CC BY
24
© Васильева I. М., Шевченко О. О., *Красносельський М. В., Жуков В. I., *Богдан Ю. А. УДК 577. 112. 825/. 826:616. 33-006. 6-037
Васильева I. М., Шевченко О. О., *Красносельський М. В., Жуков В. I., *Богдан Ю. А. СТАН ОКИСЛЮВАЛЬНО! МОДИФ^АЦЙ" БШМВ СИРОВАТКИ KPOBi У ХВОРИХ НА РАК ШЛУНКА ТА IX ПРОГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ
Харкiвський нацiональний медичний унгверситет (м. XapKiB) *«ДУ 1нститут медичноГ радюлогГГ iM. С. П. Григор'ева АкадемГГ медичних наук Укра'Гни» (м. Харкгв)
Робота виконана згiдно з планом науково-до-слiдноI роботи кафедри онкохiрургiI ХаркiвськоI ме-дично! академи пiслядипломноI освiти та прюритет-ною темою МОЗ Украши «Обгрунтування i клiнiчне значення до нозологiчних штегративних метаболiч-них механiзмiв пухлин шлунково-кишкового тракту», № державно! реeстрацiI 010411010760.
Вступ. Дослiдженнями останнiх рокiв доведена роль активаци системи вiльнорадикального окис-лення та и окремих проявiв - активацiI перекисного окислення лтщв, окислювально! модифiкацiI бiлкiв (ОМБ) - як неспецифiчного патогенетичного ланцю-га формування багатьох патолопчних станiв в орга-нiзмi [1, 6, 7]. Посилення цих процеЫв призводить до порушення рiвноваги мiж анти- та прооксидан-тами у бiк пщвищення останнiх, формування окси-дативного стресу, що супроводжуеться генералiза-цieю активних форм кисню, якi здатнi порушувати структуру та функцп клiтинних мембран, призводити до тяжких порушень клггинного метаболiзму i сутте-вих змш гомеостазу [8]. При оксидативному стрес за умов дм активних форм кисню вщбуваються змiни структури бткових молекул, а також фiзико-хiмiчних i бiологiчних !х властивостей [11]. Продукти ОМБ мо-жуть бути причиною вторинного пошкодження iнших бiомолекул [14]. Незважаючи на наявнiсть окремих робгг, що свiдчать про посилення втьнорадикальних процесiв при раку шлунка, роль ОМБ у патогенезi цього захворювання до кiнця не з'ясована. Доведено, що деструк^я бiлкiв е надмншим маркером окислювальних пошкоджень тканин, ыж перекисне окислення лiпiдiв, осктьки продукти ОМБ стабшь-нiшi, порiвняно з пероксидами лiпiдiв, якi швидко метаболiзуються пiд дiею пероксидаз i низькомоле-кулярних антиоксидантiв [11, 14]. Рак шлунка е од-ыею з актуальних проблем сучасно! онкологи. Пщвищення результативност його л^вання пов'язано з бiльш глибоким розумшням етiопатогенезу пух-линного процесу, зокрема, активност процесiв не-йрогуморально! та iмунно! регуляци, метаболiчних зсувiв, окислювального гомеостазу [9, 14].
Метою роботи було вивчення Ытенсивност окислювально! модифкацп бiлкiв у сироватцi кровi
хворих на рак шлунка з II, III i IV CTaAieio пухлинного процесу та визначення 1х прогностичного значення в мехаызмах розвитку гастроканцерогенезу.
Об'ект i методи дослгдження. Для реалiзацп поставлено! мети було сформовано три групи хворих з пщтвердженим кгмнко-шструментальними i гiстологiчними методами дiагнозом - рак шлунка та локалiзацiею злоякiсного процесу переважно в кардiальному, пiлоричному i препiлоричному вщ-дiлах. Першу групу становило 27 хворих (19 чол. i 8 жЫ.) на рак шлунка II стади, другу групу становило 34 хворих (24 чол. i 10 жЫ.) на рак шлунка III стади, третю групу становило 23 хворих (12 чол. i 11 жЫ.) з IV стадiею пухлинного процесу. Контрольну групу складали 20 практично здорових оЫб (12 чол. i 8 жiн.). Оцiнку окислювально! модифкаци бiлкiв си-роватки кровi проводили за вмiстом карбонiльних груп, накопиченням бгтирозину та флуоресценцiею залишюв триптофану. Вмiст карбонiльних груп ОМБ визначали за реак^ею з 2,4-дингтрофентгщразо-ном i утворенням похiдних 2,4-диытрофентгщра-зону, оптичну щiльнiсть яких реестрували при до-вжинi хвилi 370 нм [4]. Флуоресценцю бiтирозину у сироватц кровi вимiрювали при довжин хвилi збу-дження 325 нм i довжинi хвилi люмiнесценцi! 416 нм; флуоресценцю триптофанiлiв бiлкiв сироватки кровi вивчали вiдповiдно при 297 i 336 нм [5, 11]. Аналiз структурних змiн бiлкiв сироватки кровi проводили з використанням флуоресцентного зонду 1-антшо-8-нафталiнсульфонату (1,8-АНС) у концентрацп 8 мкм. Спектри флуоресценцп 1,8-АНС реестрували при довжинi хвилi збудження 380 нм i довжин хвилi люмiнесценцi! 490 нм [2, 3]. 1нтенсивнють флуорес-ценцi! вимiрювали на спектрофлуориметрi MPF~4A фiрми «ХгтачЬ> (Японiя) та виражали в умовних оди-ницях. Оцiнку iнтенсивностi ОМБ проводили також шляхом вимiрювання фосфоресценци сироватки кровi: на кварцовi пластини наносили 50 мкл сироватки, висушували в термостат при температурi 30о С протягом 20 хв. до появи твердо! плiвки. По™ пластини подавали у фосфороскоп, замiряли штен-сивнiсть фосфоресценцi! при юмнатнм температурi у режимi рахування кван^в фотонiв за допомогою
Таблиця
Динамка пoказникiв iнтeнсивнoстi пpoцeсiв oкислювальнoï мoдифiкацГГ бiлкiв сиpoватки KpoBi
Пoказники Група cпocтеpеження, cтадiя (M t m)
Умoвнo-здopoва (n = 20) РШ - II отад1я (n = 27) РШ - III отад1я (n = 34) РШ - IV отад1я (n = 23)
Kаpбoнiльнi гру-пи OMБ (мкмoль/ мг бiлка) 1,67 t 0,14 2,42 t 0,19* 3,96 t 0,40* 4,57 t 0,38*
Бiтиpoзин (ум. oд.) 0,83 t 0,07 1,73 t 0,10* 2,32 t 0,20* 2,74 t 0,31*
Tpиптoфанiли (ум. oд.) 11,94 t 1,12 18,34 t 1,33* 23,16 t 2,07 29,35 t 2,15*
1нтеноивнють флyopеcценцiÏ 1,8-АНС (ум. oд.) 30,1 t 2,8 22,4 t 2,0* 12,7 t 1,1* 7,4 t 0,83*
1нтеноивнють фocфopеcценцiÏ (iмп/c) ХЗ6 404 нм 508,3 t 39,4 1826,8 t 66,4 1943,6 t 58,7 2012,6 t 70,3
Пpимiтка: * piзниця вipoгiдна р < 0,05.
лiчильника СБС-2. Статиcтичний аналiз oтpиманиx pезyльтатiв бyлo пpoведенo за дoпoмoгoю ди^ер-ciйнoгo аналiзy, з вигаристанням кoефiцieнта Стью-дента, кopеляцiÏ та pегpеciÏ [10].
Peзультати дoслiджeнь та ïx oбгoвopeння. Результати дocлiдження пoказали, щo piвень кар-бoнiльниx груп OMБ cyттeвo переважав пoказники кoнтpoлю на 44,9 %; 137,1 % i 173,4 %, бiтиpoзинy - на 108,4 %; 179,5 % i 230,12 %, тpиптoфанiлiв - на 53,6 %; 93,9 % i 145,8 %, iнтенcивнocтi фocфopеc-ценцп - на 259 %; 282,3 % i 295,94 % на фoнi знижен-ня iнтенcивнocтi флyopеcценцiÏ 1,8-АНС на 25,59 %; 57,8 % i 75,42 %, вiдпoвiднo у xвopиx при II,III i IV ста-дiяx раку шлунка (табл.). Бiтиpoзин yтвopюeтьcя у xoдi oднoелектpoннoгo oкиcлення тиpoзинy, гали виникаючий дoвгoтpивалий тиpoзин-радикал при взаeмoдiÏ з таким же pадикалoм yтвopюe бiтиpoзи-нoвi зшивки.
Пiдвищення piвня бiтиpoзинy у cиpoватцi кpoвi та тканинаx вважають найбiльш надiйним маpкеpoм OMБ тoмy, щo вiн не yтилiзyeтьcя пpoтеÏназами, e xiмiчнo c^raio cпoлyкoю на вiдмiнy вiд Ыши пpo-дyктiв OMБ [12, 13]. ^м тoгo, у xвopиx пащен^в ви-явленo cтатиcтичнo дocтoвipне пщвищення вмicтy тpиптoфанiлiв, вiдпoвiднo на 5,6 %; 9,9 % i 145,8 % при II, III i IV cтадiяx xвopoби у пopiвняннi з гpyпoю кoнтpoля. Mетoд фocфopеcценцiÏ, результати якoгo дoбpе cпiввiднocятьcя з результатами елею^-ннoгo паpамагнiтнoгo pезoнанcy, дoзвoляe oцiнити oкиcлювальнy мoдифiкацiю бтюв з виcoкoю точню-тю. Так, у xвopиx виявленo cтатиcтичнo дocтoвipне зpocтання, пopiвнянo з кoнтpoлем, iнтенcивнocтi фocфopеcценцiÏ cиpoватки кpoвi на 259 %; 282, % i 295,94 % вiдпoвiднo при II, III i IV cтадiÏ пyxлиннoгo пpoцеcy. Oтpиманi данi cвiдчать, щo у xвopиx на рак шлунка в cиpoватцi кpoвi зpocтаe кiлькicть мoлекyл, якi перебувають у тpиплетнoмy збyджyючoмy cтанi.
Цi мoлекyли е дуже pеакцiйнo здатни-ми, мають бтьш тривалий чаc юнуван-ня, пюля випpoмiнювання пеpеxoдять на низький cинглетний енергетичний piвень. Результати pеecтpацiÏ штен-cивнocтi фocфopеcценцiÏ пщтверджу-ють наявнють кoнфopмацiйниx змiн бiлкoвиx мoлекyл cиpoватки кpoвi. Kpiм тoгo, зpocтання у дoвгoxвильo-вiй cпектpальнiй oблаcтi збудження кiлькocтi мoлекyл у тpиплетнoмy стан мoже cвiдчити пpo poз'eднання oкиc-нoгo фocфopилювання та тканиннoгo диxання, щo cyпpoвoджyeтьcя poзci-юванням значнoÏ кiлькocтi енеpгiÏ у ви-глядi тепла в opганiзмi xвopиx на рак шлунка, ocoбливo у випадку xвopoби з IV cтадieю пyxлиннoгo пpoцеcy. Цi данi дoзвoляють зpoбити припущення, щo в ocнoвi патогенеза рака шлунка лежать cтpyктypнo-метабoлiчнi пopyшен-ня енеpгетичнoгo oбмiнy, яю пoв'язанi з фyнкцioнyванням мiтoxoндpiальнoгo електpoннo-тpанcпopтнoгo диxальнoгo ланцюга 6í-oлoгiчнoгo oкиcлення pечoвин.
Вивчення iнтенcивнocтi флyopеcценцiÏ зoнда 1,8-АНС cтавилo за мету oтpимання iнфopмацiÏ щoдo змiн кoнфopмацiÏ бтюв, Ïx фyнкцioнальнoÏ активнocтi. Вiдoмo, iio iнтенcивнicть cвiтiння 1,8-АНС визначаeтьcя кiлькicтю та лoкалiзацieю центpiв зв'язування зoнда в бiлкoвiй мoлекyлi. У вcix xвopиx пацieнтiв cпocтеpiгалocь дocтoвipне зниження штен-cивнocтi флyopеcценцiÏ 1,8-АНС, |o такoж вказуе на наявнють кoнфopмацiйниx змiн бiлкiв cиpoватки кpoвi у xвopиx на рак шлунка. Ытен^внють флyo-pеcценцiÏ 1,8-АНС знижувала^ на 25,59 %; 57,81 % i 75,42 % вiдпoвiднo при II, III i IV cтадiяx пyxлиннoгo пpoцеcy. Зниження iнтенcивнocтi cвiтiння зoнда 1,8-АНС мoже бути oбyмoвленo як виникненням на пo-веpxнi oкиcленoгo бiлка негативнo заpяджениx кар-бoкcильниx i каpбoнiльниx груп ^ява якиx знижуе cтyпiнь зв'язування зoнда з бiлкoм), так i гаЫнням йoгo флyopеcценцiÏ пpoдyктами пеpекиcнoгo oкиc-лення лiпiдiв i бтюв [2, 3].
Bиснoвки. Таким чинoм, oтpиманi результати cвiдчать, |o poзвитoк пyxлиннoгo пpoцеcy у xвo-pиx на рак cyпpoвoджyeтьcя iнтенcифiкацieю oкиc-лювальнoÏ мoдифiкацiÏ бiлкiв cиpoватки кpoвi та Ïx кoнфopмацiйними змiнами, в на^док активацiÏ вiльнopадикальниx пpoцеciв i poзвиткy мoлекyляp-нoÏ патoлoгiÏ, яка е oдним iз ocнoвниx ланцюпв в меxанiзмаx poзвиткy рака шлунка. Дocлiджyванi пo-казники OMБ, бiтиpoзинy, тpиптoфанiлiв мoжна ви-кopиcтати як раны маркери мембpаннoÏ патoлoгiÏ в oнкoлoгiчниx xвopиx, |o тicнo пoeднанi з тяжкicтю i cтадieю poзвиткy гаcтpoканцеpoгенеза.
Пepспeктиви пoдальшиx дoслiджeнь. У пoдальшiй poбoтi ми планyeмo дocлiджен-ня cтанy нейpoендoкpиннoÏ cиcтеми у xвopиx на гаcтpoканцеpoгенез.
Лiтература
1. Бочкарева Н. В. Антиоксидантная система при предопухолевых заболеваниях и раке желудка / Н. В. Бочкарева, И. В. Кондакова, Л. A. Коломиец // Рос. онкол. журнал. - 1999. - № 1. - С. 14-17.
2. Владимиров Ю. А. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран / Ю. А. Владимиров, Г. Е. Добре-цов. - М.: Наука, 1989. - 320 с.
3. Добрецов Г. Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов / Г. Е. Добрецов. - М.: Наука, 1989. - 274 с.
4. Дубинина Е. Е. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения / Е. Е. Дубинина, С. О. Бурмистров, Д. А. Ходов [и др.] // Вопросы медицинской химии. - 1995. - Т. 41, № 1. - С. 24-26.
5. Дубинина Е. Е. Окислительная модификация белков: окисление триптофана и образование в очищенных белках с использованием системы Фентона / Е. Е. Дубинина, С. В. Гавровская, Е. В. Кузьмич // Биохимия. - 2002. - Т. 67. -С.413-421.
6. Зенков Н. К. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты / Н. К. Зенков, В. З. Ланкин, Е. Б. Меньшикова. - М.: Наука, 2001. - 343 с.
7. Пасечник И. Н. Окислительный стресс и критические состояния у хирургических больных / И. Н. Пасечник // Вестник интенсивной терапии. - 2004. - № 3. - С. 27-31.
8. Саприн А. Н. Окислительный стресс и его роль в механизмах апоптоза и развития патологических процессов / А. Н. Саприн, Е. В. Калинина // Успехи биологической химии. - 1999. - Т. 39. - С. 289-326.
9. Седов В. М. Рак желудка / В. М. Седов, А. Н. Яицкий, И. Н. Данилов. - СПб: Издательство «Человек», 2009. - 232 с.
10. Стентон Г. Медико-биологическая статистика / Г. Стентон; [пер. с англ.]. - М.: Практика, 1998. - 459 с.
11. Davies K. J. Protein damage and degradation by oxygen radicals. General aspects / K. J. Davies // J. Biol. Chem. - 1987. -Vol. 262, № 20. - P. 9895-9901.
12. Di Marco T. Current analytical methods for the detection of dityrosine, a biomarker of oxidative stress, in biological samples / T. Di Marco, C. Giulivi // Mass. Spectrom. Rev. - 2007. -Vol. 26, № 1. - P. 108-120.
13. Huggins T. G. Formation of o-tyrosine and dityrosine in proteins during radiolytic and metal-catalyzed oxidation / T. G. Hug-gins, M. C. Wells-Knecht, N. A. Detorie // J. Biol. Chem. - 1993. - Vol. 15, № 17. - P. 12341-12347.
14. Squier T. C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging / T. C. Squier // Exp. Gerontol. - 2001. - Vol. 36, № 9. - P. 1539-1550.
УДК 577. 112. 825/. 826:616. 33-006. 6-037
СТАН ОКИСЛЮВАЛЬНОГ МОДИФКАЦИ БШЮВ СИРОВАТКИ KРОВi У ХВОРИХ НА РАК ШЛУНКА ТА Г'Х ПРОГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ
Васильева i. М., Шевченко О. О., Красносельський М. В Жуков В. i., Богдан Ю. А.
Резюме. Вивчено штенсивнють окислювально! модифкаци бшюв у сироватц кровi хворих на рак шлунка з II, III i IV стадiею пухлинного процесу. Результати дослщження показали, що у хворих при II, III i IV стадiях раку шлунка суттево переважали показники по вщношенню до контролю - карбонтьних груп ОМБ, бiтиро-зин, триптофанти, штенсивнють фосфоресценци на фон зниження штенсивносп флуоресценци 1,8-АНС. Отриман результати свщчать, що розвиток пухлинного процесу у хворих на рак супроводжуеться штенси-фка^ею окислювально! модифкаци бшюв сироватки кровi та !х конформацмними змшами, в наслщок ак-тиваци втьнорадикальних процеЫв i розвитку молекулярно! патологи, яка е одним iз основних ланцюпв в мехаызмах розвитку рака шлунка.
Ключовг слова. Рак шлунка, флуорисцен^я, фосфоресцен^я, бгтирозин.
УДК 577. 112. 825/. 826:616. 33-006. 6-037
СОСТОЯНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА И ИХ ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Васильева И. М., Шевченко E. А., Красносельский Н. В., Жуков В. И., Богдан Ю. А.
Резюме. Изучили интенсивность окислительной модификации белков в сыворотке крови больных раком желудка с II, III и IV стадией опухолевого процесса. Результаты исследования показали, что у больных при II, III и IV стадиях рака желудка существенно преобладали показатели по отношению к контролю - карбонильных групп ОМБ, битирозина, триптофанила, интенсивность фосфоресценции на фоне снижения интенсивности флуоресценции 1,8-АНС. Полученные результаты свидетельствуют, что развитие опухолевого процесса у больных раком сопровождается интенсификацией окислительной модификации белков сыворотки крови и их конформационными изменениями, в результате активации свободнорадикальных процессов и развития молекулярной патологии, которая является одним из основных цепей в механизмах развития рака желудка.
Ключевые слова. Рак желудка, флуорисценция, фосфоресценция, битирозин.
UDC 577. 112. 825/. 826:616. 33-006. 6-037
STATE OF BLOOD SERUM PROTEINS OXIDATIVE MODIFICATION OF PATIENTS WITH GASTRIC CANCER AND ITS PROGNOSTIC SIGNIFICANCE
Vasylyeva I. M., Shevchenko E. A., Krasnoselskey N. V., Zhukov V. I., Bogdan Yu. A.
Abstract. In oxidative stress the action of reactive oxygen species leads to changes in protein molecule structure and also physical, chemical and biological properties.
Products of protein oxidative modification (POM) can cause secondary damage to other biomolecules. Despite the existence of some investigations that suggest the enhancement of free radical processes in gastric cancer, the role of POM in the pathogenesis of this disease is not fully understood. For realization of the chosen task three groups of patients with histologically confirmed diagnosis of stomach cancer and malignancy localized mainly in the cardiac, pyloric and prepyloric regions were formed. The 1st group consisted of 27 patients (19 males, 8 females) with II stage of tumor development; the 2nd group included 34 patients (24 males, 10 females) with III stage of pathological process; the 3rd group consisted of 23 patients (12 males, 11 females) with IV stage of gastric cancer; the 4th group included 20 patients (12 males, 8 females) with IV stage of pathological process. The control group included 20 healthy individuals (12 males, 8 females). The evaluation of blood serum POM was performed by determination of carbonyl group content, accumulation of bityrosine and fluorescence of tryptophan residues.
The content of POM carbonyl groups was determined by reaction with 2,4-dinitrophenylhydrosone and the formation of derivatives of 2,4-dinitrophenylhydrosone, which optical density was registered at a wavelength of 370 nm. Fluorescence of bityrosine in serum was measured at a wavelength of 325 nm and excitation wavelength of 416 nm luminescence; fluorescence of blood serum proteins tryptophanyls was studied, respectively, at 297 and 336 nm. The intensity of POM in the serum of patients with II, III i IV stage of gastric cancer was studied. The results showed that patients with II, III i IV cancers of the gastric cancer higher indices compared to control group-carbonyl groups of POM, bityrosine, tryptophanyls, phosphorescence intensity and decreased fluorescence of 1,8-ANS. Free radical oxidation of proteins is accompanied by the formation of various amino acid derivatives such as modified residues of tryptophan and tyrosine, the content of which can also be used to evaluate the MOB in various pathological conditions. Increased bityrosine level in serum and tissues is considered as the most reliable marker of MOB that it is not utilized by proteases and it is chemically stable compound, unlike other products of MOB. These results indicate that the development of oncologic process in patients with cancer is accompanied by intensification of oxidative modification of serum proteins and their conformational changes that result in the activation of free radical processes and development of molecular pathology, which is one of the major chains in the mechanisms of gastric cancer development.
Keywords: gastric cancer, fluorescence, phosphorescence, bityrosine.
Рецензент - проф. Непорада К. С.
Стаття надшшла 2. 12. 2014 р.
