (рис. 7,6). Хотя АОА щитка была в начале набухания выше в 12 раз, чем в эндосперме и в 2 раза зародыша. Повышенная АОА в эндосперме и зародыше обеспечивается возрастанием содержания антиоксидантов, способных подавлять свободнорадикальные процессы, что проявляется в своеобразной динамике ПОЛ в этих частях семени. Причем уровень ПОЛ находится в обратной зависимости и возрастает в эндосперме в 2,2 раза, зародыше - в 3,3 раза, с резким увеличением в щитке в 7,2 раза (рис. 7,а). Из приведенных данных видно, что наиболее активно деструктивные процессы протекают в щитке семени пшеницы, что, возможно, имеет важное биологическое значение в пусковом механизме при выходе семян из состояния покоя. Можно предположить, что активация ПОЛ в щитке приводит к нарушению структуры его мембран, вследствие этого создается возможность поступления из эндосперма веществ, повышающих ростовую активность зародыша.

Известно, что низкая температура понижает скорость прорастания семян. В непроросших семенах пшеницы уровень ПОЛ и АО ниже, чем в проросших. Сравнивая значения содержания МДА и АО приведенные в таблице 5 видно, что у непроросших семян и семян пшеницы выдержанных при 5°С эти показатели мало различаются. Таким образом, низкий уровень ПОЛ служит критерием проявления малой активности АФК, при этом по величине ПОЛ и содержанию антиоксидантов можно определять жизнеспособность семян пшеницы. Семена с высоким уровнем ПОЛ и низким содержанием АО всегда способны хорошо и быстро прорастать.

После 24 ч набухания при 20°С семена пшеницы начинают активно прорастать, что проявляется в активизации процессов пролиферации, завершающиеся через 16-24 ч формированием проростка пшеницы. Нами изучено содержание малонового диальдегида и антиоксидантов в прорастающих семенах пшеницы после 24 ч замачивания в дистиллированной воде (рис. 8). Видно, что в процессе прорастания антиоксидантная

-28-

32

46

1---г

---1-'-г

к.

3 .

г.

12

Уб го

¥ ОН 01

гн

Время, ч

Рис. 7. Динамика накопления мало нового диальдегида (а) и антиоксидантов (б) в эндосперме (1), зародыше (2) и щитке (3) семян пшеницы сорта Приленская 19 от времени набухания. Условия: 23°С; среда набухания - дистиллированная вода.

система семян полностью контролирует уровень ПОЛ. Возрастание ПОЛ отмечается на 10 и 24 ч прорастания семян и связано с увеличением АОА (г=0,79). УФ-облучение вызывает в прорастающих семенах пшеницы колебания ПОЛ и АОА, интенсивность которых зависит от времени воздействия (рис. 9). Динамика ПОЛ в проростках уже после минутного УФ-облучения семян пшеницы принимает выраженный колебательный характер

Таблица 5. Содержание малонового диальдегида (нмоль/г сухой массы) и антиоксидантов (мкг/г сухой массы) в не проросших семенах пшеницы сорта Приленская 19 во время проращивания в зависимости от температуры._

Время прорастания зерен, сут Температура, °С

5 20

МДА АО МДА АО

1 24+1 105+5 42+2 90+4

2 27+1 102+4 24+1 78+3

3 29+1 76+3 29+2 36+1

4 23+1 100+5 30+2 93+4

5 32+2 62+2 27+1 20+1

6 29+1 62+2 35+2 95+5

7 26+1 55+2 29+2 96+4

с возрастанием на 4, 12 и 22 ч (г=0,5). При этом АОА в первые часы прорастания семян понижалась, а затем к 18 ч повысилась. После 5 мин УФ-облучения в прорастающих семенах активность антиоксидантной системы вначале прорастания уменьшается, но к 18 ч возрастает в 1,5-1,8 раз (г=0,5). Ультрафиолетовое облучение семян в течение 10, 15 и 20 мин вызывает одновременное увеличение к 6, 12 и 18ч как уровня ПОЛ, так и антиоксидантов (г=0,5-0,92). Повышение ПОЛ в прорастающих семенах

МДА, нмоль/г сухой массы

50

АО 1 30

го н ю

4 8 №

АО, мкг/г сухой массы

-100

16

го

-юо

гА

Время, ч

Рис. 8. Динамика МДА (1) и АО (2) в семенах пшеницы сорта Приленская 19 в течение первых суток проращивания. Условия: 22°С, время замачивания семян пшеницы 24 ч, среда замачивания и проращивания - дистиллированнная вода.

а

б

в

Время, ч

8

Д

12 16 го 24

Ч

Рис. 9. Влияние УФ-облу-чения семян пшеницы сорта Приленская 19 на содержание малонового диальде-гида (1) и антиоксидантов (2) в первые сутки проращивания. Время УФ-облучения семян пшеницы, мин: а-1, б-5, в-10, г-15, д-20. По оси ординат значения соответствующих параметров в %, за 100% приняты значения МДА и АО семян, не подвергавшихся УФ-облучению. Условия те же, что на рис. 8.

Время, ч

всегда, независимо от времени УФ-облучения, находится под контролем антиоксидантной системы, влияние которой проявляется на 16-20 ч прорастания семян пшеницы повышением уровня антиоксидантов в 3-5 раз. Однако при продолжительном УФ-облучении в семенах вырабатываются компенсаторные механизмы противодействующие образованию свободных радикалов в прорастающих семенах пшеницы, использующих кроме антиоксидантов еще, возможно, и другие механизмы подавления ПОЛ, поскольку после 15-20 мин УФ-облучения в прорастающих семенах содержание малонового диальдегида может понижаться несмотря на то, что АОА в них может быть даже ниже уровня контроля.

Таким образом, на основании полученных данных можно высказать предположение, что контроль за уровнем ПОЛ во время набухания и прорастания семян пшеницы, осуществляется с помощью низкомолекулярных антиоксидантов, содержание которых связано с уровнем ПОЛ в зерновках. После УФ-облучения в семенах возрастает уровень ПОЛ. Понижение свободнорадикальных процессов в семенах возможно за счет синтеза большого количества антиоксидантов, концентрация которых при этом возрастает в несколько раз, особенно, в зародыше семян пшеницы. Т.е. отмечается активация АОС в ответ на УФ облучение, проявляемое суперпродукцией антиоксидантов.

Выявленные закономерности, по-видимому, являются проявлением адаптационных компенсаторных механизмов, использование которых позволяет регулировать глубину покоя семян. Уменьшение содержания антиоксидантов, обеспечивает быстрый выход семян из состояния покоя, тогда как накопление антиоксидантов способствует углублению гипобиотического состояния семян пшеницы.

Для определения степени влияния УФ-облучения на дальнейший рост и развитие проростка нами была изучена динамика накопления малонового диальдегида и содержания интегрального количества антиоксидантов в процессе прорастания семян в течение первых 8 дней. Поскольку нас интересовало содержание продуктов ТБК и антиоксидантов в первые дни прорастания семян, когда только начинает формироваться корневая система и надземная часть проростка растения, то в дальнейшем показатели ПОЛ и АО определялись суммарно в проростке, корнях и эндосперме (рис. 10). Из рисунка 10 видно, что содержание МДА и антиоксидантов в проростках в процессе прорастания семян различается. Накопление антиоксидантов в проростках происходит значительно медленнее, чем увеличение содержания продуктов ТБК. В первые пять дней прорастания проростка перекисное окисление липидов возрастает в 7 раз, а содержание антиоксидантов увеличивается всего в 2-2,5 раза. Плавное возрастание содержания антиоксидантов, возможно, связано с тем, что на начальных этапах прорастания проростков активность ПОЛ в них подавляется за счет резервного количества АО, которые накапливаются в семенах в период их формирования осенью. Синтез новых антиоксидантов требует больших энергетических затрат, которые возможны только при активной работе фотосинтетического аппарата проростка, что возможно только в более поздние сроки.

Динамика ПОЛ и содержание антиоксидантов в проростках пшеницы было изучено на 4-7 день их проращивания. Количество МДА и антиоксидантов в зеленых семядолях колебалось в пределах 100-284 и 68-159, корнях - 87-100 и 38-117, а в эндосперме - 100-174 и 65-100 процентов соответственно. Значения малонового диальдегида в эндосперме и корнях проростков пшеницы различаются незначительно, в пределах 26,3-45,7 и 46,6-53,5 нмоль/г сухой массы соответственно, тогда как в зеленых семядолях концентрация МДА в 4-15 раз выше и колеблется от 219 до 623 нмоль/г сухой массы. Содержание антиоксидантов в эндосперме - 0,379-0,579, корнях - 0,65- 1,98, зеленых семядолях - 2,06-4,79 мг/г сухой массы. Показано, что изменение концентрации малонового диальдегида в проростках всегда находится в обратной зависимости от содержания в них антиоксидантов. Причем скорость ПОЛ, определяемая в различных частях растения (зеленых семядолях, корнях и эндосперме зерна) различна. Наиболее высокий уровень ПОЛ и антиоксидантов наблюдается в надземной части проростков, а затем по убывающей в корнях и эндосперме.

Известно, что ультрафиолетовое излучение является инициатором активации процессов ПОЛ в растительных и животных тканях (Sonne, 1929, Рощупкин, 1980). Эффект действия УФ-излучения связан с нарушением целостности мембран клеток вследствие повреждения липидов и, в частности, ненасыщенных жирных кислот. Любой живой организм реагирует на УФ-излучение, причем степень выраженности ответной реакции определяется заложенными в нем адаптационными возможностями. Реакция организма на воздействие может подразделяться в зависимости от силы и длительности действия раздражителя на два этапа - срочной и долговременной адаптации

МДА, нмоль/г АО, мг/г

Дни прорастания

Рис. 10. Изменение содержания малонового диальдегида (1) и антиоксидантов (2) в проростках пшеницы сорта Приленская 19.

(Меерсон, 1986). Срочный этап адаптации возникает непосредственно после начала действия раздражителя, реализуется на базе готовых, ранее сформировавшихся механизмов. Тогда как долговременный этап адаптации инициируется продолжительным воздействием стрессирующего фактора и на основе многократной реализации срочной адаптации. При действии УФ-излучения важное значение для организма имеет мобилизация компенсаторных механизмов. Среди них повышенное внимание предъявляется регуляторным механизмам антиоксидантной системы, целенаправленное действие которых позволяет выживать организмам даже в самых экстремальных условиях. Одним из компонентов таких механизмов является перекисное окисление липидов, реализуемое в организме за счет активации свободнорадикальных процессов, интенсивность которых определяется по количеству образовавшегося малонового диальдегида, хотя малоновый

диальдегид - не единственный ТБК-активный продукт. Развитию спонтанного перекисного окисления липидов в тканях препятствуют, содержащиеся в них антиоксиданты.

Таким образом, по интенсивности протекания перекисного окисления липидов в различных органах можно оценивать неспецифические адаптационные возможности организма, а по содержанию антиоксидантов судить о его компенсаторном потенциале. Причем эти два показателя обычно взаимосвязаны и взаимозависимы.

На рисунке 11 представлены данные по содержанию продуктов ТБК и антиоксидантов в проростках пшеницы, семена которых с влажностью 5-6% подвергались ультрафиолетовому облучению в течение 10-ти часов, с периодичностью отбора проб в течение первого часа через 1,5, 10, 15, 20, 30 и 60 мин, а затем каждый час. В течение всего времени УФ воздействия изученные показатели (ПОЛ и АО) претерпевают фазовые изменения. Первые 20 мин УФ облучения семян (рис. 11,А-Д) вызывает последующее резкое снижение содержания продуктов перекисного окисления липидов в проростках и максимальное возрастание процессов, ингибирующих образование супероксидных радикалов, что проявляется в увеличении интегрального состава антиоксидантов в первые 2-3-и дня их роста. Продолжение воздействия ультрафиолетового излучения на семена в течение 0,5-1 часа приводит к дальнейшему возрастанию компенсаторных механизмов, что проявляется во временной нормализации в проростках показателей ПОЛ и АО (рис. 11,Б,Е, кривые 1,2). Однако уже 2-3-х часовое УФ-облучение семян продолжает стимулировать дальнейшее накопление в них свободных радикалов, что выражается в возрастании в проростках пшеницы в первые три дня как ПОЛ, так и антиоксидантов, после чего эти показатели также синхронно снижаются (рис. 11,Б,Е, кривые 3,4).

Воздействие УФ-излучения на семена более 4-х часов (рис. 11,В,Г, Ж,3) сопровождается активизацией компенсаторных механизмов, что способствует подавлению в первые дни роста проростков пшеницы в них перекисного окисления липидов до уровня 40-60% от контроля, за счет увеличения содержания антиоксидантов на 20-50%. Однако в дальнейшем динамика ПОЛ в проростках начинает приобретать выраженный колебательный характер. Полученные данные полностью согласуются с концепцией Е.Б. Бурлаковой о взаимосвязанной регуляции свободнорадикального окисления липидов и антиокислительной активности.

Таким образом, реализация компенсаторных механизмов в семенах, подвергшихся воздействию (температура, УФ-облучение), зависит от активности системы антиоксидантной защиты (пероксидаза, АО, ПОЛ). Кратковременное действие фактора может активизировать компенсаторные механизмы, за счет которых в семенах происходит ускоренный синтез функционально активных веществ, которые могут выполнять функции антиоксидантов и одновременно ускорять процессы роста и деления клеток, способствуя выходу семян из покоя, что проявляется в повышении всхожести семян. Зато продолжительное действие фактора может углублять покой семян, понижая их энергию прорастания и всхожесть, что,

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 503 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/044.pdf

-35- -36-

В

„у. я /

№

№

80

кО

Г

160 т

80 кО

№

т 80 ко

6 8

8 г к

Время, дни

6 8

Время, дни Рис. 11. Влияние УФ-облучения семян пшеницы сорта Приленская 19 на

содержание малонового диальдегида (А,Б,В,Г) и антиоксидантов (Д,Е,Ж,З) в их зеленых проростках. Время УФ-облучения семян пшеницы, мин: А и Д - (1)-1, (2)-5, (3)-10, (4)-15, (5)-20; Б и Е - (1)-30, (2)-60, (3)-120, (4)-180; В и Ж - (1)-240, (2)-300, (3)-360, (4)-420; Г и З - (1)-480, (2)-540, (3)-600. По оси ординат -значения соответствующих параметров (в %), за 100% приняты значения МДА и АО проростков, не подвергавшихся УФ-облучению

возможно, связано со значительным расходом пластического материала на активирование компенсаторных механизмов и, в частности, системы антиоксидантной защиты.

3. Взаимосвязь между компонентами основных метаболических процессов, принимающих участие в формировании гипобиотических состояний

Состояние гипобиоза семян поддерживается за счет разнообразных регуляторных механизмов, участие в которых принимают различные функциональные соединения, среди которых следует выделить стероидные гликозиды и аскорбиновую кислоту, способных накапливаться в растениях в периоды их активной вегетации, в особенности, в период формирования семян. Проявлением их действия может быть регулирование активности пероксидазы, осуществление контроля за уровнем ПОЛ, участие в окислительно-восстановительных реакциях метаболических процессов растений. Возможно, эти особенности действия СГ и АК в организме могут являться элементами механизмов формирования гипобиотических состояний, что и предстояло доказать в дальнейших исследованиях.

Нами было изучено содержание СГ и АК в набухших и проросших семенах ячменя, пшеницы и красоднева желтого. Замачивание семян в воде в течение суток, приводило к возрастанию стероидов в 1,5-5,0 раза и к понижению содержания АК. На 3-4 день проращивания в зеленых семядолях содержание СГ возрастало в 4-5 раз, а в корнях в 2,5-3,0 раза. В непроросших семенах концентрация сердечных гликозидов может колебаться, но в целом всегда имеет тенденцию к понижению. Так, например, у семян красоднева желтого в течение 10 дней проращивания в непроросших семенах отмечено возрастание содержания СГ и АК в 5,0-6,5 раза. Однако уже через 30 дней эти показатели у непроросших семян снижаются до уровня контроля.

Таким образом, возрастание содержания СГ всегда отмечается при активации ростовых процессов в семенах, а их понижение связано с углублением гипобиотического состояния. Тогда как концентрация АК наоборот в покоящихся семенах всегда выше, чем в активно метаболизирующих. Одной из причин накопления АК в непроросших семенах может быть то условие, что из-за ослабления процессов дыхания в этих семенах интенсивность окислительно-восстановительных процессов резко понижена, поэтому расходование метаболитов этих процессов не происходит.

Изучено содержание СГ и АК в зародыше и эндосперме семян ячменя и пшеницы сорта Якутянка 224 (табл. 6). Показано, что в эндосперме семян ячменя со всхожестью 76% СГ и АК содержится больше на 30 и 37% соответственно, чем в зародыше. Тогда как в эндосперме семян пшеницы с лабораторной всхожестью 28%, но высокой жизнеспособностью (86%) стероидов содержится на 20, а АК на 30% меньше, чем в зародыше.

Таблица 6. Содержание СГ и АК (мг/100 г) в эндосперме и зародыше семян ячменя и пшеницы. Условия: семена замачивали 17 часов в воде.

Семена растений Всхожесть, % Жизнеспособность, % СГ АК

Эндосперм Зародыш эндосперм зародыш

Ячмень Пшеница сорт Якутянка 224 76+3 28+1 92+5 86+4 0,93+0,05 0,37+0,02 0,65+0,03 0,46+0,2 12,6+0,9 3,3+0,1 8,0+0,5 5,6+0,2

Эти изменения служат подтверждением того, что содержание и состав функционально активных соединений эндосперма может оказывать влияния на интенсивность метаболических процессов в зародыше. Понижение концентрации СГ и АК в эндосперме приводит к замедлению процессов деления и роста клеток зародыша. Это условие реализуется на начальных этапах развития, когда автономность зародыша, отражающее его независимость развития от окружающих тканей, и проявляющееся в способности нормально развиваться вне материнского организма, еще очень слабо выражена и эндогенные функционально активные вещества эндосперма лимитируют дифференциацию и рост клеток (Батыгина, 1987). Для подтверждения высказанных предположений мы исследовали экзогенное влияние СГ на выход семян из состояния гипобиоза и рост проростков. Замачивание и проращивание семян проводили в водных растворах строфантина 0,025-250 мкг/мл. Строфантин может избирательно влиять на всхожесть и рост вегетативной массы проростков. Высокие концентрации строфантина оказывают сильное угнетающее действие на всхожесть семян овса и караганы независимо от условий замачивания и проращивания. Тогда как эти же концентрации строфантина на семена ячменя и пшениц сортов Скороспелка и Якутянка 224 оказывают стимулирующее действие. Малые дозы строфантина (2,5-0,025 мкг/мл) на семена всех видов оказывали преимущественно стимулирующее действие, повышая всхожесть на 15-30 и

увеличивая вегетативную массу проростков на 20-25%. Причем следует отметить, что как ингибирующий, так и активирующий эффекты строфантина проявляются особенно сильно при предварительном замачивании семян в растворе. Для семян овса и караганы при замачивании и проращивании в растворе строфантина отмечается ингибирующий эффект, который аддитивно возрастает, если эти два действия производятся последовательно. Активация всхожести семян малыми дозами строфантина наблюдалась, в основном, если семена проращивались в растворе

Таким образом, действие строфантина в отношении семян специфично и избирательно в зависимости от вида растения. Причем накопление СГ в одних, например, в семенах ячменя и пшениц может активировать скорость протекания метаболических процессов и, следовательно, выход их из состояния гипобиоза, тогда как для семян овса и караганы такое повышение

стерондов наоборот приводит к снижению уровня метаболизма и вследствие этого к углублению покоя.

Следует отметить активирующее действие строфантина на семена пшеницы сорта Скороспелка с очень низкой всхожестью. Причем как малые, так и высокие дозы строфантина на эти семена преимущественно оказывают активирующее действие.

Строфантин и АК по своему действию относятся к группе антиоксидантов. Являясь органическими веществами они участвуют, как было показано выше, в пероксидазных реакциях, поэтому строфантин и АК могут оказывать влияние на активность фермента, что, по-видимому, проявляется при малых концентрациях в виде повышения всхожести семян, тогда как высокое содержание антиоксидантов понижает всхожесть семян, углубляя их покой.

Таким образом, между содержанием АО и активностью пероксидазы в семенах должна наблюдаться взаимная зависимость, наличие которой мы и постарались доказать следующими экспериментами.

Нами изучена активность пероксидазы и содержание антиоксидантов в семенах пшеницы в течение 24 часов набухания при 5 (I группа) и 23°С (II группа). Показано, что процесс набухания семян сопровождается повышением активности как фермента, так и содержанием АО. Активность пероксидазы и содержание АО в зародыше у семян I группы было выше в 1,5 раза. У этих же семян в процессе набухания повышается активность пероксидазы в эндосперме и плодовой оболочке (перикарп) в 1,5 и 1,8 раза соответственно.

Активность пероксидазы в проростках пшеницы, семена которых замачивали при 5 и 23°С, проявлялась в своеобразной динамике и зависела от природы исследуемых частей (зерновка, надземная часть или корни проростков). Отмечался линейный рост активности пероксидазы в зерновках с небольшим опережением у семян II группы. Зависимость активности пероксидазы надземной части проростков пшеницы имела вид "качелей" с постепенным снижением в течение 3-4 дня, а затем повышением к 7-му дню прорастания проростков. Причем более высокие показатели активности пероксидазы были у семян II группы. Своеобразная динамика проявлялась в активности пероксидазы корней. В корнях семян II группы в течение 2-3 дня активность пероксидазы понижалась и только на 7-ой день отмечался ее рост. Зависимость активности пероксидазы у корней семян I группы принимала вид затухающих колебаний с возрастанием на 3-й и 6-й день, с понижением к седьмому дню прорастания корней до нормы. Причем активность пероксидазы в корнях семян I группы была в 1,5-2,5 раза выше, чем у корней семян II группы.

Нами отдельными экспериментами было показано отсутствие в супернатанте активаторов и ингибиторов пероксидазы. Поэтому мотивацией к повышению активности пероксидазы является, по-видимому, проявление компенсаторных антиоксидантных механизмов, направленных на предотвращение развития окислительного повреждения тканей (Бурлакова и др., 1975), вызванных воздействием низких температур. Ключевую роль в развитии окислительного повреждения играют активные формы кислорода и

органические радикалы (Владимиров, Арчаков, 1972), образование которых наиболее интенсивно протекает в корнях растений (Минибаева и др., 1997).

Важную роль в повышении активности пероксидазы могут выполнять конформационные перестройки глобулы вновь синтезированных форм пероксидазы при низкой температуре, затрагивающие активный центр фермента. Причиной этих изменений могут служить SH-группы, которые каждый изофермент пероксидазы содержит по 6-8 и в нативном ферменте, синтезированном при 20-22°С, они образуют 3-4 дисульфидные связи (Shin et al., 1971). Причиной изменения структуры пероксидазы может быть нарушения фолдинга при низких положительных температурах (Упоров, Егоров., 1997), в результате этого на поверхности глобулы фермента появляются свободные SH-группы. Приобретенная таким образом лабильность структуры проявляется в повышении активности фермента. Аналогичные изменения наблюдали у рибулозодифосфаткарбоксилазы холодостойкой линии томата, у которой сохранение SH-групп со про во ждалось проявлением более высокой устойчивостью к низким температурам (Graham, Patterson, 1982).

Увеличение активности пероксидазы может быть вызвано синтезом на холоде в семенах пшеницы новых изоферментов пероксидазы или накоплением соединений, являющихся субстратами фермента, индуцирующих его синтез, что будет проявляться в возрастании активности пероксидазы. Однако высокие концентрации субстратов пероксидазы могут ингибировать фермент, способствуя таким образом увеличению концентрации перекиси водорода в клетках.

Подтверждением высказанных предположений являются данные по динамике содержания МДА и АО в корнях и надземной части проростков пшеницы семян I и II групп. Показано, что показатели уровня ПОЛ и содержания АО находятся в прямой зависимости (г=0,5). Повышение содержания АО преимущественно сопровождается повышением ПОЛ, тогда как активность пероксидазы возрастает с уменьшением содержания антиоксидантов (г=-0,65). В случае увеличения содержания АО отмечается понижение активности пероксидазы, а увеличение активности пероксидазы сопровождается понижением уровня ПОЛ (г=-0,65). Величины показателей корреляции, возможно, были выше, если бы при проведении анализа учитывалось влияние всех компонентов антиоксидантной системы (супероксиддисмутаза, каталаза и т.д).

Наблюдаемые изменения возможно объяснить в рамках единого представления о роли пероксидазы и АО, являющихся компонентами антиоксидантной системы, в регулировании процессов перекисного окисления в живых организмах. Пероксидаза способна использовать в качестве субстратов антиоксиданты и перекись водорода. Фермент катализирует реакцию в которой АО окисляются, а перекись водорода восстанавливается до воды. Однако в высоких концентрациях антиоксиданты способны ингибировать фермент и таким образом способствовать увеличению уровня ПОЛ в клетках. Взаимная регулируемость системы позволяет

контролировать ПОЛ в живых организмах и поддерживать его на определенном, постоянном уровне.

Нами изучены каталитические параметры пероксидазы 7-ми суточных проростков пшеницы. Показано (табл. 7), что различия в величинах Кт по ОДН пероксидазы проростков и корней, а также Ут проростков пшеницы семян I и II групп незначительны. Основные изменения наблюдаются у Кт по АК пероксидазы корней пшеницы семян I и II групп. Величины Кт семян I группы выше в 1,5-2 раза, по сравнению с семенами II группы. Значения Ут по ОДН и по АК пероксидазы корней пшеницы семян I группы в 1,5-2 раза выше, чем корней пшеницы семян II группы. Тогда как Кт по АК пероксидазы корней пшеницы семян II группы в 2-7 раз ниже, чем у пероксидазы надземной части проростков этой же группы. Следует отметить различия в показателях Кт по ОДН корней пшеницы, которые были в 1,5-3 раза выше, чем у пероксидазы хрена. Так же можно отметить сильные различия в Кт по АК для пероксидазы хрена, от пероксидазы из надземной части и корней проростков пшеницы. Кт по АК в 3-13 и 6-19 раз ниже у корней пшеницы зерен I и II групп соответственно, чем у пероксидазы хрена. Такую высокую разницу в значениях Кт можно объяснить, во-первых, за счет того, что в исследованиях были использованы гомогенаты корней пшеницы, содержащие весь спектр изоферментов пероксидазы. Тогда как пероксидаза хрена являлась очищенным препаратом, в составе которого преимущественно изоферменты С и В (Андреева, 1988). Во-вторых, наличием в гомогенате тканей большого количества антиоксидантов, являющихся субстратами пероксидазы, в присутствии которых окисление ОДН и АК может возрастать.

Поскольку пероксидаза и антиоксиданты входят в единую систему защиты растений от окислительного стресса, то нами было изучено их участие в регулировании уровня ПОЛ на 3-5 день прорастания семян пшеницы, проращивание которых проводили при 28°С. Показано, что в надземной части проростков зерновок пшеницы уровень АО понижается на 4-5 сутки в 1,4-1,5, при повышении активности пероксидазы в 1,8 раза. По-видимому, в этот период контроль за уровнем ПОЛ в побегах резко снижается, что проявляется в возрастании содержания МДА в 1,5 раза. В корнях проростков пшеницы на 4-й день прорастания уровень ПОЛ возрастает в 1,5, при этом содержание АО и активность пероксидазы понижается в 2,4 и 1,2 раза соответственно.

Таким образом, контроль за уровнем ПОЛ в проростках пшеницы осуществляют как низкомолекулярные антиоксиданты, так и пероксидаза. При этом известно, что в надземной части проростков больше содержится АО и меньше пероксидазы, чем в корнях проростков пшеницы. Поэтому ведущую роль в регулировании ПОЛ в надземной части преимущественно выполняют низкомолекулярные антиоксиданты, где за счет активного фотосинтеза идет их накопление. Тогда как в корнях эта функция возложена на пероксидазу, высокая активность которой обеспечивает поддержание определенного уровня ПОЛ. Высокие концентрации АО могут ингибировать пероксидазу,

о-

X

s х

Оч

о

+1 о

X §

^ S

4Н чч

Р о о

II ON m

'—1 (N

Я

<N

+1 +1

О О

^ ^t СП

+1

+1 00

+1 о о

+1

(N ^ —1

+1 +1 +1

t— '—(N

(N i—i 1

(N1 +1

К tí о

rs

+1 (N

чо

+1 <N

-H

Г-

чо

<N

-H

ON СП

■4t +1 с-

CX

О «

+1 о г-

+1+1+1 — «о оо

+1 о

s

X

ч: о

+1 (N (N

СП Г^

+t +1 О

чо чо

(N +1

3

S «

о £

+1 ON (N

r-H

X

го

+1

ON +1

(N +1

+1 (N

X

S §

+1

Д

tí О

+1 Os

+' +1

Ol +1 ЧО

e >

+1 о

X Ч О

+l сч

ЧО

Tt +1 г-

СЧ +1 ON

+1 (N

X en

+1

о

X Q,

(N +1 oo

+1

+1 +1 О ЧО CD СЧ

О

+1 On

>> u

X

О

+1 ^t-

+1 on

+1 ON

+1

X

Q.

&

5

6

•e-

S3

G.

Я

X

5

о

6

Ù

поэтому накопление или понижение содержания антиоксидантов в проростках может регулировать активность фермента.

Для подтверждения этого предположения мы изучили влияние низкой температуры (+5°С) во время 24 ч набухания зерновок на динамику уровня ПОЛ, АО и активность пероксидазы проростков пшеницы в течение 3-5 суток прорастания. Как видно из таблицы 8, в основном, наблюдаются взаимозависимые колебания исследуемых параметров. При этом понижение активности пероксидазы сопровождается возрастанием уровня ПОЛ, а повышение содержания АО приводит к понижению активности пероксидазы. Понижение активности пероксидазы чаще всего наблюдается при повышении уровня АО, что, по-видимому, обусловлено ингибированием фермента высокими концентрациями антиоксидантов. Такие взаимные колебания компонентов АОС реализуются в проявлении "пинг-понг"- механизма.

Таким образом, установлено взаимное влияние пероксидазы и низкомолекулярных АО при прорастании семян пшеницы. Пероксидаза активно участвует в формировании пусковых механизмов прорастания, поскольку в реакциях пероксидазного окисления различных субстратов, в том числе и антиоксидантов, могут образовываться свободные радикалы, способные ускорять процессы свободнорадикального окисления, инициирующие ПОЛ на начальных этапах прорастания семян пшеницы. Таким способом пероксидаза, являясь окислительно-восстановительным ферментом, по-видимому, осуществляет контроль за уровнем перекиси водорода и содержанием антиоксидантов в семенах и проростках пшеницы, а АО накапливаясь в тканях участвуют в реакциях подавления образования свободных радикалов, при этом их избыток может ингибировать фермент. В процессе метаболизации антиоксидантов изменяется их концентрация, что может проявляться в регулировании активности пероксидазы и осуществлении общего контроля над деятельностью системы антиоксидантной защиты. Действие низких положительных температур на семена во время их замачивания, характеризующееся изменением активности пероксидазы и содержанием АО в прорастающих семенах и проростках пшеницы, может свидетельствовать о проявлении реактивности проростков на действующий фактор. Поэтому в совокупности эти показатели могут служить критериями адаптированности проростков к стрессирующим факторам.

Действие БАВ может проявляться в понижении скорости протекания биосинтетических процессов или ингибировании активности ферментов семян пшеницы. Причем высокие концентрации антиоксидантов могут понижать активность пероксидазы и за счет этого регулировать продолжительность гипобиотического состояния семян. Ведущую роль в поддержании гипобиоза семян пшеницы выполняет пероксидаза, уменьшение активности которой углубляет покой семян, что проявляется в задержке их прорастания и понижении всхожести. Для подтверждения этого предположения мы изучили влияние различных концентраций аскорбиновой кислоты и гидрохинона на всхожесть семян пшеницы, определяя в них содержание этих антиоксидантов и активность пероксидазы. Замачивание семян проводили при 23°С в течение 24 ч. Показано, что набухание

http : //zhurnal. аре. relarn. ru/article s/2001/044. pdf

-44-

Я А

я

о ей

5 «

О

X

6

я я s

о

s «

s

о

С

б О

св

s «

О X >. О U

и «

s

<Э <

8 ей

s

3Я О X >-, о

Л

ч о

s

я <

«

S

<L> ft да

s

к «

s я а

о «

Ö

св №

S

sa а о w

ей «

Я tr ей S

ей

Я

I

ей ft О ft

Я «

§

D ft PQ

Я Ö ft

w

я я

11

Z —

^ ^ 2 -

s Сг

t~- г- го

О О •H N «

Wi h- « — ЛО 2 2

WO ~ wo ON

— __ ЧО

s c* 2

S ^f

rr «л

^-ч о О СЛ

00 in

2 "fr

„ 00

г-

in —С

»NN

С4

M Vû 1-— "Sf

—( F- —

ir> <N <N ЧО -и, ЧО

О О

¡Я о

& 2g

<N lO <N ГЧ — —

ci « m «

<N '—i C-J -—<

m o\ ЧО m —« es

Ь S 00 ~

m — <N

Z, » 2-H

P

Г- <N O О OO <N <N —'

Cs) ^ <N

(N

семян в различных растворах АК и гидрохинона приводит к понижению их всхожести при одновременном понижении активности пероксидазы, которая коррелирует с возрастанием содержания в семенах пшеницы АК и гидрохинона. Установлена положительная корреляция между всхожестью семян и активностью пероксидазы, которые находятся в обратной зависимости с показателями содержания антиоксидантов в семенах пшеницы. Поскольку пероксидаза входит в систему антиоксидантной защиты живых организмов и поэтому совместно с каталазой, супероксиддисмутазой и другими ферментами пероксидаза может предохранять организмы от действия активных форм кислорода, защищая ткани от окислительного шока. Возможно, поэтому в семенах пшеницы, а затем и в проростках отмечается высокая активность пероксидазы. При набухании семян в воде в них возрастает дыхание, что сопровождается увеличением активности пероксидазы, особенно, проявляющееся при прорастании семян. Фермент окисляет широкий спектр органических соединений, среди которых имеются и вещества обладающие антиокислительной активностью, в высоких концентрациях ингибирующих пероксидазу. Вероятно, поэтому высокие экзогенные концентрации АК и гидрохинона могут ингибировать пероксидазу семян пшеницы, при этом понижая их всхожесть.

После действия высоких концентраций АК и гидрохинона всхожесть семян пшеницы составляла 8-15%. Замачивание семян в 1 М растворе АК приводило к понижению активности пероксидазы в корнях и надземной части проростков на 2-ые сутки прорастания до 30 и 23, на 3-тьи - 55 и 45, на 4-тые - 55 и 70, а на 6-тые - 62 и 87% соответственно. Набухание семян пшеницы в растворах 50 мМ гидрохинона понижало активность пероксидазы в корнях и надземной части проростков на 2-ые сутки прорастания до 15 и 10, на 3-тьи - 20 и 17, на 4-тые - 27 и 19, на 6-тые - 45 и 42% соответственно. Тогда как, набухание семян пшеницы в растворах низких концентраций АК и гидрохинона практически не влияло на активность пероксидазы в семенах. Для подтверждения избирательности действия антиоксидантов по отношению пероксидазы зерен пшеницы нами было изучено их влияние на активность других ферментов зерен, в частности, алкогольдегидрогеназу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу. Показано, что независимо от концентрации используемых антиоксидантов активности АДГ и Г6ФДГ практически не изменялись в семенах после 24 ч замачивания их в аналогичных растворах аскорбиновой кислоты и гидрохинона.

Подтверждением участия АК в регулировании покоя семян является выполненные нами исследования эндогенного содержания АК в семенах пшеницы до и после замачивания их в воде (табл. 9). Показано, что содержание АК в непроросших семенах пшеницы на протяжении всего срока прорастания сохраняется на достаточно высоком уровне и в 1,5-1,8 раз выше, чем в сухих семенах. Отмечается явная тенденция к понижению содержания АК в проклюнувшихся семенах и в проростках пшеницы по сравнению с уровнем этих антиоксидантов в непроросших семенах. На четвертые сутки прорастания в надземной части и корнях проростков

Таблица 9. Содержание аскорбиновой кислоты (мг/100 г сухой массы) в

семенах и проростках пшеницы сорта Омская 12 во время прорастания.

Время прорастания, сут Семена Проростки

непроросшие проклюнувшиеся корни надземная часть

Контроль (сухие) 15,2+0,5 (100) - - -

1 24,8+0,8 (163) - - -

2 26,4+0,9 (174) 22,4+0,8 (147) - -

3 26,8+0,9 (176) 19,2+0,6 (126) 3,8+0,2 (25) 7,2+0,3 (47)

4 23,6+0,6 (155) 8,0+0,3 (53) 3,6+0,2 (24) 4,0+0.2 (26)

пшеницы уровень АК понижается в 4 раза (табл. 9). Эти изменения в содержании АК могут служить подтверждением участия эндогенных антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян пшеницы.

Еще одним доказательством участия АО в формировании механизмов покоя у семян пшеницы могут служить данные о пребывании семян в условиях повышенной влажности. Из табл.10 видно, что пребывание семян пшеницы в течение 1-4-х суток в воде или растворах этанола и строфантина приводит к резкому понижению их всхожести до 9-22%. При этом в зернах

Таблица 10. Содержание АО, активность пероксидазы и всхожесть зерен пшеницы сорта Омская 12 в зависимости от времени их замачивания в воде, а также в растворах этанола и строфантина. (УФ-облучению подвергали семена с влажностью 5-8% перед их замачиванием в воде)_

Фактор АО, мкг/г влажной ПО, мкмоль/мин г Всхожесть, %

воздей- массы влажной массы

ствия Время замачивания семян, сут

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

Конт- 32 41 43 65 1,63 1,69 1,17 1,17 74 71 44 10

роль, (100) (129) (136) (207) (100) (104) (72) (72) (100) (96) (59) (14)

вода

УФ 29 38 50 95 1,63 1,52 1,22 1,14 85 66 31 14

15 мин, (93) (121) (157) (300) (100) (92) (75) (70) (115) (89) (42) (19)

вода

УФ 36 34 61 63 1,46 1,63 1,52 1,08 81 66 36 14

60 мин, (114) (107) (193) (200) (90) (100) (92) (66) (109) (89) (49) (19)

вода

Этанол, 27 43 68 68 1,52 1,52 1,20 1,17 74 58 32 7

10 мМ (86) (136) (214) (214) (92) (92) (74) (72) (100) (75) (43) (9)

СФ 38 47 63 54 1,75 1,40 1,20 1,05 83 63 37 16

10 мкМ (121) (150) (200) (171) (107) (86) (74) (64) (112) (85) (50) (22)

отмечается повышение содержания АО в 1,7-2,2 раза, с одновременным понижением пероксидазной активности на 28-36%. Предварительное УФ-облучение семян пшеницы провоцирует в них протекание свободно-радикальных процессов, поэтому в ответ на действующий фактор в зернах содержание АО может возрастать в 2-3 раза, особенно это проявляется после 15 мин УФ-облучения. Полученные данные свидетельствуют о том, что пероксидаза способна выполнять роль инициатора процессов прорастания семян, поскольку для углубления покоя семян требуется понижение пероксидазной активности, что, по-видимому, достигается за счет увеличения содержания АО. Эти данные наглядно показывают взаимосвязь между пероксидазной активностью и содержанием АО при реализации механизмов формирования покоя семян.

Таким образом, участие антиоксидантов в механизме покоя семян, по-видимому, обусловлено ингибированием ферментов антиоксидантоной системы защиты растений, в особенности, пероксидазы, что проявляется в экспериментах как in vitro, так и in vivo. Понижение активности фермента высокими концентрациями антиоксидантов способствует углублению покоя семян пшеницы, а активирование пероксидазы - ускоренному их выходу из состояния гипобиоза и быстрому прорастанию согласно следующего механизма, в регулировании которого принимают участие компоненты АОС (пероксидаза, АО), а также этанол и ацетальдегид.

На основании проведенных исследований можно предложить некоторые рекомендации по использованию биологически активных веществ в предпосевной обработке семян. Предварительное замачивание семян в растворах БАВ будет способствовать повышению их посевных качеств, а также сопротивляемости семян и растений к экзогенным патогенным факторам (действию низкой и высокой температуры, микробам и др.). Полученные данные позволяют предложить наиболее оптимальную продолжительность замачивания семян в растворах БАВ - четыре часа. Обработка семян пшеницы функционально активными веществами в течение двух часов способствует повышению их всхожести. Полученные результаты могут быть рекомендованы для практического использования в сельскохозяйственном производстве для повышения урожайности и сопротивляемости семян и проростков пшеницы к действию неблагоприятных факторов среды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключении хотелось бы подвести итог проведенным исследованиям. Формирование гипобиотического состояния есть приспособительный признак, присущий растениям и животным, реализация которого обусловлена наличием в живом организме специализированных систем, способных обеспечивать выживание организма, попавшего в экстремальные условия, существование в которых может привести к его гибели. Одним из компонентов механизмов покоя является антиоксидантная система, поддерживающая жизнеспособность организма, при проявлении его пониженной функциональной активности. При этом компоненты АОС, могут не только обеспечивать продолжительность состояния покоя, но и при создании благоприятных условий, активировать выход из состояния гипобиоза. Ведущим звеном этой системы являются процессы перекисного окисления липидов, запускающие у покоящихся организмов основные процессы жизнедеятельности. Доказательствами этого утверждения служат следующие факты. При создании благоприятных условий (температура, влажность, кислород) семена могут прорастать. Однако предварительно у них должно активироваться дыхание. В покоящихся семенах дыхание крайне ослаблено, отмечаются изменения в составе жирных кислот и функционально активных веществ мембран митохондриальной системы, за счет которых обеспечивается разобщение механизмов окислительного фосфорилирования. Однако, поступивший кислород активирует пусковые механизмы процессов ПОЛ. Контроль за этими процессами осуществляет антиоксидантная система, в составе низкомолекулярных (аскорбиновая кислота, гидрохинон, мочевая кислота, мочевина, глутатион и др.) и высокомолекулярных (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза) соединений. Причем между компонентами системы просматривается взаимная зависимость. Среди ферментов следует выделить пероксидазу, которая обладает широкой субстратной специфичностью, способна катализировать реакции окисления различных органических соединений. Причем особенностью механизма действия пероксидазы является способность фермента катализировать окисление органических субстратов с участием кислорода, т.е. фермент может выполнять роль оксидазы. Оксидазными субстратами фермента служат индолил-3 -уксусная кислота, диоксифумаровая кислота и др. Продуктами окисления в оксидазных реакциях являются супероксид анион-радикал (02) и катион-радикал ИУК, последний в кислой среде декарбоксилируется, превращаясь в радикал скатола. Радикалы скатола могут реагировать в дальнейшем с молекулярным кислородом, образуя перокси-радикалы и далее перекись скатола (Савицкий и др., 1998). Поэтому генерация свободных радикалов пероксидазой в оксидазных реакциях фермента может быть условием для его участия в процессах свободнорадикального окисления в семенах пшеницы, а фермент может выполнять роль инициатора образования свободных радикалов в семенах.

В круг пероксидазных субстратов фермента входят различные функционально активные вещества, в том числе и антиоксиданты. В реакциях индивидуального окисления эти соединения чаще всего являются медленно

-49-

окнсляемымн субстратами, однако, при совместном окислении с быстро окисляемым субстратом, скорость их пероксидазного окисления может возрастать в 100 и более раз. Пероксидаза способна, осуществлять контроль за уровнем перекиси, восстанавливая ее до воды и при этом окислять низкомолекулярные антиоксиданты. В процессе каталитической реакции могут образовываться свободные радикалы, которые в начальный момент прорастания семян, способны инициировать реакции свободнорадикального окисления, активируя при этом протекание перекисного окисления липидов. Высокие концентрации антиоксидантов ингибируют пероксидазу как в реакциях индивидуального, так и совместного окисления, осуществляя таким образом регуляторную функцию. Следует выделить ряд особенностей в проявлении активности пероксидазы в покоящихся и прорастающих семенах. Так, например, в сухих семенах выявляется высокая пероксидазная активность, коррелирующая с уровнем их жизнеспособности. Тогда как низкая активность фермента свидетельствует о понижении жизнеспособности и всхожести семян.

В условиях искусственного гипобиоза, вызванного длительным затоплением семян в воде, у них так же отмечается увеличение содержания антиоксидантов, сопровождающееся уменьшением уровня ПОЛ. Тогда как использование низких концентраций перекиси водорода, при набухании семян, в них повышается пероксидазная активность, коррелирующая с возрастанием их всхожести.

Набухание и прорастание семян сопровождается активированием ПОЛ, изменением в составе антиоксидантов и повышением активности пероксидазы в десятки и более раз. У непроросших семян отмечается повышение содержания антиоксидантов, при пониженном уровне ПОЛ и пероксидазной активности. В прорастающих семенах происходит переключение дегидрогеназных реакций на аэробные, которые могут осуществляться с помощью эндогенных функционально активных веществ. При этом активность АДГ может регулироваться различными концентрациями АТФ, а пероксидазы - ИУК.

Алкогольдегидрогеназа семян при физиологических рН преимущественно способна катализировать реакцию накопления этанола, который в покоящихся семенах может выполнять роль основного энергетического субстрата метаболических процессов. За счет генерации этанола в семенах поддерживается их высокая жизнеспособность и длительная сохранность. При этом реакция восстановления ацетальдегида находится под контролем эндогенных нуклеозидфосфатов (АТФ и АДФ), избыток которых, по-видимому, может ингибировать фермент, регулируя таким образом уровень эндогенных этанола и ацетальдегида в семенах, находящихся в состоянии вынужденного покоя. Тогда как при прорастании семян активизируются метаболические процессы, увеличивающие концентрацию АТФ в проростке, в результате содержание нуклеозидфосфатов начинает накапливаться в системе. Избыточное содержание АТФ в проростках приводит к ингибированию АДГ, что и проявляется в виде понижения активности фермента при прорастании

проростков пшеницы. Таким образом, АТФ может выполнять роль регулятора активности алкогольдегидрогеназы, осуществляя направленное переключение процессов с анаэробных на аэробные, что наблюдается при повышении функциональной активности митохондрий, активизации дыхания.

Избирательность типов ингибирования пероксидазы ИУК обусловлена специализированностью ауксина служить оксидазным субстратом фермента. При этом ИУК может изменять направленность реакций пероксидазы с одного типа на другой, меняя специфичность фермента с пероксидазного на оксидазный, превращая пероксидазу в высокоспецифичную оксигеназу, генерирующую свободные радикалы, необходимость в которых может возникать у растений в процессе развития. Таким образом, ИУК может выполнять роль "триггера" в реакциях окисления, катализируемых пероксидазой. Действие ауксина проявляется, например, при выходе семян пшеницы из состояния вынужденного покоя. Воздействие высокой температуры на семена пшеницы приводит к резкому снижению активности пероксидазы, коррелирующей с понижением их всхожести и жизнеспособности. Пероксидаза может служить критерием оценки посевных качеств семян, тогда как понижение активности фермента характеризует снижение общего уровня метаболических процессов в семенах, понижение активности антиокислительной системы и ослабление работы активационных механизмов, ответственных за прорастание семян.

Предварительное УФ-облучение семян проявляется в резком увеличении активности пероксидазы, повышении уровня ПОЛ и компенсаторным выбросом высоких концентраций антиоксидантов в период проклевывания. Причем наиболее активно возрастание антиоксидантов и ПОЛ отмечается в зародыше семян пшеницы, тогда как в щитке увеличение ПОЛ сопровождается понижением антиоксидантной активности. Возможно, в этом проявляется регуляторный механизм, обеспечивающий нарушение избирательного транспорта функционально активных веществ через щиток. При этом из эндосперма в зародыш начинают активно поступать регуляторы роста, обеспечивающие прорастание зерен пшеницы.

Субстратами пероксидазы могут быть и фитогормоны (абсцизовая кислота, гибберелловая кислота, ауксины и др.), поэтому фермент имеет важное значение в регуляции состава функционально активных веществ. Причем окисление БАВ ферментом способствует генерации свободных радикалов в семенах, а как следствие этого процесса является активизация ПОЛ. Причем вслед за этими процессами в семенах активизируется дыхание, повышается общий уровень метаболических процессов, что проявляется в ускоренном прорастания семян, активно выходящих из состояния покоя.

Для повышения всхожести семян можно предложить разработанный нами метод использования УФ-облучения и низких концентраций антиоксидантов, в предпосевной обработке семян пшеницы. При этом всхожесть семян пшеницы может повышаться на 20-30%. При обработке семян высокими концентрациями антиоксидантов наблюдается понижение всхожести семян, за счет, вероятно, ингибирования перекисного окисления липидов, проявляемое в углублении их покоя. Тогда как при действии малых

доз УФ-нзлучення и низких концентраций антиоксидантов мы наблюдали эффекты активирования процессов свободнорадикального окисления в прорастающих семенах, что позволяет высказать предположение об участии ПОЛ в активировании пусковых механизмов прорастания семян. Возможно, эти же методы могут быть использованы для активизации прорастания семян дикорастущих видов растений.

ОСНОВНЫЕ выводы

1. Определены каталитические параметры пероксидазы, алкоголь- и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ из растительных тканей. На основании кинетических данных предложена модель участия ферментов в формировании гипобиотических состояний растений, обитающих в экстремальных условиях.

2. Показано, что пероксидаза является показателем протекания аэробных метаболических процессов в семенах, активность которой увеличивается при их прорастании, понижение активности фермента может служить критерием углубления покоя семян. Поэтому аскорбиновая кислота и гидрохинон в высоких концентрациях понижая активность пероксидазы, могут способствовать переключению аэробных метаболических процессов на анаэробные, что проявляется в углублении покоя семян и понижении всхожести. Низкие концентрации субстратов пероксидазы при их совместном присутствии наоборот могут активировать фермент, увеличивая скорость протекания метаболических процессов, обеспечивая переход семян из покоя в активное состояние, увеличивая их энергию прорастания и всхожесть.

3. Установлено, что дегидрогеназы (АДГ и Г6ФДГ) и пероксидаза необходимы для сохранения жизнеспособности семян и при запуске процессов, связанных с их прорастанием. При прорастании семян происходит интенсификация аэробных биоэнергетических процессов, активация оксидаз, включая пероксидазу. Причем у непроросших семян, остающихся в покое, активность АДГ возрастает, а пероксидазы почти не изменяется, в то время как в прорастающих семенах наблюдается обратный процесс. Поэтому для прорастания семян необходима не просто активация всех биоэнергетических процессов, а переключение дегидрогеназных реакций на аэробные.

4. Изучена роль стероидных гликозидов и аскорбиновой кислоты в покое семян. В непроросших семенах концентрация стероидных гликозидов может колебаться, но в целом всегда имеет тенденцию к понижению. Возрастание стероидов всегда отмечается при активации ростовых процессов в семенах, а их понижение связано с углублением гипобиотического состояния. В то время как концентрация АК в покоящихся семенах всегда выше, чем в активно метаболизирующих. Одной из причин накопления АК в непроросших семенах может быть то условие, что из-за ослабления процессов дыхания в этих семенах интенсивность окислительно-восстановительных процессов резко понижена, поэтому расходование метаболитов этих процессов не происходит Исследована роль стероидных гликозидов и аскорбиновой кислоты в процессе сезонного развития растений. Показано, что накопление стероидов в семенах наблюдается в период их созревания и выхода из

состояния покоя, но резко понижается в период зимнего хранения. В то время как АК накапливается в семенах осенью и ее концентрация может понижаться в зимний период и при выходе семян из состояния гипобиоза. Содержание АК в различных частях растений распределено равномерно, а кардиостероиды, в основном накапливаются в плодах, листьях, цветках и очень незначительно в корнях.

6. Изучено экзогенное влияние строфантина на выход семян растений из состояния гипобиоза и роста проростков. Высокие концентрации строфантина оказывают сильное угнетающее действие на всхожесть семян растений независимо от условий замачивания и проращивания. Малые дозы строфан-тина на семена оказывают преимущественно стимулирующее действие.

7. Изучено влияние высоких положительных температур на всхожесть семян. Показано, что реакция семян на температуру, зависит от времени воздействия повреждающего фактора и характеризуется сильными колебаниями во всхожести семян и активности АДГ и пероксидазы. Выявленные изменения зависят от видового состава семян растений.

8. Установлена динамика активности Г6ФДГ, АДГ и пероксидазы семян пшеницы в процессе набухания. Показано, что в повышении активности ферментов отмечается индивидуальная периодичность, зависящая от их природы и места локализации. УФ-излучение изменяет периодичность возрастания активности ферментов в семенах со сдвигом экстремумов на более раннее время. В зерновках пшеницы, подвергнутых УФ-облучению отмечено значительное возрастание скорости протеолиза в щитке и зародыше. Выявлено, что понижение активности дегидрогеназ и пероксидазы в щитке коррелирует со снижением всхожести семян.

9. Показано, что контроль за уровнем ПОЛ во время набухания и прорастания зерновок пшеницы, осуществляется с помощью низкомолекулярных антиоксидантов, содержание которых связано с уровнем ПОЛ в зерновках. После УФ-облучения в семенах возрастает уровень ПОЛ. Понижение свободнорадикальных процессов в семенах возможно за счет синтеза большого количества АО, концентрация которых при этом возрастает в несколько раз, особенно в зародыше зерновок пшеницы. Т.е. отмечается активация АОС в ответ на УФ облучение, проявляемое суперпродукцией АО. Выявленные закономерности являются проявлением адаптационных компенсаторных механизмов, использование которых позволяет регулировать состояние покоя семян. Уменьшение содержания антиоксидантов, обеспечивает быстрый выход семян из состояния покоя, тогда как накопление антиоксидантов способствует углублению гипобиотического состояния семян пшеницы.

10. Выявлено, что в процессе прорастания семян пшеницы содержание МДА, АОА и активность пероксидазы в зародыше, щитке и эндосперме различается. Накопление АО в проростках семян пшеницы происходит значительно медленнее, чем увеличение содержания продуктов ТБК. УФ-облучение семян пшеницы оказывает последующее воздействие на процессы ПОЛ, АОА и активность пероксидазы в зеленых проростках, показатели которых претерпевают фазовые изменения. Малые дозы УФ-излучения

стимулируют процессы антиоксидантной защиты, повышают в проростках содержание антиоксидантов и активность пероксидазы.

11. Показано, что действие низких положительных температур на семена во время их замачивания, характеризующееся изменением активности пероксидазы и содержанием АО в прорастающих семенах и проростках пшеницы, свидетельствует о проявлении реактивности проростков на действующий фактор. Поэтому в совокупности эти показатели могут служить критериями адаптированности проростков к стрессирующим факторам.

12. Содержание АК в непроросших семенах пшеницы на протяжении всего срока прорастания сохраняется на достаточно высоком уровне и в 1,5-1,8 раз выше, чем в сухих семенах. Отмечается явная тенденция к понижению содержания АК в проклюнувшихся семенах и в проростках пшеницы по сравнению с уровнем этих антиоксидантов в непроросших семенах. На четвертые сутки прорастания в надземной части и корнях проростков пшеницы уровень АК понижается в 4 раза. Эти изменения в содержании АК могут служить подтверждением участия эндогенных антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян пшеницы.

13. Установлено взаимное влияние пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов при прорастании семян пшеницы. Показано, что пероксидаза активно участвует в формировании пусковых механизмов прорастания семян пшеницы. Поскольку в реакциях пероксидазного окисления различных субстратов, в том числе и антиоксидантов, могут образовываться свободные радикалы, способные ускорять процессы свободнорадикального окисления, инициирующие ПОЛ на начальных этапах прорастания семян пшеницы. Таким способом пероксидаза, являясь окислительно-восстановительным ферментом, по-видимому, осуществляет контроль за уровнем перекиси водорода и содержанием антиоксидантов в семенах и проростках пшеницы, а АО накапливаясь в тканях участвуют в реакциях подавления образования свободных радикалов, при этом их избыток может ингибировать фермент.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1.Угарова H.H., Кутузова Г.Д., Рогожин В.В., Савицкий А.П., Скирда Л.А. Химическая модификация пероксидазы хрена водорастворимыми карбодиимидами. Роль доступных карбоксильных групп фермента в пероксидазном катализе//Биоорг. химия,-1982.-N 9.-Т.8.-С. 1180-1188.

2.Кутузова Г.Д., Рогожин В.В., Угарова H.H., Березин И.В. Функционально важные карбоксильные группы пероксидазы хрена//Доклады АН СССР.-1983,-T.270.-N 4.-С. 994-998.

3.Рогожин В.В., Кутузова Г.Д., Угарова H.H., Березин И.В. Спектрофотометрическое определение числа доступных карбоксильных групп в белках с помощью о-дианизидина и водорастворимого карбодиимида. Влияние функционально важных карбоксильных групп в пероксидазе хрена//Биоорг. химия.-1983.-1Ч 6.-Т.9.-С. 794-802.

4.Рогожин В.В. Значение пропионовокислых остатков гема в функционировании пероксидазы хрена//В сб. тезисы докладов V Респ. конфер. молодых ученых и специалистов. -Якутск. -1984.-С.54-55.

5.Ugarova N.N., Kutuzova G.D., Rogoshin V.V., Berezin I.V.Functionaly important carboxylyc groups in horse radish peroxidase//Biochem. Biophys. Acta.-1984.-V.790,-N l.-P. 22-30.

6.Рогожин В.В., Кершенгольц Б.М., Говорова Т.П. Селективный метод титрования активных центров алкогольдегидрогеназы хлор- и гидрокси-меркурибензоатом//Биоорг. химия,-1988.-N 12.-Т. 14.-С. 1626-1632.

7.Кершенгольц Б.М., Иванов Б.И., Ксенофонтова К.И., Рогожин В.В. Эколого-физиологические и некоторые биохимические аспекты жизнеспособности семян пшеницы в условиях Якутии//Деп. в ВИНИТИ,-1988.-N 6629-В-88.-30 с.

8.Рогожин В.В., Кершенгольц Б.М., Говорова Т.П., Тарасов В.В., Турнин Х.Х. Способ определения концентрации этанола в биологическом материале и выдыхаемом воздухе. А.с.СССР, N1666956,G 01N 33/98, БИ N28, 1991.

9.Рогожин В.В., Кершенгольц Б.М., Говорова Т.П. Получение активного и стабильного препарата алкогольдегидрогеназы зерен пшеницы//В сб.научн. трудов "Краевая патология сельскохозяйственных животных".-Якутск:Изд-во Госкомиздата Я-С ССР.-1990.-С.40-50.

lO.Ivanov B.I., Kershenholz В.М., Ksenofontova K.I., Rogoshin V.V.,Egorova В.S. Wheat seed Formation and Storage Peculiarities in Yakutia in Some Biochemical Mechanisms of Endo - and Exogenous Regulation of their Viability//In.Abstr. of pepers of ISTA/USSR, Seed Symposium, Novosibirsk, 18-20 July 1990 (Zurich, Switzerland).-n.30. -P. 17-18.

11.Рогожин B.B., Кершенгольц Б.M., Иванов Б.И., Егорова П.С. Способ консервирования кормов// Патент N1800954, от 27.05.91.

12. Рогожин В.В., Говорова Т.П. Очистка и некоторые свойства алкогольдегидрогеназы растений//В сб. научн. трудов "Этанол и его метаболизм в высших организмах".-Якутск:изд.ЯНЦ СО АН СССР.-1991.-С. 14-19.

13.Рогожин В.В., Егорова П.С. Влияние экзогенных этанола и ацетальдегида на жизнеспособность семян пшеницы//Там же.-С. 90-99.

14.Рогожин В.В., Романова А.Ю, Рогожина Т.Ю. Резистентность семян пшеницы и караганы {Caragana arborescens Lam.) к воздействию высоких температур//В сб. материалы научной конференции, посвященной 60-летию высшего образования в Республике Саха (Якутии). Якутск. 1994. Вып.2.-С.82.

15.Рогожин В.В., Романова А.Ю, Рогожина Т.Ю. Изучение активностей алкогольдегидрогеназы и пероксидазы в непроросших семенах Hemerocallis lilio-aspodelisiriaM же.-С.45.

16.Рогожин В.В., Сабардахова М.Е., Попова А.С., Рогожина Т.Ю. Сердечные гликозиды в растениях Якутии//В сб. материалов Межвузовской конференции преподавателей физиологии и биотехнологии растений (27-30 сентября 1994) Москва:Из-во МСХА, 1994. С.73-74.

17.Рогожин В.В., Романова А.Ю, Рогожина Т.Ю. Возможные механизмы углубления покоя семян//Там же.-С.72-73.

18.Rogozhin V.V. Biologically active compounds in Yakut plants and animals// 2nd Circumpolar agricultural conference. Tromse, Norway. 4-7 September, 1995. A4.

19.Рогожин B.B., Кершенгольц Б.M., Иванов Б.И., Егорова П.С. Способ консервации зерна на фураж//Патент РФ N 2111676, от 08.09.95.

-55-

20.Рогожин В.В., Попова A.C., Сабардахова М.Е. Способ определения сердечных гликозидов пикратом натрия//3аявка на изобрет.Ш5115784/ 04(027062), от 08.09.95

21.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т., Кершенгольц Б.М. Способ определения концентрации малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты/ЯТатент РФ N 2112241, от 08.09.95.

22.Рогожин В.В., Смирнова Е.В. Способ консервирования фуражного зерна// Патент РФ N2111677, от 15.12.95.

23.Рогожин В.В., Смирнова Е.В. Способ консервации пантов оленя этилацетатом/ЯТатент РФ N95121681/14(037339), от 15.12.95

24.Рогожин В.В., Смирнова Е.В. Способ консервации пантов оленя диэтиловым эфиром//Патент РФ N95121684/14(037337), от 15.12.95

25.Рогожин В.В., Смирнова Е.В. Способ консервации пантов оленя органическими соединениями/ЯТатент РФ N95121119/20(037300), от 15.12.95

26.Рогожин В.В., Смирнова Е.В. Способ консервации пантов оленя смесями простых и сложных эфиров//Патент РФ N 96104419/20(007282), от 05.03.96

27.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Способ иммобилизации биологически активных веществ на биогенном носителе//Патент РФ N 2111765, от 25.04.96.

28.Рогожин В.В. Способ получения иммобилизованного препарата пантокрина/ЯТатент РФ N 96109663/14 (014120), от 25.04.96.

29.Рогожин В.В. Способ консервации пантов оленя смесью "Табакон'7/Патент РФ N 96109665/14 (014126), от 25.04.96.

30.Рогожин В.В., Филиппова Н.П. Влияние ультрафиолетового излучения на активность ферментов зерна пшеницы//В сб. тезисов, докладов "Наука - невостребованный потенциал". Т 2. Якутск:Изд-во Якутского ун-та, 1996. С 73-74.

31.Рогожин В.В., Сабардахова М.Е., Рогожина Т.Ю. Действие стероидных гликозидов на прорастание семян//Там же.- С 74-75.

32.Рогожин В.В. Стероидные гликозиды и аскорбиновая кислота в онтогенезе растений Центральной Якутии//Первая международная конференция "Знание -на службу нуждам Севера",25-29 июня 1996. С.91.

33.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Влияние ультрафиолетового облучения семян на процессы перекисного окисления липидов в проростках пшеницы// Биохимия. -1996.-T.61.-N 8.-С.1432-1439.

34.Рогожин В.В., Сабардахова М.Е., Попова A.C. Действие строфантина на прорастание семян/Я1звестия TCXA.-1996.-N 4.-С.211-218.

35.Рогожин В.В. Возможные механизмы регулирования активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы избытком субстрата и кофермента// Биоорган, химия.-1996.-T.22.-N 8.-С.575-579.

36.Рогожин В.В. Способ определения антиокислительной активности биологического материала//3аявка на изобрет. N96114003/20(020334), от 15.07.96

37.Рогожин В.В. Основные положения теории неустойчивых состояний// В сб.материалы научно-практич. конференции, посвященной Году образования. Якутск. 1997.-С. 51.

38.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Способ иммобилизации биологически активных веществ экстрактов растений//3аявка на изобретение N97104995/20(005050) от 27.03.97.

39.Рогожин В.В., Романова А.Ю. Влияние высоких положительных температур на резистентность семян пшеницы и караганы древовидной {Caragana arborescens Ьат.)//Известия TCXA.-1997.-N 1.-С.36-41.

40.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т., Филиппова Н.П. Влияние ультрафиолетового облучения на активность оксидоредуктаз зерен пшеницы//Известия ТСХА,-1997.-N 3.-С.116-131.

41.Рогожин В.В. Возможные механизмы регулирования каталитической активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы зерен пшеницы//Тез. докл. 2-го съезда Биохимич. общества. (Москва 1997). 4.1. М.,1997. С.59-60.

42.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Влияние УФ-излучения на процессы перекисного окисления липидов в проростках пшеницы//Там же.- С.228-229

43.Рогожин В.В. Иммобилизованные биологически активные вещества на нерастворимом носителе для активизации процессов прорастания семян// Там же,-4.2. С.527-528.

44.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Способ определения общего содержания антиоксидантов в биологическом материале/ЛТатент РФ N 97111918/13 (012245) от 08.07.97.

45.Рогожин В.В. Способ определения общей антиокислительной активно-сти//Патент РФ N 97111917/13(012244) от 08.07.97.

46.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Способ определения содержания флаво-ноидов в биологическом материале/ЛТатент РФ N97111921/13(012226) от 08.07.97.

47.Рогожин В.В. Влияние ультрафиолетового излучения на активность оксидоредуктаз зерен пшеницы//Тез.докл. III Межвузовская методич. конферен.научн. исследований физиол. и биотехнол. растений, (Москва 24-27 июня) М:Из-во МСХА, 1997. С.43-44.

48.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Процессы перекисного окисления липидов в проростках пшеницы//Там же.- С.44-45.

49.Рогожин В.В.. Возможные механизмы действия строфантина на семена// Тез.докл. 4-ой Меяедународной конференции "Регуляторы роста и развития", (Москва 24-26 июня) М:Из-во МГАУ, 1997. С.230-231.

50.Рогожин В.В. Использование иммобилизованных биопрепаратов для активизации процессов прорастания семян//Тез.докл. Международ, симпозиум "Химия и химическое образование ATP XXI век", (Владивосток 6-10 октября) Владивосток:Из-во Дальневосточного ун-та, 1997. С. 188-189.

51.Рогожин В.В. Каталитические свойства глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из зерен пшеницы//Там же.- С. 131-133.

52.Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Аскорбиновая кислота - медленно окисляемый субстрат пероксидазы хрена//Биохимия. -1997. -Т. 62.-N 12. -С. 1686-1690.

53.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т., Филиппова Н.П. Антиоксидантная активность проростков после ультрафиолетового облучения семян пшеницы// Наука и образование.-1997.^ 4.-С.91-97.

-57-

54.Рогожин В.В., Романова А.Ю., Рогожина Т.Ю. Роль оксидоредуктаз в формировании механизмов покоя семян//Тез. докл. научно-практической конференции "Совершенствование научного обеспечения агропромышленного комплекса Республики Саха (Якутия) в условиях рыночных отношений", посвященной 70-летию аграрной науки РС(Я), Якутск, 1997. С.29.

55.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Реализация компенсаторных механизмов в семенах пшеницы после ультрафиолетового облучения//Там же.- С.36-37.

56.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Суперпродукция антиоксидантов в проростках пшеницы, семена которых подвергались УФ-облучению//Тез. докл. регион, научн. конф."Северо-восток России: проблемы экономики и народонаселения", (Магадан, 31 марта - 2 апреля) МагаданЮАО "Северо-востокзолото", 1998, Т.1. С.193-194.

57.Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика пероксидазного окисления 2-хлор-10-(3-диметиламинопропил)-фенотиазина в присутствии пероксидазы хрсна//Биох и м ия. -1998. -Т. 63. -N 5.-С.85-90.

58.Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Влияние антиоксидантов (дигоксина, кверцетина и аскорбиновой кислоты) на каталитические свойства пероксидазы хрена//Биохимия.-1998.-Т.63.-1Ч 6.-С.63-68.

59.Кершенгольц Б.М., Рогожин В.В. Влияние рН и природы ионов среды набухания на прорастание семян пшеницы//Известия TCXA.-1998.-N 1.-С.141-147.

60.Rogozhin V.V. The liability equilibrium of the biological system condition as the basic reserve potential of the living organisms//3rd Circumpolar Agricultural Conference (12-16 October, 1998).-Anchorage, Alaska, USA.

61.Rogozhin V.V. The regulatory corymb role in wheat semen germination//in the same place.

62.Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Влияние функционально активных веществ на пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты и о-дианизидина, катализируемого пероксидазой хрена//Наука и образование.-1998.-N 4.-С.21-26.

63.Рогожин В.В. Роль ПОЛ и пероксидазы в активации пусковых механизмов прорастания семян//Тезисы докл. научно-практической конферен. "Региональные проблемы с.-х производства Республики Саха (Якутия)". Якутск, 1999. С. 15-16.

64.Рогожина Т.В., Рогожин В.В. Роль строфантина G в механизме пероксидазного окисления фенотиазинов//Там же.-С. 16-17.

65.Рогожина Т.В., Рогожин В.В. Механизмы пероксидазного окисления аминазина, трифтазина и тиопроперазина//Там же.-С. 17-18.

66.Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного окисления аскорбиновой кислоты и ферроцианида калия перекисью водорода в присутствии пероксидазы хрена//Биоорган. химия,-1999.-Т.25.-N 1.-С.70-73.

67.Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного окисления гидрохинона и о-дианизидина в присутствии пероксидазы хрена//Биохимия.-1999.-Т.64.-1Ч 2.-С.219-224.

68.Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Механизм угнетения активности пероксидазы салицилатом натрия//Наука и образование.-1999.-N 1.-С.45-48.

69.Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Механизм совместного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона в присутствии пероксидазы хрена// Биоорган, химия.-1999.-Т.25.-1Ч 5.-С.377-382.

70.Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Влияние строфантина в на кинетику пероксидазного окисления медленно окисляемых субстратов пероксидазы// Биохимия.-2000.-Т.65.-N2.-0.254-262.

71.Рогожин В.В. Методы биохимических исследований. Учебное пособие Якутск:Из-во ЯГУ, 1999. 113 с.

72.Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Возможные механизмы проявления фармакологического действия производных фенотиазинов в живых организмах //Тезисы докл. Международной научно-практич. конференции, посвященной 80-летию МГАВМиБ им. К.М. Скрябина. (1-2 июля 1999), Москва, 1999.-С.56.

73.Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Возможное влияние строфантина в на реак-ции пероксидазного окисления фенотиазинов в живых организмах// Там же-С.62-63.

74.Рогожин В.В., Смирнова Е.В. Метод консервации пантов северного оленя кислотно-спиртовыми смесями//Там же.-С. 121-122.

75.Рогожин В.В., Смирнова Е.В. Метод консервирования фуражного зерна этилацетатом//Там же.-С.122-123.

76.Рогожин В.В., Верхотуров В.В., Курилюк Т.Т., Охлопкова Е.П. Влияние температуры, ультрафиолетового излучения и функционально активных веществ на всхожесть семян пшеницы//Известия TCXA.-1999.-N 3.-С. 105-124.

77.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Влияние малых доз ультрафиолетового облучения семян на состояние антиоксидантной системы, прорастающих зерен пшеницы//Известия ТСХА.-1999.-№ 4.-С.96-105..

78.Рогожин В.В., Кутузова Г.Д., Угарова Н.Н. Ы-этиламид о-сульфобензо-илуксусная кислота является медленно окисляемым субстратом пероксидазы хрена//Биоорган. химия.-2000 (в печати).

79.Рогожин В.В., Верхотуров В.В., Курилюк Т.Т. Антиоксидантная система в прорастании семян пшеницы//Известия АН. Серия биологич,- 2000 (в печати).

80.Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Влияние антиоксидантов на всхожесть семян пшеницы//С-х. биология.-2000 (в печати).

81.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Перекисное окисление липидов в семенах пшеницы, подвергнутых ультрафиолетовому облучению//Юбилейный сборник статей, посвященный 40-летию ЯНИИСХ. Новосибирск, 2000 (в печати).

82.Рогожин В.В., Сабардахова М.Е., Рогожина Т.Ю. Биоантиоксиданты в растениях Якутии//Тезисы докл. IX Международный симпозиум по кормовым растениям "Эколого-популяционный анализ кормовых растений естественной флоры, интродукция и использование".(17-20 августа 1999). Коми, Сыктывкар, 1999. С. 167-169.

83.Рогожин В.В. Перекисное окисление липидов является инициатором пусковых механизмов прорастания семян//Там же.-С. 170-171.

84.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Антиокислительная активность семян как показатель их жизнеспособности//У Между народная конференция "Регуля-торы роста и развития растений". (29 июня -1 июля МСХА). Москва, 1999. С.241-242.

85.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Проявление совместного действия экзогенных антиоксидантов на прорастание семян пшеницы//Там же.-С. 124-125.

86.Рогожин В.В., Курилюк Т.Т., Верхотуров В.В., Колесова Т.К. Роль пероксидазы и антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян//Там же.-С. 125-126.

87.Рогожин В.В. Роль пероксидазы и перекисного окисления липидов в инициировании механизмов прорастания семян//Егоровские чтения. III. Некоторые итоги биохимических и физиологических исследований в Республике Саха (Якутия). Якутск:ЯНЦ СО РАН, 2000. С. 194-200.

88.Рогожин В.В. Эффективные способы повышения продуктивности зерновых культур в условиях северного земледелия//Материалы II республ. научно-практич. конференции "Якутское село на пороге XXI века. Что делать?" (18 мая 1999). М:МСХА, 1999. С.64-69.

http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/044.pdf