CC BY
104
УДК 576.08:611.36:613.25-616-092.29
ХАРАКТЕРИСТИКА ПЛОИДНОСТИ ГЕПАТОЦИТОВ КРЫС В УСЛОВИЯХ ВЫСОКОЖИРОВОГО РАЦИОНА
Наталия Владимировна БИВАЛЬКЕВИЧ, Юлия Константиновна КАРАМАН, Татьяна Александровна ГВОЗДЕНКО
Владивостокский филиал ФГБУ «ДНЦ ФПД» СО РАМН - «НИИ МКВЛ» 690105, Владивосток, ул. Русская, 73-г
Исследована плоидность гепатоцитов крыс в условиях высокожирового рациона. Показано, что клеточные механизмы регенерации по пути полиплоидизации гепатоцитов осуществляются при высокой степени повреждения органа (стеатогепатит), в то время как при стеатозе и отсутствии деструктивно-некротической трансформации ткани изменений в уровне плоидности клеток печени не выявлялось.
Ключевые слова: печень, высокожировой рацион, полиплоидия.
Фактор питания является ведущим в формировании оптимального алиментарного статуса и здоровья населения. В последнее десятилетие рацион питания жителей развитых стран характеризуется избыточным потреблением жиров животного происхождения (более 30 % от общей калорийности). Установлено, что высокожировой рацион вызывает стойкие нарушения обмена веществ, сопровождающиеся длительно текущими хроническими заболеваниями сердечно-сосудистой, гепатобилиарной и других систем [1].
Высокожировая нагрузка определяется как одна из главных этиопатогенетических причин развития дисметаболических нарушений в печени [2]. Формирующиеся при этом структурно-функциональные нарушения становятся независимыми патогенетическими звеньями в общей цепочке механизмов формирования заболеваний гепатобилиарной системы. Структурные нарушения ткани печени стимулируют механизмы, способствующие поддержанию ее функциональной активности [3, 4].
Одним из таких биологических механизмов сохранения структурной целостности и функциональной активности печени является клеточная регенерация [5]. Как известно, физиологическая регенерация происходит за счет деления гепато-цитов. Массовая потеря гепатоцитов вследствие некроза и апоптоза активизирует процессы, запускающие вхождение «покоящихся» гепа-
тоцитов в клеточный цикл деления для восстановления первоначальной клеточной массы и поддержания клеточного гомеостаза органа [6, 7]. В печени всегда имеется резерв гепатоцитов с полиплоидными ядрами, готовых к митозу в любой момент. Увеличение уровня плоидности гепатоцитов является одной из основных компенсаторно-приспособительных реакций печени, обеспечивающих сохранение функции органа [8].
До настоящего времени регенерационные механизмы печени в условиях высокожировой нагрузки изучены недостаточно, остаются неизвестными и способы регенерации печени в зависимости от степени ее функциональных нарушений и глубины структурных повреждений. В связи с этим целью работы явилось изучение характера плоидности гепатоцитов крыс и установление клеточных механизмов регенерации печени в условиях высокожирового рациона.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследования выполнены на половозрелых крысах-самцах линии Вистар (п = 40, масса 173 ± 5,6 г). Животных содержали на высокожировой диете, состоящей из 19 % топленого говяжьего сала и 2 % холестерина от общей массы рациона. Анализ ткани печени проводили через 30, 90 и 180 суток. Выделено 4 группы животных по 10 особей в каждой: контрольная группа - крысы, находившиеся на стандартном
Бивалькевич Н.В. - младший научный сотрудник лаборатории биомедицинских исследований, e-mail: [email protected]
Караман Ю.К. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории биомедицинских исследований, e-mail: [email protected]
Гвозденко Т.А. - д.м.н., директор, e-mail: [email protected]
рационе вивария; опытные группы - животные, содержавшиеся на экспериментальном рационе (30 суток - опытная группа 1; 90 суток - опытная группа 2; 180 суток - опытная группа 3).
Экспериментальные работы были проведены в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609 ЕЕС, эвтаназию животных осуществляли путем декапитации под эфирным наркозом. Для проведения гистологического исследования небольшие фрагменты центральной части правой доли печени фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина, приготовленного на 0,07М фосфатном буфере (рН 6,98). Обезвоживание тканей проводили в этиловом спирте возрастающей концентрации, после чего их заливали в парапласт. Далее готовились срезы ткани печени толщиной 7 мкм. Для гистологических исследований срезы окрашивали гематоксилин-эозином по Романовскому и пикрофуксином по Ван-Гизону на выявление коллагеновых волокон. Морфометрические измерения гепатоцитов проводили с помощью программы «ВидеоТесТ-Морфология 5.2.» («ВидеоТесТ», Санкт-Петербург). Площадь гепа-тоцитов и их ядер изучали по тетраплоидным клеткам. Измерения проводили в выборке из 100 клеток различных зон каждого препарата. Для плоидометрических исследований готовили препараты-мазки, окрашенные по Фельгену. Оценку плоидности гепатоцитов проводили методом компьютерной плоидометрии. Измеряли интегральную оптическую плотность (Du) окрашенных ядер гепатоцитов, представленную суммой плотностей всех точек ядра, отражавших содержание в них Фельген-ДНК. Для получения значений «тканевого стандарта плоид-ности» измеряли среднюю интегральную оптическую плотность малых лимфоцитов в мазках
и принимали ее соответствующей диплоидному набору хромосом. Рассчитывали распределение ядер по классам плоидности по формуле: (среднее значение Du гепатоцитов / среднее значение Du малых лимфоцитов) х 2 [9].
Статистическую обработку результатов исследования проводили, вычисляя среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего арифметического значения (т), и представляли в виде М ± т. Статистическую значимость различий средних величин вычисляли по ¿-критерию Стъюдента после проверки нормальности распределения изучаемых параметров.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
«Плоидометрический профиль» ядер гепато-цитов крыс контрольной группы был представлен тремя уровнями плоидности: диплоидные гепатоциты (2с), на долю которых приходилось 28,1 % клеток от общего числа гепатоцитов, тетраплоидные (4с) - 66,3 % и октаплоидные клетки (8с) - 5,6 % (рис. 1). Число двуядерных клеток печени составляло 24,7 % от общего числа гепатоцитов.
Результаты гистологического исследования ткани печени крыс, получавших высокожировую нагрузку в течение 30 суток, выявили значительные изменения по сравнению с гистомор-фологией печени контрольных крыс (рис. 2, а). У крыс опытной группы 1 наблюдалось нарушение балочной структуры печеночных долек, гепатоциты в паренхиме располагались беспорядочно. Гипертрофированные клетки печени (размеры увеличивались в 1,7 раза (р < 0,001) по сравнению с размерами гепатоцитов крыс контрольной группы, см. таблицу), наполненные мелкокапельными и крупнокапельными жировыми включениями, плотно прилегали
Контрольная группа
30 сут
90 сут
180 сут
Рис. 1. Плоидность ядер гепатоцитов печени крыс в условиях высокожирового рациона
Рис. 2. Морфологические изменения печени крыс при высокожировой нагрузке. а — сужение просветов синусоид-ных капилляров за счет гипертрофии гепатоцитов в печени крыс опытной группы 1, окраска гематоксилином и эозином, увел. 150; б — участок гистологического среза с некротическими изменениями печени крыс опытной группы 2, окраска гематоксилином и эозином, увел. 150; в — крупнокапельный стеатоз печени крыс опытной группы 2, окраска гематоксилином и эозином, увел. 150; г — портальный фиброз печени с разрастанием соединительнотканных структур вокруг печеночной триады у крыс опытной группы 3, окраска по Ван-Гизону, увел. 150
друг к другу, что приводило к сужению просветов синусоидных капилляров. Площадь ядер гепатоцитов по сравнению с контролем уменьшилась на 15 % (р < 0,001), индекс ядерно-ци-топлазматического соотношения (Я/Ц) - в два раза (см. таблицу). Ядра имели гиперхромный хроматин с плохо отличимыми ядрышками. Количество двуядерных гепатоцитов также незначительно увеличивалось и составляло в среднем 25,2 % от общего числа клеток.
Плоидометрическая характеристика гепато-цитов печени крыс опытной группы 1 существенно не изменялась. Отмечалась тенденция к увеличению класса тетраплоидных ядер (69 % от общего числа исследуемых ядер). Исходя из полученных данных, можно предположить наличие стимулированной пролиферативной ак-
тивности гепатоцитов в условиях краткосрочной высокожировой нагрузки. Однако эти изменения не носят ярко выраженного характера.
Влияние высокожировой нагрузки на крыс в течение 90 суток способствовало переходу стадии стеатоза печени в стеатогепатит, что подтверждалось обнаруженными фокальными участками некроза с лимфомакрофагальными элементами (см. рис. 2, б). В препортальной и центральной зонах долек синусоидные капилляры были расширены, лимфатические сосуды имели достаточно крупные размеры, центральные вены чаще встречались полнокровные и более крупных размеров, чем у животных контрольной группы. Жировая дистрофия гепатоци-тов сохранялась и имела вид мелкокапельной и крупнокапельной вакуолизации, заполняющей
Примечание. Статистическая значимость отличия от величины соответствующего показателя в контрольной группе: * - р < 0,01; ** - р < 0,001.
Таблица
Морфометрические показатели гепатоцитов крыс в условиях высокожирового рациона, М ± т
Показатель Контрольная группа, п = 10 Сроки воздействия высокожировой нагрузкой
30 суток (опытная 1), п = 10 90 суток (опытная 2), п = 10 180 суток (опытная 3), п = 10
Площадь гепатоцита, мкм2 248,5 ± 4,4 431,6 ± 29,5** 420,9 ± 11,6** 498,5 ± 22,7**
Площадь ядра гепатоцита, мкм2 47,6 ± 0,7 40,5 ± 1,3** 43,6 ± 1,0* 41,1 ± 1,1**
Площадь цитоплазмы гепатоцита, мкм2 200,8 ± 6,4 391,0 ± 19,5** 377,2 ± 15,6* 457,4 ± 12,5**
Я/Ц 0,23 ± 0,01 0,103 ± 0,008** 0,115 ± 0,001** 0,089 ± 0,002**
всю цитоплазму клетки и смещающей ядро к периферии (см. рис. 2, в). Кариоплазма была плотная с 1-2 ядрышками. Размеры гепатоцитов увеличились на 22,5 % (р < 0,001) относительно величин показателей контрольной группы, но не отличались от размеров гепатоцитов крыс опытной группы 1 (см. таблицу). Площадь ядер гепатоцитов крыс опытной группы 2 имела тенденцию к увеличению по сравнению с опытной группой 1, но не достигала значений контрольной группы.
Плоидометрический анализ ткани печени крыс опытной группы 2 выявил снижение числа диплоидных гепатоцитов в 2,7 раза, увеличение уровня тетраплоидных и октаплоидных ядер на 13 и 52 % соответственно по сравнению с контрольной группой. Выявлялся класс гепатоцитов 16с-плоидности, число которых составило 2 % от общего числа исследуемых клеток. Количество двуядерных гепатоцитов снизилось до 21 %.
Повышение полиплоидизации ядерного аппарата гепатоцитов свидетельствует о включении новых регенерационных механизмов репарации органа за счет увеличения синтеза генетического материала [2]. Повышение уровня плоидности клеток при заболеваниях печени, в частности при циррозе, отмечается как у грызунов, так и у человека [2, 7, 10-12]. Значительное увеличение очагов некроза в печени стимулирует регенерационные процессы посредством повышения количества полиплоидных гепато-цитов, что необходимо для сохранения энергетического и пластического резерва клеток. Высокоплоидные гепатоциты, вследствие наличия в них продублированного несколько раз генетического материала, отличаются большей устойчивостью, являются более дифференцированными, процессы гетеросинтеза в них преобладают над аутосинтезом [8, 13].
На 180-е сутки содержания крыс на высокожировом рационе гистоструктура печени подверглась значительным изменениям, выразившимся в увеличении площади некротизиро-ванных участков (10-15 % от общей площади исследуемых участков печени), окруженных лимфомакрофагальным инфильтратом, нарушении балочного строения долек печени. Гепато-циты не образовывали трабекул, располагались беспорядочно, синусоиды не прослеживались. Было отмечено расширение крупных портальных трактов за счет разрастания стромы и заполнения ее воспалительным инфильтратом. Некоторые портальные тракты были с некротическими изменениями сосудов. Стенки таких сосудов слабо различались, в некоторых случаях были нарушены. Выявлялась деструкция желчных протоков, сопровождаемая большими очагами воспалительного инфильтрата. На препаратах, окрашенных по Ван-Гизону, в препортальной зоне четко обнаруживались коллагеновые волокна, что является прямым доказательством сформировавшегося фиброза печени (см. рис. 2, г). Площадь гепатоцитов у крыс опытной группы 3 увеличивалась в 2 раза (р < 0,001) по сравнению с площадью клеток животных контрольной группы и на 35 % по сравнению с величиной показателя крыс опытной группы 2 (р < 0,001) (см. таблицу). Площадь ядер гепатоцитов сохраняла тенденцию к уменьшению, будучи меньше, чем у крыс контрольной группы, на 13 % (р < 0,001). При этом распределение по классам плоидности показало уменьшение пула 2с- и 8с-ядер гепатоцитов и повышение количества 4с-клеток. Число двуядерных гепатоцитов было больше на 10 %, чем в группе контроля. Следовательно, при формировании фиброза печени регенерация происходит за счет пролиферации гепатоцитов менее зрелых форм либо клеток желчных протоков. Данный механизм регенера-
ции способствует сохранению клеточного пула печени и поддержанию нормального функционирования органа при серьезном тканевом повреждении [12, 14].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные результаты исследования свидетельствуют, что высокожировая нагрузка способствует развитию деструктивно-дистрофических изменений ткани печени, морфологически классифицирующихся как стеатоз, стеатогепа-тит и фиброз. Структурно-функциональные нарушения активизируют механизмы клеточной репарации, которые напрямую связаны со степенью структурных изменений в ткани печени. На 30-е сутки воздействия на крыс высокожировым рационом при формировании стеатоза и отсутствии деструктивно-некротической трансформации ткани изменения в уровне плоид-ности клеток печени не выявляются. Процессы регенерации на данном этапе структурной реорганизации печени не затрагивают клеточные пролиферативные механизмы, а осуществляются другими путями, например, гипертрофией клеток. На 90-е сутки эксперимента при развитии стеатогепатита восстановление и сохранение структурно-функциональной целостности печени происходит за счет повышения числа высокоплоидных клеток. К 180-м суткам эксперимента при высокой степени повреждения органа, развитии фиброза механизмы регенерации печени регулируются через увеличение пролиферации менее зрелых форм гепатоцитов. Это подтверждается увеличением количества диплоидных клеток, а также возросшим числом двуядерных гепатоцитов.
Таким образом, характер плоидности гепа-тоцитов крыс в условиях высокожировой нагрузки зависит от длительности воздействия алиментарным фактором и степени структурных нарушений органа. Полученные результаты исследования расширяют знания о механизмах клеточной регенерации и структурной реорганизации печени, что может быть использовано для разработки профилактических и лечебных технологий заболеваний гепатобилиарной системы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Погожева А.В., Каганов Б.С. Современные взгляды на лечебное питание // Клинич. медицина. 2009. (1). 4-13.
Pogozheva A. V., Kaganov B.S. Modern view on dietetic therapy // Clinich. meditsina. 2009. (1). 4-13.
2. Fan J. Effect of low-calorie diet on steatohepa-titis in rats with obesity and hyperlipidemia // World J. Gastroenterol. 2003. 9. (9). 2045-2049.
3. Гарбузенко Д.В. Механизмы компенсации структуры и функции печени при ее повреждении и их практическое значение // Рос. журн. гастро-энтерол., гепатол., колопроктол. 2008. (6). 14-20.
Garbuzenko D. V. Mechanism of indemnification of structure and liver function at its damage and their practical value // Ros. zhurn. gastroenterol., gepatol., koloproktol. 2008. (6). 14-20.
4. Kaplowits N. Mechanism of liver cell injury // J. Hepatol. 2000. 32. (1). 39-47.
5. Кухарчук А.Л., Радченко В.В., Сирман В.М. Регенеративная медицина: направления, достижения, проблемы и перспективы развития. Стволовые пространства // Укр. мед. часопис. 2004. (3). 99-107.
Kukharchuk A.L., Radchenko V.V., Sirman V.M. Regenerative medicine: trends, achievements, problems and development prospects. Part II. Stem spaces // Ukr. med. chasopis. 2004. (3). 99-107.
6. Долгих М.С. Перспективы терапии печеночной недостаточности с помощью стволовых клеток // Биомед. химия. 2008. (4). 376-391.
Dolgikh M.S. Prospects of therapy of hepatic failure by means of stem cells // Biomed. khimiya. 2008. (4). 376-391.
7. Сакута Г.А., Кудрявцев Б.Н. Клеточные механизмы регенерации цирротически измененной печени крыс // Цитология. 2005. (5). 379-387.
Sakuta G А, Kudryavtsev B.N. Cellular mechanisms of cirrhotic rat liver regeneration // Tsitologiya. 2005. (5). 379-387.
8. Бродский В.Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка. М.: Наука, 1981. 259 с.
Brodsky V.Ya., Uryvaeva I.V. Cellular polyploidy. Proliferation and differentiation. M.: Nauka, 1981. 259 p.
9. Автандилов Г.Г. Компьютерная микротеле-фотометрия в диагностической гистоцитологии. М.: Изд-во РМАПО, 1996. 256 с.
Avtandilov G.G. Computer microtelephotometry in histocitology. М.: Publish. RMAPO, 1996. 256 p.
10. Безбородкина Н.Н., Оковитый С.В., Кудрявцева М.В. и др. Морфометрия митохондриаль-ного аппарата гепатоцитов нормальной и цирро-тически измененной печени крыс // Цитология. 2008. 50. (3). 228-235.
Bezborodkina N.N., Okovityi S.V., Kudryavtse-va M.V. et al. Morphometry of hepatocyte mitochondrial apparatus in normal and cirrhotic rat liver // Tsitologiya. 2008. 50. (3). 228-236.
11. Дзидзигури Д.В., Кудрявцев Б.Н., Модебад-зе И.Р. и др. Особенности кинетики популяции гепатоцитов крыс в условиях гормонального дисбаланса до и после частичной гепатэктомии // Цитология. 2005. 47. (6). 501-504.
Dzidziguri D.V., Kudryavtsev B.N., Modebadze I.R. et al. Kinetic features of rat hepatocyte population under hormonal disbalance before and after partial hepatectomy // Tsitologiya. 2005. 47. (6). 501-504.
12. Margall-Ducos G., Celton-Morizur S., Cou-ton D. et al. Liver tetraploidization is controlled by a new process of incomplete cytokinesis // J. Cell Sci. 2007. 120. 3633-3639.
13. Урываева И.В. Репликативный потенциал гепатоцитов и стволовые клетки печени // Известия АН. Сер. биол. 2001. (6). 728-737.
Uryvaeva I.V. Replication potential of hepatocytes and liver stem cells // Izvestiya AN. Ser. biol. 2001. (6). 728-737.
14. Никитин И.Г. Стволовые клетки печени: современное состояние проблемы // Клинич. перспективы гастроэнтерол., гепатол. 2004. (3). 10-19.
Nikitin I.G. Liver stem cells: the current state of problem // Klinich. perspectivy gastroenterol., hepa-tol. 2004. (3). 10-19.
HEPATOCYTE PLOIDY OF THE RATS UNDER THE HIGH FAT DIET
Nataliya Vladimirovna BIVALKEVICH, Yulia Konstantinovna KARAMAN, Tatyana Alexandrovna GVOZDENKO
Vladivostok Affiliation of the Far Eastern Research Center of Physiology and Respiratory Pathology of the SB RAMS — Institute of Medical Climatology and Rehabilitation 690105, Vladivostok, Russkaya str., 73g
The ploidy of rats' hepatocytes under the high fat diet condition has been investigated. It was shown that cellular mechanisms of regeneration on the way of hepatocytes polyploidy were performed only under the high degree of the organ damage (steatohepatitis), while there were no changes of the liver cells ploidy level under the condition of steatosis and absence of the destructive necrotic transformation of tissues.
Key words: liver, high fat diet, polyploidy.
Bivalkevich N.V. — junior researcher of the laboratory of biomedical researches, e-mail: [email protected] Karaman Yu.K. — candidate of biological sciences, senior researcher of the laboratory of biomedical researches, e-mail: [email protected]
Gvozdenko T.A. — doctor of medical sciences, director, e-mail: [email protected]
