CC BY
16
ЭКОЛОГИЯ
УДК 582.232:57.083.13
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ В ПЕРИОДИЧЕСКОЙ И ДИАЛИЗНОЙ КУЛЬТУРАХ ЦИАНОБАКТЕРИИ ЗУШСИОСОССШ 8Р. РСС 6301
Е.Л. Барский, |А.Ф. Лебедева|, Я.В. Саванина, С.Ю. Королева,
Ю.Н. Королев, Е.С. Лобакова
(кафедра биоинженерии; е-таИ: [email protected])
Получены данные методом спектроскопии внутреннего отражения о наличии, распределении и пространственной упорядоченности биополимеров как в целых интактных клетках, так и в заранее определенном слое клеток культуры цианобактерии Бупескососсш 8р. РСС 6301, выращенных в периодическом и диализном режимах культивирования. Показано принципиальное отличие поведения культуры при этих способах культивирования. Подобный подход может быть использован для уточнения нормативов предельно допустимых концентраций при их определении в лабораторных условиях, при стандартизации тест-объектов, при создании культуры с максимально возможной адаптацией при изменяющихся условиях внешней среды.
Ключевые слова: цианобактерия Бупескососсш 6301, диализное культивирование, пространственно-временная организация, спектроскопия внутреннего отражения.
Оценка экологического состояния природных объектов, введение допустимых уровней антропогенных воздействий и выявление последствий различных сценариев воздействия на биологический компонент экосистемы составляют основные задачи системы экологического контроля. Эта система основана на концепции предельно допустимых концентраций (ПДК) загрязняющих веществ [1].
Этот подход не позволяет однозначно определять экологические закономерности, отражающие воздействие окружающей среды на биологические объекты [2]. Это объясняется тем, что нормативы ПДК определяются в лабораторных условиях с использованием определенного набора объектов (микроорганизмы, клетки и клеточные культуры, растения, животные и пр.), оцениваемые по ограниченному набору физиологических и тестовых реакций. Например, к стандартным измеряемым параметрам культур микроводорослей относят: содержание хлорофилла а, количество, биомассу и объем клеток, активность фотосинтеза [3]. Изменения, вызываемые воздействием токсикантов, могут происходить как одновременно, так и с задержкой от нескольких часов до нескольких дней [4]. Границы толерантности тестовых организмов по отношению к единичным воздействиям неоправданно экстраполируются на многокомпонентные природные сообщества, где действуют одновременно сложные комплексы факторов самой различной природы, находящиеся,
в отличие от стандартных лабораторных популяций, в разных условиях функционирования.
Для оценки экологического состояния природных объектов предлагается подход, основанный на диализном культивировании популяций организмов. Известно, что состояние клеток при диализном культивирования по ряду аспектов соответствует состоянию организмов, находящихся в реальных природных условиях. Задача настоящей работы заключалась в том, чтобы показать в конкретном эксперименте с помощью сравнительного анализа культуры микроорганизмов изменения в пространственно-временной организации макромолекул важнейших биополимеров в процессе диализного и периодического культивирования. Критерием могут служить отличия в динамических характеристиках микробного объекта при двух различных режимах культивирования.
Методология анализа ответов микробных клеток на внешние факторы воздействия основана на регистрации изменений пространственно-временных параметров клеточных популяций методами послойного неинвазивного анализа с использованием спектроскопии внутреннего отражения [5].
Объекты и методы исследования
В работе использована аксеничная культура цианобактерии Бупескососсш 8р. РСС 6301 (Апасу$И$ nidulans), далее Бупескососсш 6301. Клетки культи-
вировали в люминостате при круглосуточном освещении (1500 лк), температуре 25—27° в конических колбах с объемом среды 300 мл как в периодической, так и в диализной культуре на минеральной среде "С" [6].
Диализное культивирование проводили, как в работе [7]. Для поддержания однородности популяций, инокулят брали из пересеваемой культуры. Отбор проб производился на 2, 9 и 25-е сут культивирования. Плотность клеточных суспензий определяли нефелометрически при 540 нм на спектрофотометре фирмы Hitachi (Япония), модель U-2000. Состояние клеток и их концентрацию контролировали микроскопически, а также по изменению величин рН и окислительно-восстановительного потенциала (Е^) среды культивирования [7].
Для изменений параметров клеток цианобакте-рий использовали методологию многократного нарушенного полного внутреннего отражения в инфракрасном диапазоне в области 1800—1200 см-1. Сравниваемые спектры получали для одинаковой биомассы образцов. Используемый для анализа материал, содержащий клетки, регистрировали по описанной методике [8]. Суммарное время этой процедуры и регистрации параметров образца не превышало 1—2 мин.
Интенсивность полос поглощения в спектре микроорганизмов определяется соотношением основных биохимических компонентов клетки: белков, нуклеиновых кислот, углеводов и липидов. Интенсивности полос при 2930 см-1, 1740 см-1 и 1460 см связаны с липидными компонентами, полосы поглощения в области 1100 см-1 характеризуют наличие в клетке углеводов, две интенсивные полосы с частотами максимумов около 1240 см и 1080 см обусловлены наличием нуклеиновых кислот, полосы поглощения в области 3300 см-1, 1660 см-1, 1550 см-1 соответствуют в основном белкам, полипептидам и солям аминокислот [9].
При исследовании клеток использовали пленочные поляризаторы из фторопласта и полиэтилена со степенью поляризации 96—98%. Для полу-чеия спектральной информации о внешнем слое применяли пластины из германия, обеспечивающие проникновение светового потока в клетку на 0,2 мкм. Измерительный элемент из сульфида цинка марки КО-2, обеспечивающий проникновение светового потока на 3 мкм, использовался для получения спектрального анализа целой клетки. Угол падения светового потока (9 = 45°) позволяет упростить расчет дихроичных отношений К, получаемых из соотношения оптических плотностей параллельной и перпендикулярной компонент плоско поляризованного света (К = D=/D±). К, равное 2, свидетельствует об изотропном состоянии объекта; отклонение К от этого значения в любую сторону характеризует степень анизотропии. Выбранное со-
отношение 9 >> 9кр позволяет анализировать даже интенсивные амидные полосы [10].
Методы спектроскопии внутреннего отражения обеспечивают сохранность нативного состояния исследуемых объектов. Используемый нами метод позволяет исследовать целые клетки и их послойные характеристики, а также получать информацию о наличии биохимических компонентов, идентифицируемых по их спектральным характеристикам, в заранее определенном, измеряемом слое клетки. Спектральные характеристики, полученные в поляризованном свете, дают информацию о процессах, связаных с пространственной переориентацией отдельных (белковых) макромолекул, что может служить характеристикой прижизненной организованности системы в определенный момент времени.
Спектральные характеристики, полученные в поляризованном свете, отражают процессы, которые выражаются в пространственной переориентации отдельных макромолекул. Можно предположить, что преимущественная ориентация определенных химических связей в ансамблях макромолекулярных компонентов клеток характеризует прижизненную организованность биосистемы.
Этот подход заставляет обратить особое внимание на пограничные структуры организма клеток (клеточные стенки, чехлы и слизистые выделения), через которые и осуществляется взаимодействие организма со средой обитания, как на избирательный информационный (волновой) фильтр, в определенной степени способный регулировать меру воздействия внешней среды на организм.
Результаты и обсуждение
Метод диализного культивирования основан на отделении исследуемой суспензионной культуры клеток от внешнего объема среды полупроницаемой мембраной, через которую осуществляется диффузия веществ. Клетки микроорганизмов концентрируются в мешке из полупроницаемой мембраны с размерами пор, пропускающих соединения с определенной молекулярной массой. Мешок погружен в 5-кратный объем "внешней среды", что обеспечивает свободное выведение продуктов обмена и поступление субстрата [7]. Метод позволяет анализировать развитие культур микроорганизмов и их обменные процессы в условиях, более соответствующих естественным, чем при периодическом культивировании. Накапливающиеся во "внутреннем" объеме высокомолекулярные полисахариды объединяют отдельные клетки и создают вокруг них специфические условия — организмы развиваются не в водно-солевой среде, а в коллоидном матриксе, как в природной биопленке циано-бактерий [7].
ния изменении структурной организации неразрушенных клеток и их гетерогенности в процессе функционирования анализировали спектральные характеристики с разной глубины проникновения светового потока в инфракрасной области в диапазоне 1800—1200 см-1. При этом наблюдались изменения интенсивности полос поглощения, характерные для различных компонентов клеток.
На рис. 2 представлены ИК спектры целых клеток периодической и диализной культур цианобак-терии на 2-е сут культивирования. Спектральные характеристики для целых клеток обеих культур сходны между собой, что можно объяснить незначительным сроком культивирования. Тем не менее различия между культурами были заметны уже на этапе подготовки образца: в периодической культуре клетки были частично обесцвечены и агрегированы, а в диализной культуре сохраняли яркую окраску и не образовывали агрегатов.
Рис. 1. Кривые роста клеток цианобактерии 8упескососси$ 6301 при периодическом (/) и диализном (2) культивировании
Рост цианобактерий в периодической и диализной культурах соответствует обычной 8-образ-ной кривой (рис. 1). Клетки начинают расти после лаг-периода, длительностью 3—4 сут. Следующая за ним экспоненциальная фаза роста переходит в стационарную фазу роста к 15—20 сут культивирования при максимальной концентрации клеток 30 и 150 - 106 кл/мл для периодической и диализной культуры соответственно. Пробы отбирали в лаг-фазе (2-е сут), логарифмической (9-е сут) и стационарной фазе роста (25-е сут).
В каждой фазе роста микроорганизмы характеризуются определенными морфологическими и физиологическими особенностями, которые лучше прослеживаются в периодических культурах. Так, популяция Synechococcus 6301 в периодической культуре представлена "молодыми" — округлыми мелкими одиночными клетками только на ранних стадиях развития (лаг-фаза и логарифмический рост). Изучение возрастных изменений в живой системе связано с анализом механизмов перехода из одной фазы развития в другую. Эти изменения являются совокупностью многих параметров живой системы, в которой важную роль играет перестройка метаболизма и модификация пространственно-временной организации системы [11].
Для оценки функционального состояния клетки анализировали изменение содержания в клетках биополимеров (белков, нуклеиновых кислот, липи-дов, полисахаридов), их пространственное распределение, а также структурную организацию, включая пространственную ориентацию определенных химических связей в макромолекулах. Для изуче-
Рис. 2. И К с пектры кл еток на 2-е сут развития периодической (/) и диализной (2) культуры
Представляют интерес данные, полученные для внешних структур клеток. Наблюдаются значительные изменения спектров для периодической культуры в области 1400—1300 см (рис. 3), т.е. в спектральной области, характерной для продуктов метаболизма. Это может быть обусловлено адаптацией клеток к изменяющимся условиям среды обитания периодической культуры. Для диализной культуры таких заметных изменений не обнаружено.
Рассмотрим возможные структурные изменения, происходящие в основных биохимических компонентах клеток. Расчет дихроичных отношений белковых полос амид 1 (1660 см-1) и амид 2 (1550 см-1) показывает, что для периодической культуры высокая степень изотропности наблюдается как для целой клетки, так и для ее внешних структур. Такие дихроичные отношения характерны для пери-
Рис. 3. И К спектры внешних структур клеток на 2-е сут
развития периодической (/) и диализной (2) культуры
ода адаптации клеток к среде, причиной которой является изменение среды обитания [11]. На основании этого можно заключить, что на ранних этапах роста периодическая культура представляет собой систему с высокой степенью открытости. Для диализной культуры соотношение пространственной организации внешних структур и целой клетки соответствует теоретическому: клетка близка к изотропности, а ее внешние структуры — к анизотропии. Незначительные изменения для диализной культуры могут объясняться отсутствием градиента в организации между средой и клетками в диализном мешке. Возможно, аналогичная ситуации характерна для популяций в реальных экосистемах.
Ранее изменения метаболизма цианобактери-альных клеток в лаг-фазный период наблюдались нами при измерении рН и Е^ среды культивирования. Начало роста как периодической, так и диализной культуры сопровождается увеличением рН от 7 до 8—9 ед. и снижением величины Е^ от 500—600 мВ до 250—400 мВ [7], обусловленными накоплением в клетках фототрофных и гетеротрофных микроорганизмов и последующим выделением в среду низкомолекулярных тиоловых соединений, что свидетельствует о существенных физиологических изменениях, происходящих в клетке к началу интенсивного роста. Можно предположить, что восстановительные условия как внутри клеток, так и в среде в лаг-фазный период необходимы для последующего роста клеток и синтеза биологически активных соединений [7].
На рис. 4 представлены спектры периодической и диализной культур 8упескососсш 6301 на 9-е сут культивирования. В области полос амид 1 и амид 2 наблюдаются существенные различия и в спектрах для целых клеток, и для их внешних структур (рис. 5). Расчет дихроичных отношений для периодической культуры в логарифмической фазе роста
Рис. 4. И К спектры клеток на 9-е сут развития периодической (/) и диализной (2) культуры
показывает резкое возрастание анизотропии в поверхностных слоях, т.е. уменьшается степень открытости системы и взаимодействия со средой обитания. Наблюдается также появление в параллельно поляризованном свете полосы поглощения в области 1450 см , отсутствующей в целых клетках.
Диализная культура, как и в лаг-фазном периоде, сохраняет противоположные соотношения между изотропностью и анизотропией для внешних слоев и целых клеток. Увеличение Е^ в фазе интенсивного роста, вероятно, связано с использованием тиоловых соединений на биосинтетические процессы в активно растущих клетках [7].
На рис. 6 представлены спектры указанных культур на 25-е сут культивирования. В спектрах целых клеток различия обнаруживаются в области полос амид 1 и амид 2. Для внешних структур наиболее
1
Рис. 5. ИК спектры внешних структур клеток на 2-е сут развития периодической (/) и диализной (2) культуры
Рис. 6. И К спектры клеток на 25-е сут развития периодической (1) и диализной (2) культуры для перпендикулярной поляризации светового потока
значительные различия наблюдаются в спектрах, полученных при различных поляризациях (рис. 7). В поляризованном свете во внешних слоях периодической культуры наблюдается появление мощной полосы поглощения в области 1450 см-1, которая отсутствует для целых клеток. Аналогичные изменения в спектре диализной культуры не обнаружены.
Для диализной культуры характерно увеличение продолжительности стационарной фазы, при этом ряд ее физиологических параметров, таких как скорость фотосинтеза и содержание пигментов у автотрофов, на протяжении опыта не изменяется [12]. В стационарной фазе роста по данным микроскопии до 80% популяции периодической культуры представлены удлиненными клетками и цепочками из 2—4 кл. В диализной культуре морфология клеток на протяжении опыта не изменяется. рН периодической культуры достигает 11—11,5 ед., диализной — 9—10,5 ед. Е периодической культуры продолжает возрастать, что может быть связано с окислительными процессами в деградирующих клетках, Е диализной культуры поддерживается на уровне, характерном для более молодых клеток [7].
Если считать, что структурирование приводит к резкому сокращению разнообразия резонансных систем в пограничном слое, т.е. к минимизации волновых взаимодействий со средой обитания, то, согласно экспериментальным данным, степень дихроизма внешних структур клеток характеризует и
Рис. 7. И К спектры внешних структур клеток на 25-е сут развития периодической (1) и диализной (2) кулыуры для перпендикулярной поляризации светового потока
степень открытости живой системы [13]. В работе показана также зависимость изменений степени открытости от этапа развития живой системы и от характера взаимодействия среды обитания и развивающегося организма [11].
Таким образом, с использованием указанного выше динамического градиентного подхода было проведено сравнение одной и той же культуры циа-нобактерии Вупескососсш 6301 в разных режимах культивирования — периодическом и диализном. Получены данные об изменениях, происходящих в неразрушенных клетках и их внешних слоях, свидетельствующие о меняющемся биохимическом составе клеток и пространственной организации макромолекул важнейших биополимеров в процессе культивирования. Показано принципиальное отличие поведения культуры в разных режимах культивирования. Подобный подход может быть использован для уточнения нормативов ПДК при их определении в лабораторных условиях, а также, с нашей точки зрения, в экологии при стандартизации тест-объектов и при создании культуры с максимально возможной адаптацией при изменяющихся условиях внешней среды, так как диализная культура, вероятно, в большей степени соответствует модели поведения организмов, находящихся в реальных условиях, поскольку при диализном культивировании можно создавать различные фоновые условия, приближенные к реальным условиям функционирования живых систем.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Максимов В.Н., Булгаков Н.Г., Левич А.П. Количественные методы экологического контроля: диагностика,
нормирование, прогноз // Междунар. конф. "Экополис 2000". М., МГУ. 2000. С. 79—83.
2. Абакумов В.А. Экологические модификации и критерии экологического нормирования // Тр. междунар. симпоз. Л.: Гидрометиздат, 1991. С. 18—41.
3. Shubert L.E. Algae as ecological indicators. L.: Academic press, inc., 1984. P. 213—237.
4. Campanella L, Cubbada F., Sammartino MP., Saone-illa A. Algal biosensor for the monitoring of water toxicity in estuarine environment //Water res. 2001. Vol. 35(1). P. 69—76.
5. Лебедева А.Ф., Барский Е.Л., Саванина Я.В., Королева C. Ю., Королев Ю.Н., Лобакова Е.С. Диализное культивирование микроорганизмов как адекватная модель контроля популяции при исследовании экосистем // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. 2010. № 2. С. 15—20.
6. Kratz W.A, Myers J. Nutrition and growth of several blue-green algae // Am. J. Bot. 1955. Vol. 42. P. 2282—2287.
7. Лебедева А.Ф., Саванина Я.В., Барский Е.Л. Изменения редокс-потенциала и содержания углеводов в среде при периодическом и диализном культивировании ци-анобактерии Anacystis nidulans и бактерии Pseudomonas diminuta // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. 2002. № 2. C. 24—29.
8. Калабеков А.Л, Королев Ю.Н. Экологический мониторинг: некоторые методы неинвазивного анализа ин-тактных клеток. М.: Прима-Пресс, 2000. 179 с.
9. Красильников Н.А., Эль-Регистан Г.И., Илясова В.Б., Агре Н.С. Инфракрасные спектры целых клеток // Микробиология. 1970. Вып. 3. C. 471—479.
10. Харрик Н. Спектроскопия внутреннего отражения. М.: Мир, 1977. 335 с.
11. Королев Ю.Н, Гусев М.В., Соина В.С., Эль-Ре-гистан Г.И. О взаимосвязи структурно-пространственной организации клеток и различного уровня их метаболической активности // Синергетика. 2001. № 4. C. 266—238.
12. Саванина Я.В., Лебедева А.Ф., Барский Е.Л. Диализное культивирование цианобактерий // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. 2008. № 2. C. 16—25.
13. Гусев М.В., Королев Ю.Н. Эволюция и "открытость" живых систем (о взаимосвязи теории и эксперимента) // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. 2004. № 3. C. 3—12.
Поступила в редакцию 18.11.09
COMPARATIVE ANALYSIS OF SPACE-TIME ORGANIZATION OF BIOLOGICAL SYSTEMS IN PERIODIC AND DIALIZED CULTURES OF SYNECHOCOCCUS SP. PCC 6301
E.L. Barsky, A.F. Lebedeva, Ya.V. Savanina, S.U. Koroleva, U.N. Korolev, E.S. Lobakova
Data about biopolymers, their distribution, space order in cyanobacterium Synechococcus 6301 cells as well as certain layer of cells cultivated in periodic and dialysis conditions were obtained by method of internal reflection spectroscopy. Distinction in kind of culture behavior in different cultivation conditions was shown. Similar approach may be used for standard specification of limiting concentration in laboratory conditions, test-object standardization and culture creation with maximum possible adaptation at environment variable conditions.
Key words: cyanobacterium Synechococcus 6301, dialysis cultivation, space-time organization, attenuated total reflection.
Сведения об авторах
Барский Евгений Львович — канд. биол. наук, вед. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-41-69; e-mail: [email protected]
Лебедева Александра Федоровна — канд. биол. наук, доц. кафедры биоинженерии. Саванина Янина Вячеславовна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-41-69; e-mail: [email protected]
Королева Светлана Юрьевна — инженер кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-25-87; e-mail: [email protected]
Королев Юрий Николаевич — докт. биол. наук, доц. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-25-87; e-mail: [email protected]
Лобакова Елена Сергеевна — докт. биол. наук, проф. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-41-69; e-mail: [email protected]
