CC BY
28
18. Land MH, Rouster-Stevens K, Woods CR, et al. Lactoba-
© Коллектив авторов, 2011
Е.М. Булатова1,О.К. Нетребенко2, И.С. Волкова1, Е.А. Лобанова-Дейн3
СТАНОВЛЕНИЕ И ДИНАМИКА КИШЕЧНОЙ МИКРОБИОТЫ В МЛАДЕНЧЕСТВЕ: ФАКТОРЫ ВЛИЯНИЯ И РИСКИ НАРУШЕНИЙ
!ГОУ ВПО СПбГПМА, Санкт-Петербург, 2ГБОУ ВПО РНИМУ, Москва, 3Бета Лаборатории, Вирджиния, США
Проведено изучение состава кишечной микробиоты и показателей мукозального иммунитета ротовой полости и копрофильтратов у детей второго полугодия жизни, получавших стандартную смесь (20 детей) или смесь с пробиотиками (20 детей). Клиническое наблюдение за детьми, вскармливаемыми смесью с пробиотиками, позволяет заключить, что использование продукта в питании детей с 6 месяцев оптимизирует состав микрофлоры кишечника за счет увеличения общего числа бифидобактерий, многообразия «младенческих видов» бифидобактерий и подавления активности роста некоторых видов условно-патогенной микрофлоры. В исследовании также выявлено благоприятное действие продукта на функциональные нарушения пищеварения и позитивное влияние на состояние местного иммунитета слизистых оболочек ротовой полости и кишечника. Ключевые слова: дети второго полугодия жизни, вскармливание, смесь с пробиотиками, состав кишечной микробиоты, местный иммунитет слизистых оболочек ротовой полости и кишечника.
Intestinal microbiota, parameters of oral mucosal immunity and coprofiltrates were studied in infants aged 6-12 months fed by standard milk formula (20 children) of by milk formula with probiotics (20 children). Clinical follow up of children fed by milk formula with probiotics permits to conclude that usage of this product in diet of infants at the age 6-12 months optimized spectrum of intestinal microl-ora thanks to growth of total Bifidobacteria number, increased diversity of «infantile» Bifidobacteria strains, suppressed activity of some conditional pathogenous strains of microfora. Examination also showed positive influence of studied food product upon functional disorders of digestion and upon local immunity of oral and intestinal mucosa.
Key words: infants aged 6-12 months, feeding, milk formula with probiotics, intestinal microbiota spectrum, local immunity of oral and intestinal mucosa.
Кишечная микробиота (КМ) взрослого человека выполняет целый ряд важнейших функций, которые включают защиту от патогенов, пищеварение, стимуляцию ангиогенеза и регулирование жировых депо организма [1]. Очевидно, что этот список не является полным и окончательным. Исследования животных-гнотобионтов показали определяющую
роль КМ для нормального развития желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [2, 3]. Имеются данные о связи КМ с целым рядом заболеваний детей и взрослых, включая рак желудка, аллергию, воспалительные заболевания кишечника и др. [4, 5].
Состав КМ взрослого человека многократно изучался методом культивирования, в дальней-
Контактная информация:
Нетребенко Ольга Константиновна - д.м.н., проф. каф. госпитальной педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ
Адрес: 117997 г. Москва, ул. Островитянова, 1
Тел.: (499) 725-70-00, E-mail: [email protected]
Статья поступила 10.07.11, принята к печати 23.07.11.
шем - более современными методами: методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), флюоресцентной гибридизации и др. Известно, что основные микробные популяции принадлежат к 3 большим группам - Еас1ето1йг8, ¥1тш1ки1е8, АсИпоЪа^втЬа, каждая из которых содержит большое количество видов бактерий. При этом для каждого человека характерна своя особенная мик-робиота, состав которой остается стабильным.
В отличие от взрослых КМ младенцев вариабельна по составу и может легко изменяться в течение времени. Основным источником бактерий для новорожденного ребенка является вагинальная, кишечная и кожная микрофлора матери, которые попадают в организм ребенка при прохождении родовых путей и первых контактах. В условиях современного родильного дома источником бактерий является также внутренняя среда родильного отделения, руки персонала и окружающие дети. Первыми кишечник младенца колонизируют аэробные бактерии, так как ранний постнаталь-ный период характеризуется высоким уровнем кислорода в тканях, далее с 3-го дня жизни происходит постепенная колонизация анаэробных бактерий. Нарушения процессов нормальной колонизации кишечника младенца могут быть связаны с оперативным родоразрешением, использованием антибиотиков в раннем постнатальном периоде, отсутствием грудного вскармливания [6].
Грудное вскармливание является важнейшим фактором становления нормальной здоровой КМ у детей первого года жизни. Низкое содержание белка в грудном молоке (ГМ) и высокая степень его усвоения способствуют тому, что бактерии-протеолитики в нижних отделах тонкой и верхних отделах толстой кишки не получают достаточного количества белка для своего развития и не доминируют над бифидобактериями (ББ). Относительно высокое содержание в составе белков ГМ а-лактальбумина способствует росту ББ благодаря его бифидогенному действию.
ГМ отличается от детских смесей более низким содержанием фосфора (160 мг/л в ГМ против 290-350 мг/л в смесях). Низкий уровень фосфора обеспечивает низкую буферную емкость в просвете кишечника, что способствует формированию более низких показателей рН. Создание слабокислой среды в просвете толстой кишки благоприятно для роста ББ и одновременно сдерживает рост условно-патогенной микрофлоры (УПМ). ГМ содержит высокий уровень олигосахаридов, стимулирующих рост ББ, а также живые бактерии, в частности ББ и лактобациллы (ЛБ) [7]. Все эти факторы обеспечивают оптимальный рост и поддержание необходимого количества ББ в КМ младенца. Доминирование ББ в кишечнике младенца сохраняется в первые месяцы жизни до начала введения прикорма. В дальнейшем флора младенцев становится более разнообразной, и в
большинстве случаев доминирование ББ не сохраняется. Между тем ББ выполняют ряд важных защитных функций: препятствуют росту патогенной микрофлоры, снижают выброс провоспали-тельных цитокинов, способствуют продукции секреторного иммуноглобулина А (sIgA), сохраняют целостность кишечного барьера. Снижение уровня ББ в период введения прикорма уменьшает защитные возможности кишечника, увеличивает риск развития кишечных инфекций.
Цель исследования - изучение состава КМ, а также оценка состояния местного иммунитета слизистых оболочек ротовой полости и кишечника у детей второго полугодия жизни на искусственном вскармливании смесями, обогащенными пробиотиками.
Задачи исследования:
1) оценить индивидуальную переносимость смеси «NAN Premium 2» (Nestle, Швейцария) детьми второго полугодия жизни;
2) изучить динамику нутритивного статуса, психоэмоционального и моторного развития детей на фоне вскармливания смесью «NAN Premium 2»;
3) исследовать бактериологические показатели кишечного микробиоценоза до и на фоне приема смеси «NAN Premium 2»;
4) провести сравнительную оценку показателей микробиоценоза кишечника у детей, вскармливаемых смесью «Х2», в состав которой не входят про- и пребиотики, и смесью «NAN Premium 2», обогащенной пробиотиками;
5) изучить с использованием генно-молеку-лярного метода распространенность различных видов ББ у детей, вскармливаемых смесью «NAN Premium 2» и смесью «Х2»;
6) оценить состояние местного иммунитета слизистых оболочек кишечника по уровню sIgA в копрофильтрате у детей, вскармливаемых смесью «NAN Premium 2» и смесью «Х2»;
7) оценить состояние местного иммунитета слизистых оболочек ротовой полости по уровню sIgA в слюне у детей, вскармливаемых смесью «NAN Premium 2» и смесью «Х2».
Исследование проводилось в домах ребенка № 2 и № 3 г. Санкт-Петербурга в период с августа 2009 по январь 2010 гг.
Критериями включения детей в исследование служило: отсутствие в анамнезе грубой неврологической патологии; срок гестации не менее 36 нед; оценка по шкале Апгар не менее 7 баллов; неотя-гощенный аллергоанамнез; отсутствие в течение последних 2 месяцев до включения в исследование антибактериальной терапии, пре- и пробиоти-котерапии.
На основании вышеперечисленных критериев сформированы две группы наблюдения: основная (n=20) - дети, вскармливаемые сухой последующей смесью «NAN Premium 2», обогащенной пробиотиками; контрольная группа (n=23)
- дети, вскармливаемые сухой последующей смесью «Х2», не содержащей в своем составе пре- и пробиотические компоненты.
Средний возраст детей основной группы составил 9,7±1,7 мес, контрольной группы — 7,9±2,2 мес. Длительность наблюдения составила 4 недели. Дети обеих групп получали современные, высокоадаптированные смеси, схожие по своему составу. Отличие данных продуктов заключалось в наличии или отсутствии пре- и пробиотических компонентов.
Рацион детей включал смесь, суточный объем которой рассчитывался индивидуально для каждого ребенка с учетом физиологических потребностей и составлял 400-800 мл, а также прикормы в соответствии с возрастом и индивидуальными особенностями.
В работе использовали следующие методы исследования:
1) клиническое наблюдение: a) оценка переносимости продукта (оценка аппетита, функциональных изменений со стороны ЖКТ); б) оценка физического состояния. Для оценки основных антропометрических показателей (масса тела, рост, окружность груди и головы) и оценки состояния питания использован непараметрический (центильный) метод и вневозраст-ные центильные таблицы распределения массы тела по отношению к длине тела;
2) лабораторные методы исследования: a) бактериологический - определение количественного и качественного состава КМ; б) генно-молекулярный - типи-рование ББ с помощью ПЦР. При проведении ПЦР выделение ДНК из кала осуществляли с использованием комплекта «ДНК-сорб-В-50». Реакцию амплификации проводили на аппарате фирмы PerkinElmers (США) с использованием набора для ПЦР фирмы СибЭнзим (Россия), либо BoehringerMannheim (Германия). В соответствии с сконструированными ДНК-праймерами идентифицировано 6 видов ББ (B. adolescentis, B. bifidum, B. infantis, B. longum, B. dentium, B. breve); в) иммуноферментный анализ (ИФА) - определение уровня sIgA в биологических средах (в копрофильтрате и слюне) осуществляли на планшетном спектрофотометре TECAN Sunrise (Австрия) с использованием наборов реагентов для ИФА фирмы Вектор-Бест (Россия); г) клинический анализ крови, общий анализ мочи, копрологическое исследование;
3) статистический метод осуществляли с применением ПО Excel 2007 и Statistica 8.0. Для сравнения средних показателей количественных признаков в исследуемых группах применяли методы непараметрической статистики (Манна-Уитни, Вилкоксона, Колмогорова-Смирнова, test-критерий знаков). Сравнение групп по качественному бинарному признаку проводили с использованием точного двустороннего критерия Фишера (несвязанные выборки) и критерию Мак-Немара х2 (случаи парных наблюдений; связанные выборки). Различия между группами считали достоверными при p<0,05.
У всех детей, получающих смесь «NAN Premium 2», отмечались хорошая переносимость продукта, хороший аппетит, положительный эмоциональный тонус. Дети обеих групп имели соответствующую возрасту динамику основных антропометрических показателей.
У детей обеих групп при первичном осмотре выявлены функциональные нарушения пищеварения (ФНП). Частота распространения ФНП в основной группе составила 35% (у 7 из 20 детей), в группе контроля - 30% (у 7 из 23 детей). В ходе наблюдения у детей группы контроля отсутствовала динамика со стороны ФНП. В основной группе отмечена положительная динамика в отношении ФНП в виде уменьшения частоты и интенсивности срыгиваний. Так, срыгивания при первичном обследовании регистрировались у 5 из 20 детей основной группы. В динамике исчезновение сры-гиваний зафиксировано у 3 из 5 детей, тенденция к снижению частоты и объема срыгиваний - у 2 из 5 детей.
В начале наблюдения у 2 из 20 детей основной группы отмечались запоры. Средние показатели частоты стула в основной группе составили в начале наблюдения 1,3±0,54. На фоне приема смеси, обогащенной пробиотиками, наблюдалось улучшение со стороны моторики кишечника в виде увеличения кратности дефекаций в 45% наблюдений (у 9 из 20 детей). В конце наблюдения у всех детей основной группы отмечался ежедневный стул кашицеобразной консистенции. Средняя частота дефекаций в конце наблюдениясоставила 1,62±0,53 в сутки (рис. 1).
У детей группы контроля в динамике частота стула не менялась и составляла в среднем 1,3±0,54 дефекаций в сутки (в начале наблюдения - 1,3±0,47).
Выявлены отличия в состоянии облигатной микрофлоры кишечника на искусственном вскармливании различными продуктами. В динамике в обеих группах наблюдалось умеренное снижение показателей среднего титра ББ. При этом у детей основной группы вскармливание смесью «NAN Premium 2» способствовало поддержанию более
Рис. 1. Частота стула у детей в начале и в конце исследования.
1-й столбик - исходно, 2-й столбик - в конце исследования; р<0,05 при сравнении показателя в начале и конце исследования.
«NAN Premium 2» «Х2»
высокого титра ББ (рис. 2). Так, средний титр ББ при повторном обследовании на фоне вскармливания смесью «NAN Premium 2» составил 108,6КОЕ/г, на фоне приема смеси «Х2» - 107,8 КОЕ/г (р<0,05).
Выявлено положительное влияние смеси, обогащенной пробиотиками, на состояние микробиоценоза кишечника в виде подавления роста ряда УПМ. Это проявлялось в виде достоверного подавления роста грибов рода Сandida. Так, при исходном обследовании частота выявления грибов рода Сandida составила 40% (у 8 из 20 детей), в динамике - у 10% (2 из 20 детей; р<0,041). Отмечена полная элиминация Enterobacter cloacae и тенденция к снижению выделения ряда таких УПМ, как Klebsiella- в 2,5 раза, Proteus- в 3 раза, Citrobacter - в 1,6 раза. Частота выделения УПМ в ассоциациях снизилась в 7 раз и составила 5% (до приема смеси - 35%).
Выявлен ряд отличий по частоте распространения УПМ у детей основной группы по сравнению с группой контроля в виде тенденции к более редкому выделению лактозонегативной E. coli, грибов рода Сandida, Klebsiella, а также ассоциаций УПМ. Однако у детей основной группы гемолизирующая E. coli выделялась статистически значимо чаще (у 7 из 20 детей) по сравнению с детьми контрольной группы (у одного из 18 детей; р<0,045) (рис. 3).
Видовое многообразие ББ у детей второго полугодия жизни на искусственном вскармливании смесью «NANPremium 2» и вскармливании смесью «Х2», в составе которой отсутствуют пре- и пробиотики, представлено в табл. 1.
При исходном обследовании в обеих группах преобладали «младенческие» виды ББ - B. bifidum и B. breve. Частота выделения других «младенческих» видов ББ была ниже и составляла от 5 до 41%. У детей контрольной группы по сравнению с детьми основной группы при базовом обследовании выявлена большая разнообразность «младенческих» видов ББ. Так, три и более «младенческих» вида ББ обнаружены у одного из 20 детей основной группы и у 11 из 22 детей контрольной группы (р<0,05).
В динамике в группе контроля не выявлены существенные изменения видового многообразия «младенческих» видов ББ (табл. 2 и 3). На фоне вскармливания «NAN Premium 2» выявлено обогащение видового состава ББ за счет «младенческих» видов ББ: B. bifidum и B. longum. Так, в основной группе три и более «младенческих» вида ББ обнаружены в 5% наблюдений (у одного из 20 детей) при исходном обследовании и в 45% (у 8 из 18 детей; p<0,05) - на фоне «NAN Premium 2» (табл. 2). При исходном обследовании основной группы частота выявления B. bifidum составила 60% (у 12 из 20 детей), B. longum-у 10% (у 2 из 20 детей). На фоне вскармливания «NAN Premium 2»B. bifidum
Рис. 2. Показатели среднего титра облигатной микрофлоры кишечника у детей 6-12 месяцев на искусственном вскармливании.
1 - Bifidobacterium, 2 - Lactobacillus, 3 - E. coli с нормальными свойствами; 1-й столбик - на фоне вскармливания «NAN Premium 2», 2-й столбик - на фоне вскармливания «Х2».
Рис. 3. Динамика частоты выявления УПМ на фоне вскармливания смесью «NAN Premium 2». 1 - лактозонегативные Е. coli, 2 - гемолизирующие Е. тli, 3 - St. aureus, 4 - Candida, 5 - Klebsiella, 6 - Enterobacter, 7 - Proteus, 8 - Citrobacter, 9 - ассоциации УПМ; 1-й столбик - до приема «NAN Premium 2», 2-й столбик - на фоне «NAN Premium 2».
была выделена в 100% (у 18 из 18 детей; p<0,5), B. longum — в 56% (у 10 из 18 детей, p<0,26). Частота выявления «взрослого» вида ББ (B. ado-lescentis) в обеих группах статистически значимо возросла.
Оценку состояния местного иммунитета слизистых оболочек ротовой полости и кишечника производили по уровню sIgA в биосредах (слюна, копрофильтрат) двукратно в начале и в конце наблюдения.
При базовом обследовании дети основной и контрольной групп не имели значимых отличий по содержанию sIgA в копрофильтрате и слюне. Однако, в основной группе средние значения sIgA в биосредах были ниже, чем в контрольной (рис. 4).
Так, в основной группе средний уровень sIgA в копрофильтрате составил 44,4 (15; 69) мг/л, в группе контроля - 80,6 (39; 120) мг/л. Средний уровень sIgA в слюне детей основной группы составил - 41,5 (27; 95) мкг/мл, в группе контроля -68,5 (36; 110) мкг/мл. Доля детей, имеющих соответствующие возрасту показатели sIgA в слюне, в основной группе была ниже, чем в контрольной
Таблица 1
Видовое многообразие младенческих видов ББ на фоне вскармливания смесью
«NAN Premium 2» и «Х2»
Количество выделенных младенческих штаммов «NAN Premium 2» Смесь «Х2»
первичное обследование (n=20) контрольное обследование (n=18) первичное обследование (n=22) контрольное обследование (n=18)
1 4 (20%) 4 (22%) 6 (27%) 1 (6%)
2 13 (65%) 6 (33% 6 (27%) 0
3 и более 1 (5%) 8 (45)* 11 (50%) 8 (47%)
*р<0,05 при сравнении показателей первичного и контрольного обследования.
Таблица 2
Динамика частоты выявления ББ на фоне вскармливания смесью «NAN Premium 2»
Виды выделенных ББ Первичное обследование (n=20) Контрольное обследование (n=18)
B. breve 15 (75%) 11 (61%)
B. bifidum 12 (60%) 18 (100%)*
B. dentium 12 (60%) 13 (72%)
B. infantis 5 (25%) 1 (6%)
B. longum 2 (10%) 10 (56%)**
B. adolescentis 1 (5%) 14 (78%)**
*р<0,05; **р<0,026.
Таблица 3
Динамика частоты выявления ББ на фоне вскармливания смесью «Х2»
Виды выделенных ББ Первичное обследование (n=22) Контрольное обследование (n=18)
B. breve 16 (73%) 11 (65%)
B. bifidum 20 (91%) 16 (94%)
B. dentium 12 (60%) 4 (24%)
B. infantis 9 (41%) 4 (24%)
B. longum 9 (41%) 12 (76%)
B. adolescentis 1 (5%) 10 (59%)*
*р<0,004.
группе. Так, в основной группе содержание в^А в слюне соответствовало возрастным нормативам (57-260 мкг/мл) в 35% наблюдений (у 7 из 20 детей), в контрольной группе - в 56,5% (у 13 из 23 детей).
В динамике в основной группе отмечена активация синтеза в^А, что проявлялось значимым увеличением среднего уровня в^А в копрофиль-трате и тенденцией к увеличению среднего уровня в^А в слюне. Данные изменения выявлены на фоне роста частоты выделения В. bifidum и В. \ongum. Средний уровень в^А в копрофильтра-те при повторном обследовании составил 68,4 (39; 115; р<0,004) мг/л, в слюне - 47,8 (29; 65) мкг/мл. Общее число детей, имеющих соответствующие норме показатели в^А в слюне, не изменилось. Однако у 11 из 20 детей наблюдалась тенденция к увеличению показателей в^А в слюне. У 17 из 20
А Б А Б
а б
Рис. 4. Оценка состояния местного иммунитета слизистых оболочек кишечника (а) и ротовой полости (б) у детей второго полугодия жизни на искусственном вскармливании.
А - на фоне вскармливания смесью«NAN Premium 2», Б - на фоне вскармливания смесью «Х2»; 1-й столбик - исходное обследование, 2-й столбик - контрольное обследование.
детей в динамике показатели sIgA в копрофиль-тратах возросли.
В группе контроля в динамике доля детей, имеющих нормальные показатели sIgA в слюне, сократилась в 2 раза и составила 26,3% (5 из 19 детей), в начале наблюдения - 56,5% (13 из 23 детей). Выявлена тенденция к снижению среднего уровня sIgA в копрофильтрате и в слюне (рис. 4). Так, средние показатели уровня sIgA в копро-фильтрате при исходном обследовании составили 80,6 (39; 120) мг/л, на фоне вскармливания смесью «Х2» - 68,4 (8; 123) мг/л. Средние показатели уровня sIgA в слюне составили 68,5 (36; 110) мкг/ мл и 50 (19; 198) мкг/мл соответственно (рис. 4).
В настоящее время в медицинской литературе существуют единичные исследования состава КМ у детей второго полугодия жизни в период введения прикорма. Считается, что в этот период снижается число ББ, хотя, по некоторым данным, продолжение грудного вскармливания сохраняет доминирование ББ в кишечнике младенцев и во втором полугодии жизни. Проведенное нами исследование позволяет предполагать, что при отсутствии грудного вскармливания поддержать здоровую КМ могут смеси, содержащие
пробиотики. Так, уровень ББ у детей, получавших смесь «NAN Premium 2» c пробиотиками составлял 109 КОЕ/г,что было достоверно выше по сравнению с детьми контрольной группы, и близко соответствовало таковому у детей на грудном вскармливании - 108 КОЕ/г по данным S. Amari [8]. Доминирование ББ улучшает значения показателей sIgA в копрофильтратах и слюне. Ранее в отечественных исследованиях было продемонстрировано повышение уровня sIgA у детей, получающих смеси с пробиотиками [9, 10]. Увеличение уровня sIgA на фоне получения смеси с пробиотиками в наших исследованиях подтверждает полученные ранее данные.
Таким образом, клиническое наблюдение за детьми, вскармливаемыми смесью «NAN Premium 2», позволяет заключить, что использование продукта в питании детей с 6 месяцев оптимизирует состав микрофлоры кишечника за счет увеличения общего числа ББ, многообразия«младенческих видов» ББ и подавления активности роста некоторых видов УПМ. В исследовании также выявлено благоприятное действие продукта на ФНП и позитивное влияние на состояние местного иммунитета слизистых оболочек ротовой полости и кишечника.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ismail AS, Hooper LV. Epithelial cells and their neighbors. IV. Bacterial contributions to intestinal epithelial barrier integrity. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2005; 289: G779-G784.
2. Bevinc CL. Paneth cells, defensins and IBD. Proceedings of the Second International symposium on pediatric IBD. JPGN, 2008; 46 (S1): E14-E15.
3. Cebra J. Influences of microbiota on intestinal immune system development. A.J.C.N. 1999; 69: 1046S-1051S.
4. Sudo N, Sawamura S, Tanaka K, et al. The requirement of intestinal bacterial flora for the development of an IgE production system fully susceptible to oral tolerance induction. Immunol. 1997; 159: 1739-1745.
5. Forno E, Onderdonk A, VcCracken J, et al. Diversity of the gut microbiota and eczema in early life. Clin. and Molecular Allergy. 2008; 6: 11-20.
6. Nutten S, Schumann A, Donnicola D, et al. Antibiotic administration early in life impaires specific humoral responses
to an oral antigen and increases intestinal mast cell numbers and mediators concentrations. Clin. and Vaccine Immunol. 2007; 2: 190-197.
7. Guemonde M, Laitinen K, Salminen S, et al. Breast milk: a sourse of bifidobacteria for infant gut development and maturation? Neonatology. 2007; 92: 64-66.
8. Amari S, Benatti F, Callegari ML. Changes of gut microbiota and immune markers during the complimentary feeding period in healthy breast-fed infants. Ped. Gastroent. and Nutr. 2006; 42: 488-495.
9. Щеплягина Л А, Матвиенко Н.С., Казначеева Е.Ф. и др. Опыт применения детской молочной смеси с пробиотиками у детей групп риска нарушения состава микрофлоры кишечника. Педиатрия, 2010; 4: 71-81.
10. Амирова В.Р., Нетребенко О.К., Азнабаева Л.Ф. и др. Состояние местного иммунитета у новорожденных детей, получающих различные виды вскармливания. Педиатрия. 2011; 90 (1): 84-89.
4
