CC BY
60
Снижению частоты нестабильных аберраций активно пролиферирующих клеток костного мозга позволяет предположить, что введение мелатонина способствует либо сохранению большего количества функционирующих клеток в ряду поколений в момент неблагоприятного воздействия, либо активизации механизмов, восстанавливающих повреждение клеточной ДНК.
В целом полученные в работе данные свидетельствуют о перспективности использования синтетического аналога эпифизарного гормона мелатонина для профилактики развития неблагоприятных цитогенетических последствий воздействия на организм факторов радиационной и химической природы.
Н. С. Пильщикова, Б. Н. Кудрявцев
Сравнительный анализ содержания белка в гепатоцитах различной плоидности
Явление полиплоидии состоит в кратном гаплоидному увеличении числа хромосом в соматической клетке. При этом степень плоидности клеток может увеличиваться во много раз (до 16, 32 и выше).
Полиплоидия широко распространена в природе: она обнаружена у всех изученных организмов: от растений и насекомых, до млекопитающих. В том числе полиплоидия нормальна и для тканей человека, например, для мегакариоцитов костного мозга или кардиомиоцитов.
Тем не менее, несмотря на уже немалую историю изучения соматической полиплоидии, сведения о ней весьма скудны и противоречивы. Главным образом, споры вызывает вопрос о биологической роли этого явления.
Первоначально считалось, что полиплоидизация вызывает некоторое уникальное изменение функциональной активности клеток, придаёт им новые свойства, невозможные для диплоидных аналогов. Это было опровергнуто ещё в 60-80-х гг. прошлого века: на основании полученных в то время данных было показано, что полиплоидная клетка при небольших степенях полиплоидизации, свойственных тканям млекопитающих, является функциональным аналогом соответствующего числа диплоидных клеток. Эксперименты показали, что сухой вес, содержание общего белка, площадь ядрышек, синтез большинства тканеспецифических продуктов, активность ферментов, скорость синтеза РНК и другие основные показатели функциональной активности изменяются пропорционально числу геномов, содержащихся в клетке. На основании этих данных был сделан вывод о том, что полиплоидия, не изменяя активности
232
одного генома, даёт клеткам другие преимущества, такие как большая генетическая устойчивость в случае мутагенных воздействий или возможность сокращения митотического цикла для клеток, пролиферация которых происходит наравне с активными тканеспецифическими синтезами.
Однако в недавно выполненных работах были получены результаты, в корне меняющие взгляд на биологическую роль соматической полиплоидии. В данных работах было показано, что содержание общего белка в клетках сердца и печени в расчёте на один геном падает с ростом плоидности клеток. На основе этого был сделан вывод о снижении синтетической активности клеток с ростом их плоидности, авторы пришли к выводу о том, что полиплоидия является вынужденным состоянием и, хотя она увеличивает выживаемость клеток в стрессовых ситуациях (кислородное голодание, энергетический дефицит, окислительный стресс), приводит, тем не менее, к снижению функционального потенциала тканей. Сведения, полученные этими авторами, вынуждают считать роль полиплоидии скорее отрицательной.
Из приведённых выше сведений следует цель данной работы -сравнение содержания белка в гепатоцитах различной плоидности. Именно в этом вопросе, главным образом, расходятся старые и новые данные, и ответ на него позволит сделать вывод о функциональной полноценности полиплоидных клеток.
В данной работе содержание белка и ДНК в клетках измеряли классическими цитофотометрическими методами аналогично тому, как это делалось ранее. При этом мы постарались учесть как можно больше факторов, вызывающих погрешности в измерениях, являющиеся причиной возможного искажения результатов.
Помимо стандартных приёмов, используемых при любом цитофотометрическом измерении (выбор клеток целых, лежащих отдельно и на чистых участках препарата), мы постарались минимизировать неспецифические потери света в клетках. Как известно из литературы, основная причина наблюдаемых неспецифических потерь - рассеяние света в клетках, причиной которого являются скачки показателей преломления в препарате. Подгонку показателей преломления среды и объекта проводили путём измерения оптических плотностей препарата неокрашенных кардиомиоцитов человека (методом абсорбционной цитофотометрии в видимом свете, используя микроскоп Axioskop (Carl Zeiss) (объектив 20*0,50) с камерой Leica DFC 360 FX; полученные изображения клеток обрабатывали в программе Video Test 5.0) в разных средах, выбирая среду, показывающую минимальную плотность. Наилучший результат из всех рассмотренных сред мы получили для иммерсионного масла (показатель преломления 1,518).
233
Основную часть исследования мы проводили на гепатоцитах крысы. Выбор данного объекта обусловлен тем, что именно на его примере было показано падение среднего содержания общего белка в расчёте на геном с ростом плоидности клеток печени.
Также стоит упомянуть о методике измерения. Измерить содержание белка в клетках известной степени плоидности можно несколькими способами. Исторически первоначально цитофотометрически измеряли только содержание белка, а плоид-ность клеток определяли визуально по размеру самих клеток или их ядер. Этот метод заведомо является недостаточно точным, потому что размер клеток может существенно варьировать в пределах одного класса плоидности, как и содержание в них белка. Ещё один способ - окрашивать клетки одновременно и на белок, и на ДНК красителями с полосами поглощения в разных областях спектра. При этом считается, что области поглощения красителей практически не перекрываются, и погрешности от этого минимальны, если брать за фон для измерения белка - окружающее клетку пространство, а для измерения ДНК - цитоплазму клетки. Но существует и более точный (но и более трудоёмкий) метод, основанный на последовательном измерении содержания белка и ДНК в одних и тех же клетках.
В данном случае мы препарат первоначально картировали, затем измеряли оптическую плотность неокрашенных клеток (для дополнительного учёта неспецифических потерь света), затем окрашивали препарат на белок нафтоловым жёлтым S и измеряли оптическую плотность тех же клеток, смывали краситель в этиловом спирте, окрашивали клетки аурамином^02 на ДНК и измеряли интегральную яркость ядер. В данном случае погрешность, связанная с перекрытием полос поглощения красителей, полностью исключается.
Интегральную оптическую плотность определяли методом абсорбционной цитофотометрии в проходящем свете, Л = 450 нм. Для этого использовали микроскоп Axioskop (Carl Zeiss) (объектив 40*0,75) с камерой Leica DFC 360 FX. Длину волны проходящего света выделяли, используя комбинацию интерференционного светофильтра (Лтах = 450 нм) и фильтра СЗС-20. Полученные изображения клеток обрабатывали в программе Video Test 5.0.
Содержание ДНК измеряли методом цитофлуориметрии при помощи микроскопа Axioskop (Carl Zeiss) (объектив 40*0,75), оборудованного камерой Leica DFC 360 FX и при использовании блока фильтров № 10 (Carl Zeiss). Содержание ДНК (в усл. ед.) определяли в программе WCIF ImageJ, измеряя интегральную яркость ядер клеток. В результате все клетки выборки (всего 510) были разделены на классы плоидности; для исключения попадания клеток в со-
234
седние классы плоидности мы выбросили из выборки все клетки, содержание ДНК в которых отличалось от среднего для данного класса более чем на среднее квадратичное отклонение. После этого в выборке осталось 310 клеток, и уже для них, отдельно для каждого класса плоидности, было вычислено среднее содержание белка с учетом рассеяния света на неокрашенных клетках.
В результате проведённой работы мы обнаружили, что с увеличением количества копий хромосом в клетках растёт и содержание белка в них, и при этом содержание белка увеличивается строго пропорционально увеличению содержания генетического материала. Кроме того, статистические расчёты показали, что для двуядерных и одноядерных клеток одной степени плоидности содержание белка одинаково в пределах погрешности.
Соответственно, не подтверждаются последние данные об уменьшении содержания белка в клетках в расчёте на геном с ростом их плоидности. Можно считать необоснованным и вывод о функциональной неполноценности полиплоидных клеток. Но в то же время мы ничего не можем сказать о содержании отдельных белков в клетках. Вполне возможно, что увеличиваются только средние показатели, но при этом сложным образом изменяется состав белков клетки.
Таким образом, подводя итог всему сказанному, можно сформулировать следующие выводы: содержание общего белка в клетках увеличивается пропорционально степени их плоидности; при расчете на один геном содержание белка в клетках различной пло-идности постоянно; при равной плоидности гепатоцитов, независимо от числа в них ядер, содержание белка в клетках одинаково. То есть функциональные потенции диплоидных и полиплоидных гепа-тоцитов изменяются пропорционально дозе генов.
Тем не менее мы не имеем права распространить полученные на примере гепатоцитов крысы данные на другие организмы, поэтому работа над этой проблемой продолжается. На данный момент проводятся аналогичные измерения для гепатоцитов мыши, кролика, свиньи домашней, собаки домашней и человека.
А. С. Хитрик, А. А. Сазанов
Системы лабораторной диагностики хеликобактериоза - на пути к созданию комплексных молекулярно-генетических тестов
Helicobacter pylori (HP) - спиралевидная грамотрицательная бактерия, которая инфицирует различные области желудка и двенадцатиперстной кишки. Многие случаи язв желудка и двенадцатиперстной кишки, гастритов, дуоденитов и, возможно, некоторые
235
