CC BY
82
УДК. 573.6.086.83
СТАБИЛЬНОСТЬ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ В УСЛОВИЯХ, МОДЕЛИРУЮЩИХ РАСПЫЛИТЕЛЬНУЮ СУШКУ
© А.С. Селиванов
Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, ул. Коммунистическая, 28,
Сыктывкар, Республика Коми, 167982 (Россия) e-mail: [email protected]
Исследовано влияние солей Li2SO4, (NH4)2SO4 и NaCl, целлюлозы и ее производных на стабильность ферментных препаратов целлюлаз при тепловом обезвоживании. С использованием предложенной методики имитации процесса теплового обезвоживания подобраны эффективные стабилизаторы, предохраняющие целлюлазные ферменты от инактивации в процессе теплового обезвоживания. Данная методика позволяет работать с небольшими количествами термолабильных веществ (25,0-50,0 мл раствора) для получения оптимальных параметров процесса теплового обезвоживания растворов ферментных препаратов, выбора способа обезвоживания и стабилизаторов, способствующих уменьшению потерь ферментативной активности при тепловом обезвоживании с применением различных температур процесса, времени процесса и различными соотношениями объема раствора к площади поверхности испарения, для процесса сушки распылением.
Введение
Биоконверсия возобновляемого растительного сырья в топливо, кормовые и пищевые продукты, полупродукты для химической и микробиологической промышленности рассматривается в настоящее время как одна из ключевых отраслей биотехнологии. Одно из направлений этой отрасли предусматривает способы превращения непищевого сырья, представляющего собой в основном отходы целлюлознобумажной промышленности и сельского хозяйства, с помощью ферментов и микроорганизмов для получения углеводов и биологически активных веществ.
Ферментативное превращение целлюлозы перспективно не только с точки зрения создания самостоятельных малоотходных технологий, но и с позиции снижения экологической опасности различных производств целлюлозно-бумажной промышленности и других производств, перерабатывающих растительное сырье и образующих большое количество отходов. Ежегодное производство древесины для изготовления бумаги достигает 150 млн т и постоянно возрастает [1], создавая тем самым мощное давление на окружающую природную среду. Таким образом, невостребованные сырьевые ресурсы для ферментативного получения углеводов из целлюлозы огромны и постоянно возобновляются.
Однако в практике широко распространена, особенно в отечественной, технология химической конверсии целлолигнина, преследующая такие же цели как технология биоконверсии - превращение целлюлозы в сахаристые вещества. Одной из основных причин того, что процесс ферментативного гидролиза целлюлозы пока не удается перевести на промышленный уровень, является отсутствие высокопроизводительных и экономически эффективных технологий для ферментативного гидролиза, сопоставимых с уровнем аппаратов традиционной химической технологии.
Можно выделить три основные причины того, что процесс ферментативного гидролиза целлюлозы пока не удается перевести на промышленный уровень:
- высокая стоимость ферментных препаратов целлюлаз;
- отсутствие дешевого и эффективного крупномасштабного способа предобработки
целлюлозосодержащих материалов, в первую очередь древесины;
- отсутствие технологий биоконверсии целлюлозы в асептических условиях, позволяющих
получать высокую производительность, сопоставимую с уровнем традиционной химической
технологии.
Цель настоящей работы заключалась в снижении стоимости ферментных препаратов целлюлаз за счет снижения потерь от инактивации ферментного препарата при сушке.
Масштабирование процессов получения ферментных препаратов предусматривает широкое использование различных вариантов сушки. Одним из широко используемых вариантов обезвоживания является распылительная сушка, рассматриваемая во всех промышленных производствах [2, 3] как эффективный способ получения технических ферментных препаратов. Однако отработка оптимальных режимов, приводящих к минимальным потерям активности фермента в ходе сушки, обычно требует значительных затрат ферментного раствора. В данной работе предложен метод определения стабильности препарата в ходе сушки, для которого достаточно 25,0-50,0 мл культуральной жидкости. Данный метод продемонстрирован на примере изучения влияния различных стабилизаторов при сушке целлюлазного ферментного препарата, получаемого из культуральной жидкости гриба продуцента целлюлаз Тпскоёвгша утёв.
Методика эксперимента
Для определения целлюлолитической активности использовали калориметрический метод [4] основанный на определении восстанавливающих сахаров, образующихся при действии ферментов целлюлолитического комплекса на субстрат - хроматографическую бумагу. За единицу активности целлюлазы принята способность фермента образовывать 1,0 мг восстанавливающих сахаров в пересчете на глюкозу при действии фермента на 50 мг хроматографической бумаги при температуре 1=50°С, рН=4,7, в течение 1,0 ч.
В качестве источника целлюлолитических ферментов использовали как раствор, полученный разбавлением очищенного концентрата целлюлаз, так и фильтрат культуральной жидкости продуцента ферментов целлюлаз Тпскоёвгша угггёв. В качестве стабилизаторов при сушке использовали соли Ы2804, (КН4)2804 и №С1 (марок х.ч., осч.), для которых ранее был установлен эффект стабилизации целлюлаз в растворе [5], а также различные целлюлозосодержащие материалы (порошковая целлюлоза, отходы целлюлозно-бумажной промышленности и т.д.) и производные целлюлозы (микрокристаллическая целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза), глюкоза.
Для имитации процесса распыления ферментный раствор наносили на проволочные сетки из нержавеющей стали и латуни с ячейками 1,0 и 0,315 мм соответственно. Размер ячеек сетки моделировал различный размер капель при распылении. Сетки размером 15,0x80,0 мм были впаяны в рамку из нержавеющей проволоки диаметром d = 1,0 мм и снабжены ручкой для удобства в пользовании. Для моделирования условий сушки использовали муфельную печь МП-РУМ, снабженную автоматическим регулятором температуры и контрольным ртутным термометром. Для растворения ферментного препарата, остающегося на сетке, использовали прямоугольные ячейки размером 100,0x25,0x10,0 мм.
После погружения сеток в фильтрат культуральной жидкости определенное количество его удерживалось на сетке за счет поверхностного натяжения. Затем с сетки в горизонтальном положении снимали избыток жидкости фильтровальной бумагой. Проволочные сетки с нанесенным раствором фермента помещали в муфельную печь при температуре 1=150°С и высушивали в течение 3 мин. Высушенный на сетке препарат растворяли в прямоугольной ячейке в дистиллированной воде определенного объема, а затем определяли целлюлолитическую активность по методике [4]. Одновременно с опытным определением проводили контрольное определение активности на этой же сетке, исключая процесс сушки в муфельной печи.
Для сеток с различными ячейками определили точность набора объема раствора при одинаковых условиях методом количественного анализа. При этом использовали методику определения содержания растворимого в воде карбоната щелочного металла №2С03, основанного на титровании раствора соды
стандартным раствором хлористоводородной кислоты [6]. Сетки погружали в раствор №2СО3 с титром, определенным титрованием стандартным раствором хлористоводородной кислотой и переносили объем раствора, удерживаемый сеткой, в колбу и растворяли в 25 мл дистиллированной воды. Определяли количество №2СО3, перенесенного сеткой, титрованием стандартным раствором хлористоводородной кислоты, а по титру исходного раствора №2СО3 - объем раствора, удерживаемый сеткой. Для сеток с размером ячеек 1,0 мм из нержавеющей стали для данного раствора и титра 0,1637 №2СО3, объем, удерживаемый сеткой за счет поверхностного натяжения, после проведения статистической обработки результатов 10 опытов составил 0,2878±0,005 мл, или 0,2878±1,8%. Аналогично для сетки с размером ячеек
0,315 мм из латуни объем, удерживаемый сеткой, составил 0,2228±0,006 мл, или 0,2228±2,7%. Причем тем же методом объемного титрования установили, что результаты, полученные при проведении сушки в муфельной печи, попадают в доверительный интервал, определенный выше, и соответственно количество вещества, переносимого сетками, не меняется.
Обсуждение результатов
При исследовании стабильности ферментного препарата с помощью предлагаемого метода с использованием солей П28О4, (КН4)28О4 и №С1, для которых ранее был установлен эффект стабилизации в растворе [5, 7], получены данные (табл. 1).
Как видно из полученных результатов (графы 5 и 8 табл. 1), размер капель при сушке существенно влияет на степень сохранения активности ферментного препарата при сушке. С уменьшением размера капель при сушке увеличивается инактивация ферментного препарата. Очевидно, существует зависимость размера капель при сушке распылением от степени лабильности фермента при воздействии высоких температур и времени воздействия. Следовательно, определение размеров капель при распылении для растворов фермента позволит значительно сохранить активности ферментных препаратов при сушке распылением.
При варьировании концентрации солей в диапазоне от 0 до 300,0 мг/мл наибольший стабилизирующий эффект наблюдается при двух оптимальных концентрациях солей. Для (КН4)28О4 этот эффект наблюдается при концентрациях 1,0 и 200,0 мг/мл; для Ы28О4 - 0,1 и 100,0 мг/мл; для №С1 - 10,0 и 250,0 мг/мл как при сушке на сетке размером ячеек 1,0 мм (рис. 1), так и на сетке размером ячеек 0,315 мм (рис. 2). Однако в случае использования №С1 в концентрации 250,0 мг/мл стабилизирующий эффект наблюдается лишь относительно по сравнению с другими концентрациями соли, но не с раствором фермента в отсутствие солей (строка 1 табл. 1).
Log C (десятичный логарифм концентрации стабилизатора в ферментном растворе, мкг/мл)
-*-с использованием в качестве стабилизатора (NH4)2SO4 с использованием в качестве стабилизатора Li2SO4 с использованием в качестве стабилизатора NaCl
Рис. 1. Влияние концентрации солей на выход по ферментативной активности целлюлаз из Тпсквёегша утёе при сушке на сетке с ячейкой 1 мм
Log C (десятичный логарифм концентрации стабилизатора в ферментном растворе, мкг/мл)
-•—с использованием в качестве стабилизатора (NH4)2SC>4 с использованием в качестве стабилизатора Li2SO4 -*-с использованием в качестве стабилизатора NaCl
Рис. 2. Влияние концентрации солей на выход по ферментативной активности целлюлаз из ТпсИвёегша утёе при сушке на сетке с ячейкой 0,315 мм
Таблица 1. Влияние различных стабилизаторов на целлюлолитическую активность ферментативного
комплекса целлюлаз культуральной жидкости Trichoderma viride при сушке
№ Стабилизатор Концентрация стабилизатора в ферментном растворе, мг/мл Для сетки с ячейкой 1,0 мм Для сетки с ячейкой 0,315 мм
Средняя активность при 3-х повторностях на сетке без сушки, ед/мл Средняя активность при 3-х повторностях на сетке с сушкой, ед/мл Выход ферментного препарата по активности, % Средняя активность при 3-х повторностях на сетке без сушки, ед/мл Средняя активность при 3-х повторностях на сетке с сушкой, ед/мл Выход ферментного препарата по активности, %
1 Культураль- ная - 12,3 5,7 46,3 10,5 1,8 17,9
жидкость
2 Очищенный - 9,4 1,4 14,9 10,5 1,6 15,2
ферментный
раствор
3 (NH4)2SO4 0,1 11,4 6,7 58,8 12,4 3,5 28,2
4 1,0 10,7 7,4 69,2 11,1 3,6 32,4
5 10,0 9,1 5,3 58,2 11,2 2,2 19,6
6 50,0 9,6 2,8 29,2 12,5 1,8 14,4
7 100,0 5,7 1,9 33,3 12,4 2,2 17,7
8 200,0 8,9 4,2 47,2 10,1 2,7 26,7
9 300,0 7,0 1,6 22,9 7,8 1,8 23,1
10 Li2SC4 0,1 9,9 7,5 75,8 12,3 6,1 49,6
11 1,0 9,8 6,1 62,2 11,1 4,7 42,3
12 10,0 9,9 5,0 50,5 10,8 3,9 36,1
13 50,0 8,9 5,1 57,3 11,4 3,6 31,6
14 100,0 10,6 6,8 64,2 11,1 4,1 36,9
15 200,0 10,2 5,4 52,9 11,9 3,8 31,9
16 300,0 9,9 2,6 26,3 8,3 1,1 13,3
17 NaCl 10,0 12,8 2,2 17,2 11,2 1,3 11,6
18 25,0 9,8 1,2 12,2 10,1 0,6 5,9
19 50,0 9,3 0,7 7,5 10,9 0,7 6,4
20 100,0 8,4 0,4 4,8 8,3 - -
21 200,0 9,3 0,8 8,6 8,6 0,6 6,9
22 300,0 7,9 0,7 8,9 6,9 - -
Следует отметить, что изменение контрольных значений активностей раствора фермента (графы 4,7, табл. 1) при использовании одного и того же раствора фермента может быть вызвано или изменением объема раствора фермента, удерживаемого сеткой вследствие изменения вязкости, или воздействием солей определенных концентраций на скорость ферментативного гидролиза хроматографической бумаги в процессе определения активности фермента. Наиболее вероятно второе предположение, так как, во-первых, отклонение в изменении активностей составляет в максимуме до 50% в некоторых случаях (строка 3,7, графа 4, табл. 1), а в основном 20-35%, в несколько раз превышает допустимые погрешности при проведении опыта; во-вторых, при равномерном изменении концентрации солей в растворе фермента (графа 3, табл. 1), вопреки ожиданиям равномерного изменения активности раствора фермента (графа 4,7, табл. 1), не наблюдается соответствия с увеличением вязкости раствора. Для исследования возможного влияния солей различных концентраций на активность раствора фермента провели ряд измерений активности с внесением солей определенных концентраций в раствор фермента непосредственно перед определением активности ферментного раствора. Полученные результаты, представленные в таблице 2, показывают, что концентрация солей в растворе фермента существенно влияет на скорость ферментативного гидролиза хроматографической бумаги при определении активностей целлюлаз. Соли в зависимости от их концентрации в реакционной среде при гидролизе целлюлозы целлюлолитическими ферментами являются смешанного типа активаторами или ингибиторами [8], поэтому при ингибировании наблюдается уменьшение активности фермента (строка 1,2,6,11, табл. 2) и увеличение активности фермента при активации солями других концентраций, представленных в таблице, по отношению к контрольному измерению без внесения каких-либо добавок в раствор фермента (строка 16, табл. 2). Причем изменение активности составляет в максимуме до 55%, а в основном - 20-35% (графа 6, табл. 2), что соответствует изменениям контрольных значений активностей (графа 4, 7, табл. 1).
Таким образом, на основе изложенных и полученных ранее результатов, и данных литературы [5, 7] стабилизирующее действие солей на активность целлюлолитических ферментов необходимо рассматривать не как частное воздействие солей на ферменты в растворе, а как комплексное воздействие всей системы целлюлоза-вода-фермент с учетом процесса ферментативного разрушения целлюлозного комплекса, так как все методики определения целлюлолитической активности включают этот процесс [8].
Таблица 2. Влияние различных концентраций солей, вводимых в раствор фермента на определение
целлюлолитической активности целлюлаз из Тпскоёггша утёг
№ Наименование вещества Концентрация вводимого вещества вместе с ферментным раствором, 10—4 М Активность по образованию восстанавливающих сахаров, ед/мл pH вводимого раствора Изменение активности от концентрации вещества, % Изменение активности от концентрации вещества по контрольному значению (строка 16), %
1 Н2Б04 2 5,59 2,8 100 82
2 1,5 5,86 2,95 105 86
3 1,0 7,64 3,12 137 112
4 0,5 7,90 3,5 141 116
5 0,1 7,83 5,15 140 115
6 Ьі2Б04 2 6,36 6,08 100 93
7 1,5 8,36 6,3 131 123
8 1,0 9,34 6,2 147 137
9 0,5 9,87 6,03 155 145
10 0,1 8,66 5,97 136 127
11 (ЫН4)2В04 2 6,19 6,16 100 91
12 1,5 8,14 6,3 132 119
13 1 9,05 6,20 146 133
14 0,5 8,75 6,16 141 128
15 0,1 7,23 6,13 117 106
16 Контрольное значение, без внесения солей 6,82 6,0 — —
Как видно из полученных результатов, стабилизирующий эффект при сушке с применением известных ранее стабилизаторов Ы2804, (КИ4)2804 и №С1 имеет место при известных концентрациях, но недостатками данной стабилизации являются относительно высокие потери ферментативной активности, достигающие 30-45%. Из литературы известно, что некоторые растворимые, а также нерастворимые субстраты в ряде случаев увеличивают термостабильность целлюлаз в растворах [9,10], но исследований по стабилизации их при тепловом обезвоживании не проводилось. Исходя из этих положений о стабилизации фермента субстратом по предлагаемой методике провели ряд определений по поиску эффективного стабилизатора ферментов-целлюлаз из Тпсквёегша утёе при сушке, используя в качестве стабилизаторов ряд целлюлозосодержащих материалов, целлюлозы и производных целлюлозы. Полученные данные представлены в таблице 3, здесь же приведены результаты максимальной стабилизации раствора ферментов при тепловом обезвоживании.
Для этого раствор ферментного препарата или фильтрат культуральной жидкости перед тепловым обезвоживанием приводили в контакт с целлюлозосодержащим материалом (порошковой целлюлозой, волокнистой целлюлозой, отходами целлюлозно-бумажной промышленности и т.п.) путем добавления непосредственно в фильтрат культуральной жидкости, либо путем пропускания через целлюлозосодержащий материал. При использовании растворимых производных целлюлозы (глюкоза, целлобиоза, КМ-целлюлоза) они добавлялись непосредственно в фильтрат культуральной жидкости.
Полученные результаты (табл. 3) при тепловом обезвоживании показывают, что с применением в качестве стабилизатора целлюлозосодержащих материалов, а также производных целлюлозы можно снизить потери ферментативной активности препарата целлюлаз при воздействии высоких температур, без использования известных солей-стабилизаторов. Из данных таблицы видно, что потери ферментативной активности при тепловом обезвоживании раствора ферментов на сетке, с использованием в качестве стабилизаторов целлюлозосодержащих материалов и производных целлюлозы, составляют 18-40%. Тогда как при использовании в качестве стабилизаторов известных ранее солей Ы2804, (ЫИ4)2804 и №С1 или без использования стабилизаторов в аналогичных условиях потери ферментативной активности составляют от 54 до 85%. Глюкоза не вызывает снижения потерь ферментативной активности в процессе сушки и тем отличается от растворимых производных целлюлозы (целлобиозы, КМ-целлюлозы).
Промышленные испытания способа стабилизации препарата целлюлаз показали, что данный способ позволяет практически без дополнительных затрат повысить выход целлюлаз по ферментативной активности на стадии сушки до 95%, а также удельные активности получаемого препарата в зависимости от качества фильтрата культуральной жидкости до 1500-2000 ед/г, определенных по методике [4].
Таблица 3. Влияние целлюлозосодержащих материалов и производных целлюлозы на выход по ферментативной активности целлюлаз продуцента Тпсквёегша утёе при обезвоживании раствора ферментов
№ Наименование вносимого в раствор фермента материала Концентрация вносимого матери- Активность раствора Тепловое обезвоживание раствора фермента
ала в раствор фермента, мг/мл фермента, ед/мл выход препарата по активности, % потери активности, %
1 Культуральная жидкость — 12,3 46,0 54,0
2 Очищенный ферментный раствор — 9,4 15,0 85,0
3 Глюкоза 1,0 11,0 47,0 53,0
4 Целлобиоза 0,5 11,0 68,0 32,0
5 Микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ), порошковая 1,0 11,0 69,0 31,0
6 Карбоксиметилцеллюлоза (КМ- 1,0 11,0 66,0 34,0
7 целлюлоза) 10,0 20,0 82,0 18,0
8 Целлюлозосодержащий отход, 1,0 11,0 62,0 38,0
9 производства ацетатной 10,0 11,0 75,0 20,0
10 целлюлозы (волокнистая 10,0 20,0 60,0 40,0
11 целлюлоза) 20,0 20,0 80,0 20,0
Выводы
Таким образом, с использованием предлагаемой методики, для ферментов целлюлаз подобраны эффективные стабилизаторы, предохраняющие ферменты от инактивации в процессе обезвоживания при действии высоких температур и предложен способ получения препаратов целлюлаз со стабилизацией целлюлозосодержащим субстратом в процессе сушки. Данный способ дает возможность уменьшения потерь ферментативной активности на одной из основных стадий процесса получения препарата целлюлаз и соответственно удешевления получаемого продукта за счет получения дополнительного продукта, уменьшения объема и исключения из процесса некоторых материалов.
Данная методика позволяет работать с небольшими количествами термолабильных ферментных препаратов и биологически активных веществ для получения оптимальных параметров процесса теплового обезвоживания растворов ферментных препаратов, выбора способа обезвоживания и стабилизаторов, способствующих уменьшению потерь ферментативной активности при тепловом обезвоживании с применением различных температур, времени процесса и различными соотношениями массы раствора к площади поверхности испарения, для процесса сушки распылением.
Список литературы
1. Sudguist Jorma The role of biotechnology in the wood-processing industry of the future // Kemia-Kemi. 1987. V. 14. №100. P. 984.
2. Лыков М.В., Леончик Б.И. Распылительные сушилки. М., 1966.
3. Гильденблат И.А., Борисов Г.С., Григорьев В.В., Мягков Л.В., Рябов А.В. Основные процессы и аппараты
химической технологии М., 1976.
4. Somogyi M.G. Notes on sugar determination // J. Biol. Chem. 1952. №1. Р. 19-23.
5. Гернет М. В. Культивирование продуцентов целлюлаз. II. Стабилизация ферментов в растворах // Биотехнология. 1985. №3. С. 36-42.
6. Крешков А.П. Основы аналитической химии. М., 1976. Т. 2. С. 164-180.
7. Кузнецова Е.К., Гернет М.В., Замотайлова Л.П. Исследование стабилизации ферментного комплекса в процессе
концентрирования целлюлаз // Биотехнология. 1986. №6. С. 80-82.
8. Каткевич Ю.Ю., Балоде Б.К. О влиянии некоторых ионов металлов на ферментативный гидролиз целлюлозы // Превращение древесины при энзиматическом и микробиологическом воздействиях. Рига, 1988. С. 74-84.
9. Синицын А.П., Клесов А.А., Рабинович М.Л., Гусаков А.В., Морозов А.М. Биотехнология ферментативного
превращения целлюлозы // Итоги науки и техники. Биотехнология. 1988. Т. 12. С. 55-57.
10. Гусаков А.В., Синицын А.П., Клесов А.А. Ферментативный гидролиз целлюлозы. Инактивация и стабилизация ферментов целлюлазного комплекса // Биохимия. 1982. Т. 47. №8. С. 1322-1331.
Поступило в редакцию 7 мая 2002 г.
