СТАДИЯ ФЕРМЕНТАЦИИ В БИОТЕХНОЛОГИИ Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Щ SCIENCE TIME Щ

(jj II < 5л ' 1-1Ф -1 щг 1 - 4_W JT |Г1 1 r^g) СТАДИЯ ФЕРМЕНТАЦИИ В БИОТЕХНОЛОГИИ Максутова Вилена Олеговна, Башкирский государственный университет, г. Уфа E-mail-.vilenka312@yandex.ru

Аннотация. В данной статье рассмотрен процесс ферментации, применяемый в биотехнологическом производстве. Описаны методы поверхностного и глубинного культивирования микроорганизмов.

Ключевые слова: ферментация, микроорганизмы, культуральная жидкость.

Стадия ферментации - одна из основных стадий в биотехнологическом процессе, при этом происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образование целевых продуктов: биомасса, экзометаболиты, эндометаболиты. Эта стадия осуществляется в ферментере (биореакторе) [4]. Для расчета параметров ферментационного оборудования необходимо знать ряд показателей, таких как растворимость и степень восстановления субстрата, теплопродукцию при его окислении, потребность культуры в кислороде и многое другое [8].

При выборе биореактора следует учитывать особенности ферментации:

а) чувствительность биологических агентов к физико-механическим воздействиям, которые возникают при осуществлении процессов аэрации и перемешивания культуральной жидкости;

б) необходимость одновременной реализации процессов массо - передачи в двух- (жидкость-клетки популяции), трех- (газ-жидкость-клетки) и четырехфазных (газ-жидкость-клетки-нерастворимый или слаборастворимый субстрат) системах;

в) скорость роста культур, потому что удвоения концентрации биомасс составляет от десяти минут до нескольких суток;

г) необходимость обеспечения стерильности проведения всех технологических операций;

д) использование воздуха в качестве источника кислорода;

е) образование пены и связанная с этим негомогенность содержимого биореактора;

ж) многокомпонентность питательных сред;

з) сложность биохимических механизмов регуляции роста и биосинтеза, большое количество одновременно протекающих биохимических реакций превращения субстратов (сырья) в продукт;

и) нестабильность целевых продуктов (термолабильность);

к) интенсификация биосинтеза мало (в 2-3 раза) зависит от условий, обеспечиваемых аппаратурой, так как процесс в основном обусловлен свойствами биологического агента (культуры).

Перечисленные особенности приводят к целому ряду ограничений по интенсификации процессов, протекающих в биореакторах. Основные из них -проблемы межфазного переноса веществ [3].

Особенности биообъектов обусловливают следующие принципы технического оснащения биопроизводств:

а) конструкционное совершенство и относительная универсальность биореакторов;

б) инертность, или коррозионная стойкость материалов биореакторов и другого технологического оборудования, вмещающих биообъект или контактирующих с ним или продуктами его метаболизма;

в) эксплуатационная надежность технологического оборудования;

г) доступность, эстетичность и легкость обслуживания, замены, смазки, чистки, обработки антисептиками или дезинфектантами узлов и соответствующих частей оборудования [5].

Культивирование (ферментация) представляет собой совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную питательную среду посевного материала до завершения процессов роста и биосинтеза вследствие исчерпания питательных веществ в среде. Существует два основных типа ферментаций: получение биомассы микроорганизмов и получение метаболитов [6].

Для выращивания любой культуры необходимы:

а) жизнеспособный посевной материал;

б) источники энергии и углерода;

в) питательные вещества для синтеза биомассы;

г) отсутствие ингибиторов роста;

д) соответствующие физико-химические условия [1].

Независимо от типа биореактора процесс ферментации строго контролируют по:

- концентрации растворенного кислорода;

| SCIENCE TIME |

- рН;

- температуре;

- интенсивности перемешивания биомассы.

Существенные изменения любого из этих параметров резко снижают скорость роста клеток и стабильность целевых продуктов. В случае аэробного процесса, кислород подаётся в среду непрерывно. В процессе ферментации специальный датчик контролирует содержание растворенного кислорода в среде, равномерность его распределения по всему объему, тщательность перемешивания культуры, что обеспечивает эффективность диспергирования пузырьков.

Пространство, где взаимодействуют микроорганизмы и питательная среда, называют микросредой. Если микросреда данной культуры одинакова в каждой точке, то такую культуру считают гомогенной. Гомогенность достигается эффективным перемешиванием всех компонентов среды и микроорганизмов по всему рабочему объему. Гомогенность невозможна без аэрации, которая осуществляется барботерами различных конструкций, например, в виде кольцевого желоба с отверстиями, перфорированной трубы или форсунки.

Оптимальный рост большинства микроорганизмов идет при рН от 5,5 до 8,5. Однако клеточные метаболиты, которые выделяются в культуральную среду, могут изменять рН. Изменение рН среды заметно сказывается на активности ферментов микроорганизмов, состоянии промежуточных продуктов, их диссоциации, растворимости и т.д., что значительно влияет на выход конечного продукта. Для того чтобы проконтролировать рН, в ферментер при необходимости добавляют кислоту или основание, тщательно перемешивая питательную среду, чтобы равномерно распределить по всему объему.

Успех ферментации зависит от температуры. Если она ниже оптимальной (37°С), то рост микроорганизмов замедляется и интенсивность их метаболизма снижается. При повышении температуры до 38°С, возможна преждевременная индукция синтеза белка или индукция белков теплового шока, что активирует клеточные протеиназы и снижает выход белкового продукта. Для отвода тепла используют охлаждающую рубашку.

Тщательное перемешивание культуральной среды необходимо для:

- равномерной доставки питательных веществ к клеткам;

- предотвращения накопления токсических побочных продуктов метаболизма в каком-нибудь небольшом участке биореактора.

Механическое перемешивание и аэрация снабжают растущую культуру кислородом, азотом, отводят продукты газообмена и физиологическое тепло, выделяемое микроорганизмами в процессе биосинтеза, способствует гомогенизации суспензии, увеличивают скорость процессов массаобмена и теплообмена.

| SCIENCE TIME |

Конструкция мешалки играет важную роль в работе биореактора. Перемешивание культуральной среды влияет на следующие параметры:

а) скорость переноса кислорода из пузырьков газа в жидкую среду, из среды в клетки;

б) эффективность теплопередачи;

в) точность измерения концентрации метаболитов культуральной жидкости;

г) эффективность диспергирования добавляемых реагентов: кислот, оснований, питательных сред и т.д.

Следует соблюдать баланс между необходимостью тщательного перемешивания среды и целостностью клеток, так как при чрезмерном перемешивании в среде могут возникнуть гидромеханические эффекты, которые губительны для бактериальных клеток.

Непрерывный мониторинг всех параметров, дает возможность изменять условия в ходе ферментации. Как правило, оптимальные условия изменяются при каждом десятикратном увеличении объема биореактора [7].

В биотехнологии используют методы поверхностного и глубинного культивирования микроорганизмов.

Поверхностное культивирование биообъектов в жидкой питательной среде вблизи раздела фаз газ - жидкость - распространенный метод, хотя и уступающий по эффективности синтеза целевого продукта глубинному методу культивирования. Однако метод остается в ходу применительно к процессам, сопровождающимся накоплением внеклеточных продуктов в культуральной среде или зависящих от контакта между организмом и воздушной средой. Такой контакт требуется для мицелиальных грибов при переходе к определенным стадиям развития. Экономический выигрыш связан с относительной простотой изготовления и эксплуатации биореакторов [2].

При поверхностном культивировании клетки в суспензии оседают на плотной поверхности сосуда с культуральной средой, становятся плоскими и делятся, образуя монослой на поверхности сосуда. Обычно при этом используют цилиндрические бутыли, которые медленно вращаются вдоль своей длинной оси. Рост клеток и выход биомассы можно увеличить, добавив в суспензию носитель - микроскопические гранулы из инертного синтетического полимера, на которых клетки закрепляются и пролиферируют. Суспензионные культуры можно получать в сосудах объемом до 1000 л при перемешивании.

Преобладающим является глубинный метод культивирования, предполагающий возможность использования всего объема питательной среды, а кислород поступает к клеткам в результате интенсивной операции перемешивания [7].

Глубинный метод позволяет получить большое количество бактериальной

I

SCIENCE TIME

I

массы за короткое время. К тому же процесс легко управляем. При глубинном выращивании имеются существенные различия в степени потребления углеродных и азотистых веществ. Они интенсивно потребляются при аэрации культуральной жидкости, поэтому, чтобы процесс роста и размножения не прекращался быстро, нужно в процессе культивирования дополнительно вводить углеродные и азотистые соединения, а при необходимости и другие стимуляторы роста микроорганизмов. Добавление питательных веществ, особенно углеводных (глюкоза) и биологических стимуляторов усиливает интенсивность размножения, что и приводит к увеличению концентрации микроорганизмов в момент съема их биомассы. Данный способ также позволяет легко корректировать рН среды в процессе культивирования, что очень важно для достижения максимальной интенсивности размножения [9].

Литература:

1. Биотехнология: принципы и применение: учебное пособие / Г. Бич, Д. Бест, К. Брайерли [и др.]; Под ред. И. Хиггинса и др.; Перевод с англ. А.С. Антонова. Под ред. А.А. Баева. - М.: Мир, 1988. - 479 с.

2. Биотехнология: учебное пособие для вузов / А.В. Олескин, В.Д. Самуилов; под ред. Н.С. Егорова. - 8-е изд.. - М.: Высшая школа, 1987. - 159 с.

3. Виестур УЭ. Биотехнология: биологические агенты, технология, аппаратура / УЭ. Виестур, И.А. Шмите, А.В. Жилевич. - Рига: Зинатие, 1987. - 263 с.

4. Волова Т.Г. Биотехнология / Т.Г. Волова. - Новосибирск: Издательство СО РАН, 1999. - 252 с.

5. Елинов Н.П. Основы биотехнологии / Н.В. Елинов. - СПб.: Наука, 1995. - 601 с.

6. Новиков Д.А. Выделение и очистка продуктов биотехнологии / Д.А. Новиков. - Минск: БГУ, 2014. - 234 с.

7. Основы фармацевтической биотехнологии: учебное пособие / Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков [и др.]. - Ростов н/Д.: Феникс; Томск: НТЛ, 2006. -256 с.

8. Современные проблемы и методы биотехнологии: учебное пособие / Н.А. Войнов, Т.Г. Волова, Н.В. Зобова [и др.]. - Красноярск: ИПК СФУ, 2009. - 418 с.

9. Учебно-методические материалы по подготовке к лабораторным и семинарским занятиям по курсу биотехнологии: учебное пособие / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.И. Молофеева [и др.]. - Ульяновск, 2006. - 85 с.