CC BY
146
М. Е. Зиновьева, В. С. Гамаюрова, М. А. Бурмасова
ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПРОЦЕССА ГИДРОЛИЗА ЦЕЛЛЮЛОЗЫ ФЕРМЕНТНЫМ ПРЕПАРАТОМ DENYCEL 100 CG ПРИ ДОБАВЛЕНИИ НЕКОТОРЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
Ключевые слова: целлюлаза, гидролиз целлюлозы, интенсификация гидролиза целлюлозы. cellulose, hydrolysis of cellulose, intensification of process of hydrolysis of cellulose.
Изучено влияние некоторых органических соединений на эффективность процесса гидролиза целлюлозы ферментным препаратом DENYCEL 100 CG. Установлено, что наиболее эффективным является добавление к ферментному препарату DENYCEL 100 CG таких органических соединений как
1,4-бутиленгликоль, диэтиленгликоль, глицерин, твин-20 в концентрации 0,1 %. Показано, что положительное воздействие 1,4-бутиленгликоля и глицерина сохраняется при повышении температуры процесса.
Influence of some organic compounds is studied on efficiency of process of hydrolysis of cellulose by enzymes preparation of DENYCEL 100 CG. The best results were received at use the organic activators the 1,4-buthyleneglycol', diethylene glycol, glycerin, tween-20 in a concentration 0,1 %. It was demonstrated that positive influence of 1,4-buthyleneglycol' and glycerin is remain at the increase of temperature of process.
В настоящее время на российском и мировом рынках предлагается большой ассортимент целлюлолитических препаратов, однако в связи с растущими потребностями в ферментных препаратах предусматривается и повышение качества ферментных препаратов, т.е. повышение активности и стабильности к воздействию различных химических и физических факторов.
Целлюлолитические ферментные препараты микробиологического происхождения, расщепляющие 1,4-в-гликозидную связь между остатками D-глюкозы в молекулах целлюлозы, ее растворимых полимерных производных или олигосахаридах нашли широкое применение в различных областях промышленности [1]. Глюкоза, полученная при ферментативном гидролизе целлюлозы городских отходов, отходов деревообрабатывающей промышленности и сельского хозяйства, может быть добавлена к корму животных, превращена во фруктозу, использована как источник углерода в микробиологической промышленности, сброжена до этанола. Препараты целлюлаз можно добавить в корм животных для повышения его усвояемости и использовать для облагораживания и силосования грубых кормов. Ферментные препараты, расщепляющие растительные клеточные стенки, могут быть использованы для увеличения выхода белков, жиров, углеводов, соков, экстрактивных веществ кофе и чая, лекарственных веществ, а также для получения изолированных протопластов для экспериментов по генной инженерии и соматической гибридизации растений. Целлюлазы нашли широкое применение в медицине для создания таблеток, облегчающих пищеварение, а также продуктов детского и диетического питания [2-6 ].
Одним из путей повышения активности ферментов является их активация различными физико-химическими методами. В литературе описаны способы активации различ-
ных ферментов нагреванием, тепловой обработкой в присутствии солей металлов, добавкой некоторых химических соединений, лазерным излучением, воздействием СВЧ-полей и т.д. [7 -11].
В данной работе было проведено исследование влияния некоторых органических соединений на эффективность процесса гидролиза целлюлозы ферментным препаратом DENYCEL 100 CG .
Экспериментальная часть
Характеристика ферментного препарата: DENYCEL 100 CG - ферментный препарат, содержащий Р-1-4-эндоглюканазу, выделенную из непатогенных грибов. Ферментный препарат имеет вид гранул серо-белого цвета, растворимых в воде. Оптимальная величина pH б,3 - б,8, ферментативная активность препарата составляет (по QСТ07) 1341 - 1400 ед.
Для определения активности ферментного препарата DENYCEL 100 CG в качестве субстрата использовалась измельченная фильтровальная бумага (размеры бумажных пластинок составляли 2х 2 мм). Процесс гидролиза проводили в следующих условиях: температура 40°С, рН= б,8, время б0 минут, согласно стандартному методу, описанному в литературе [11]. В полученных гидролизатах определяли общее содержание сахаров и содержание глюкозы.
Общее содержание сахаров определяли фенол-сернокислотным методом [11], а содержание глюкозы - глюкозооксидазным [12].
Органические соединения добавлялись к раствору ферментного препарата в концентрациях от 0,001 до 1%.
Все эксперименты проводили не менее чем в 5 повторностях. Результаты обрабатывались по Стьюденту (уровень значимости 0,95).
Результаты и их обсуждение
В ходе работы было изучено влияние на активность ферментного препарата DENYCEL 100 CG следующих органических добавок: 1,4-бутиленгликоль, диэтиленгли-коль, твин-20, глицерин, сорбит, янтарная кислота и лимонная кислота. Было установлено, что добавление лимонной кислоты не приводило к повышению активности ферментного препарата. Внесение в раствор фермента янтарной кислоты или сорбита повышает активность используемого ферментного препарата на 10-17 %.
Проведенные исследования показали, что добавление остальных органических соединений в раствор ферментного препарата DENYCEL 100 CG приводит к значительному увеличению скорости гидролиза целлюлозы. Результаты исследования приведены в таблице 1.
Как видно из таблицы 1, добавление изученных соединений в концентрации 0,1-
0,01 % приводит к значительному повышению выхода сахаров и глюкозы по сравнению с контролем. Наиболее высокие результаты получены при использовании таких добавок как глицерин и твин-20. Но если общее содержание сахаров при высокой концентрации добавок (1 %) в среде также несколько повышается, то содержание глюкозы резко падает. По-видимому, исследуемые добавки оказывают активирующее воздействие на эндо-1,4-в-глюканазу, являющуюся основным действующим началом данного ферментного препарата. Целлюлазные ферментные препараты обычно содержат целлюлазный комплекс, включающий в себя также экзо-1,4-в-глюканазу, которая катализирует гидролитическое отщепление остатков глюкозы.
Добавление больших концентраций исследуемых органических соединений, вероятно, оказывает ингибирующее воздействие на экзо-1,4-в-глюканазу, чем объясняется снижение выхода глюкозы. Также весьма интересны результаты, полученные при исполь-
зовании 1,4 -бутиленгликоля. При внесении 1,4- бутиленгликоля наблюдается увеличение преимущественно выхода сахаров при незначительном увеличении выхода глюкозы, что свидетельствует о преимущественном влиянии этого соединения на эндо-1,4-в-глюканазу.
Положительное действие ПАВ на гидролиз целлюлозы также связано с повышением биодоступности субстрата для действия ферментов.
Таблица 1 - Влияние органических соединений на ферментативный гидролиз целлюлозы препаратом DENYCEL 100 СО
Органи- ческое соедине- ние Концентрация органического соединения в растворе ферментного препарата, % Общее содержание сахаров в гидролизатах С, мкг/мл Общее содержание сахаров в гидролизатах, % Содержание глюкозы в гидролизатах Сі, ммоль/л Содержание глюкозы в гидролизатах, %
1,4- 0 15 100 ± 2 0,21 100 ± 1
бути- 1 17,5 116 ± 5 0,11 53 ± 5
ленгли- 0,1 35,1 233 ± 2 0,25 119 ± 5
коль 0,01 17 113 ± 2 0,22 105 ± 6
Диэти- 0 15 100 ± 2 0,21 100 ± 1
ленгли- 1 18,5 123 ± 2 0,16 76 ± 6
коль 0,1 31,2 206 ± 5 0,37 176 ± 2
0,01 19,9 133 ± 3 0,35 166 ± 3
0,001 15 100 ± 6 0,21 100 ± 2
Глицерин 0 15 100 ± 2 0,21 100 ± 1
1 16,3 107 ± 3 0,16 76 ± 2
0,1 33 220 ± 2 0,42 200 ± 2
0,01 25,5 170 ± 2 0,37 176 ± 5
0,001 19,6 130 ± 3 0,21 100 ± 6
Твин-20 0 15 100 ± 2 0,21 100 ± 1
1 15,5 103 ± 2 0,17 81 ± 1
0,1 30,5 203 ± 5 0,43 205 ± 2
0,01 19,5 130 ± 6 0,39 186 ± 1
0,001 15,1 100 ± 5 0,22 105 ± 2
Таким образом, исследования показали, что добавление к ферментному препарату БЕКУСЕЬ 100 СО таких органических соединений как 1,4-бутиленгликоль, диэтиленгли-коль, глицерин, твин-20 в концентрации 0,1% значительно увеличивает активность целлю-лазных ферментов. Содержание сахаров в гидролизатах увеличивается на 70-133%, а содержание глюкозы на 19 - 105%.
Как известно из литературных данных [8,13], многие целлюлолитические ферменты имеют температурных оптимум 50 - 65°С.
Поэтому изучение совместного влияния температуры и некоторых органических соединений (глицерина и 1,4-бутиленгликоля) на процесс гидролиза целлюлозы ферментным препаратом БЕКУСЕЬ 100 СО представляется интересным. Данные соединения были выбраны из-за их невысокой стоимости. Процесс гидролиза целлюлозы проводили в течение одного часа при температурах 40, 50, 60, 70°С. В гидролизатах определяли общее содержание сахаров фенол-сернокислотным методом. Данные представлены на рисунке 1.
Температура, °С
Рис. 1 - Совместное влияние температуры и добавок на гидролиз целлюлозы ферментным препаратом DENYCEL 1°° СО: 1 - содержание сахаров в гидролизате при использовании исходного ферментного препарата; 2 - содержание сахаров в гидролизате при использовании ферментного препарата с добавлением глицерина (°,1%); 3 -содержание сахаров в гидролизате при использовании ферментного препарата с добавлением 1,4-бутиленгликоля (°,1%)
Результаты исследований показывают, что повышение температуры приводит к возрастанию скорости гидролиза целлюлозы. Дальнейшее увеличение температуры приводит к снижению активности ферментного препарата.
Введение активирующих добавок в среду реакции мало меняет характер температурной зависимости.
Максимальная активность ферментного препарата БЕКУСЕЬ 100 СО наблюдается при 60°С. Содержание сахаров в присутствии 1,4-бутиленгликоля увеличивается при оптимальной температуре в 1,9 раз, а в присутствии глицерина в 1,3 раза по сравнению с исходной активностью, т.е. активностью определенной по стандартной методике без добавок.
Таким образом, проведенные исследования показали, что внесение таких органических соединений как 1,4-бутиленгликоль, твин-20, диэтиленгликоль и глицерин оказывают положительное влияние на гидролиз несколько измененной целлюлозы (фильтровальной бумаги) ферментным препаратом БЕКУСЕЬ 100 СО . Положительное воздействие на ак-
тивность ферментного препарата DENYCEL 100 CG 1,4-бутиленгликоля и глицерина сохраняется при повышении температуры процесса.
Литература
1. Агабекян, Э.Л. Целлюлазы микроорганизмов / Э.Л. Агабекян, Н.Б. Горкина, Б.А. Фихте // Прикладная биохимия и микробиология.- 1981. - Т. 17. - № 6. - С. 859-863.
2. Фениксова, Р.В. Ферментативное расщепление целлюлозы / Р.В. Фениксова. - М.: Наука, 1967. -65 с.
3. Фениксова, Р.В. Гидролитические ферменты микроорганизмов и их применение в народном хозяйстве / Р.В. Фениксова. - М.: Наука, 1972. - 136 с.
4. Тиунова, Н.А. Фундаментальные исследования древесины в области ее комплексного использования: Докл. 2-го Междунар. симпоз. Братислава / Н.А. Тиунова, В.Г. Рыжакова, В.А. Асланова, Р.В. Фениксова. - Братислава: Хим. Ин-т. Словацкой академии наук, 1978. - 23 с.
5. Прикладная биохимия и микробиология. - М.: Наука, 2006. - Т. 42. - № 1.
6. Marques, S Conversion of recycled paper slidge to ethanol by SHF and SSF using Pichia stipitis / S.
Marques, L. Alves, J.C. Roseiro, F.M. Girio// Biomass and Bioenergy. - May 2008. - Vol. 32. -Issue 5. - P. 400-406.
7. Попадич, И.А. Исследование некоторых физико-химических воздействий для активации ферментных систем микроорганизмов / И. А. Попадич // Юбилейный сб. науч. трудов / - М.: МТИПП, 1980. - С. 101-106.
8. 8. Попадич, И.А. Изменение активности ферментов при тепловой обработке //Ферментная промышленность. - 1984. - № 8. - С.84-88.
9. Klyosov, Anatole. A. The activation of cellulases from different sourses by actin / Anatole A. Klyosov
[et al.] // FEBS Letters. - Volume 187. - Issue 1. - 22 July 1985. - Pages 101-104.
10. Чурилова, И.В. Методы активации целлюлаз / И.В. Чурилова, В.И. Максимов, А.А. Клесов // Биохимия. - 1990. - Т. 44. - № 11. - С.2100-2102.
11. 11. Стойкова, Д. Степень солюбилизации нерастворимого целлюлозного субстрата / Д. Стой-кова, О.П. Белецкая, И.Е. Кукаев // Прикладная биохимия и микробиология. - 1996. - Т. 22. - № 6. - С.766-771.
12. 12. Рухлядева, А.П. Методы определения активности гидролитических ферментов / А.П. Рух-лядева, Г.В. Полыгалина. - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981. - 288 с.
13. 13. Кастельянос, С.П. Активность целлюлолитических ферментов: Автореф. дисс. канд. хим. наук / Кастельянос С.П. - Пущино, 1996. - 24 с.
© М. Е. Зиновьева - канд. техн. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КГТУ, zino-mari@yandex.ru; В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф., зав. каф. пищевой биотехнологии КГТУ, gamaur@kstu.ru; М. А. Бурмасова - асп. той же кафедры
