CC BY
154
6. Кринский В.И. Автоволны: результаты, проблемы, перспективы / В. И. Кринский // Математическая биофизика: межвуз. сборник. - Красноярск: КГУ, 1985. С. 82—95.
7. Доррер Г.А. Описание процессов распространения и ликвидации природных пожаров с помощью агентных моделей. / Г.А. Доррер. С.В. Яровой // Сибирский лесной журнал. 2017. № 5. С. 105-113.
8. Jensen K. Coloured Petri nets: basic concepts, analysis methods and practical use. / K.Jensen, Berlin: Springer. V. 1. 234 p.
9. Ломазова И.А. Вложенные сети Петри: моделирование и анализ распределенных систем с объектной структурой. / И.А. Ломазова, М.: Научный мир, 2004. 208 с.
Сведения об авторах
Георгий Алексеевич Доррер
Профессор
Сибирский государственный университет науки и
технологий имени академика М. Ф. Решетнева
Эл. почта: g_a_dorrer@mail.ru
Российская Федерация, Красноярск
Сергей Викторович Яровой
Аспирант
Сибирский государственный университет науки и технологий имени академика М. Ф. Решетнева Эл. почта: ach_bask@mail.ru Российская Федерация, Красноярск
Information about authors
Georgy Alekseevich Dorrer
professor,
Reshetnev Siberian State University of Science and Technology
E-mail: g_a_dorrer@mail.ru Russian Federation, Krasnoyarsk Sergey Viktorovich Yarovoy
postgraduate
Reshetnev Siberian State University of Science and Technology
E-mail: ach_bask@mail.ru Russian Federation, Krasnoyarsk
УДК 574.64; 582.232 Я.В. Саванина, Е.Л. Барский, Е.С. Лобакова
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
МЕТОДОЛОГИЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СМЕШАННО-РАЗДЕЛЬНЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ
Рассмотрены подходы к детоксикации и очистке сточных вод и донных грунтов, загрязненных ионами тяжелых металлов (ТМ), с использованием культур цианобактерий и гетеротрофных бактерий при различных режимах культивирования - периодическом, диффузионном, смешанно-раздельном.
Ключевые слова: цианобактерии, микроводоросли, бактерии, диализное культивирование, водная токсикология, тяжелые металлы, биологическая очистка, биоремедиация.
УДК 574.64; 582.232 Ya.V. Savanina, E.L. Barsky, E.S. Lobakova
Moscow State University Lomonosov
РURIFICATION METHODOLOGY WASTEWATER TREATMENT USING MIXED-SEPARATE CULTURES OF MICROORGANISMS
Approaches to detoxification and purification of sewage and bottom soils contaminated with heavy metal ions (TM) using cultures of cyanobacteria and heterotrophic bacteria under different cultivation regimes - periodic, diffusion, mixed-separate (association) are considered.
Keywords: cyanobacteria, microalgae, bacteria, dialysis cultivation, water toxicology, heavy metals, biological purification, bioremediation.
Введение. Процессы самовосстановления и самоочищения окружающей среды уже не справляются с поступающими в нее загрязняющими веществами, которые из атмосферы и водной среды переходят в почву и донные грунты, где и аккумулируются. Соответственно растет востребованность технологий очистки. Их выбор определяется не только типом и количеством загрязнений, но также целями и задачами очистки. Такими задачами могут быть: детоксикация -снижение концентрации и токсичности действующих веществ, накопление ТМ с целью их возможного дальнейшего использования, в некоторых случаях - метаболизация накапливающихся в донных отложениях токсикантов.
Комплекс мероприятий, направленных на очистку и восстановление свойств природных сред, включая сточные воды и донные осадки, называется ремедиацией. Загрязняющие вещества в природных средах претерпевают различные превращения, в результате которых они могут накапливаться, переходить из одной среды в другую, трансформироваться, распадаться, минерализоваться в абиотических и биотических процессах. Целью ремедиационных технологий являются контроль и использование всех этих превращений для удаления и обезвреживания загрязнений. Биоремедиация - это комплекс методов очистки почв и вод, основанный на процессах самоочищения живой природы с использованием биохимического потенциала живых организмов. Биологические методы используются, если содержание загрязнителя в среде ниже порога биотоксичности. К преимуществам данного подхода можно отнести относительно низкую стоимость и, как правило, отсутствие вторичных отходов, образующихся при других методах очистки. К недостаткам биоремедиации относится низкая скорость биодеградации токсикантов и необходимость проведения тщательных предварительных исследований с учетом спектра токсикантов.
Самыми массовыми загрязнителями, особенно в городских условиях, являются углеводороды, тяжелые металлы, полициклические ароматические углеводороды, хлорорганические соединения (растворители, пестициды) [1]. Тяжелые металлы (ТМ) характеризуются достаточно высокой токсичностью, антибактериальным и цитостатическим эффектом. Особое положение ТМ среди загрязнителей связано с возможностью их накопления и передачи по пищевым цепям. Существует целая группа химических элементов, называемых редкими металлами (Ti, Zn, Nb, Ta, Mo, W) и используемых в промышленности, которые становятся загрязнителями из-за недостаточной очистки сточных вод, в тоже время их концентрация в земной коре невелика, а добыча связана с определенными трудностями. Применение устойчивых к загрязнению ТМ видов и штаммов микроводорослей и цианобактерий для биологической очистки соответствующих промышленных стоков может служить альтернативным подходом к детоксикации и извлечению ценных металлов из промышленных стоков, природных водоемов и почв [2].
Цель работы. Проанализировать возможности детоксикации и очистки стоков, содержащих ионы ТМ, с использованием культур цианобактерий и гетеротрофных бактерий при различных режимах культивирования.
Материалы и методы. В экспериментах по детоксикации и накоплению ТМ использовали культуры цианобактерий, отличающихся по устойчивости к воздействию ТМ одноклеточной Synechococcus sp. PCC 6301 (далее в тексте Synechococcus 6301) и нитчатой гетероцистной Nos-toc sp. из коллекции кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ, бактерий Pseudomonas diminuta, выделенных из ванадийсодержащего промышленного водоема [3], а также культуру микроводорости ^loreHa sp.
Исследуемые токсиканты: 50 мг/л NH4VO3 [3], Au3+ (промышленный концентрат, содержащий 11-12 мг/л), 0,3 мг/л CuCh или медные пластинки площадью 1,5 см2.
Уровень детоксикации среды от ТМ оценивался по остаточному содержанию металла в среде [4] и с использованием диализной тест-культуры Synechococcus 6301 [5].
Физиологическое состояние культур цианобактерии оценивали по следующим параметрам:
1) общее количество клеток;
2) содержание в культуральной жидкости углеводов [3];
3) изменения pH и окислительно-восстановительного потенциала (Eh) среды культивирования [4].
Содержание клеток в культурах определяли как среднюю величину из 3 повторностей (отклонения составляли 10-12%). Погрешности измерения оптической плотности прозрачных растворов не превышали 5%, а рассеивающих образцов (клеточные суспензии) - 12%. Погрешности определения концентрации ванадата и углеводов в среде составляли 8 и 10% соответственно, а определения pH и Eh - не превышали 12 и 16% соответственно.
Результаты и обсуждение. В течение 1-2 сут после внесения ванадата его концентрация в периодической культуре Ps. diminuta снижается от 50 до 3-4 мг/л, а затем начинает постепенно увеличиваться - в среду культивирования бактерии возвращается до 60% ванадия. Выведение избыточного количества ТМ представляет собой один из способов защиты организма от их ток-
сического действия. В среде периодической культуры Synechococcus 6301 в 1-2 сут также наблюдается быстрое снижение концентрации ванадата, но до 90% поглощенного ванадия остается в клетках цианобактерии. В случае смешанно-раздельной диализной культуры как с цианобакте-риальным компонентом Synechococrns sp. 6301, так и с Nostoc sp.,содержание ванадата в среде вне диализного мешка падает в течение 1-2 сут практически до нуля, а затем постепенно увеличивается лишь до 8-10 мг/л [4]. Микробиологические процессы удаления металлов из растворов можно подразделить на три группы: а) адсорбция металлов на поверхности микробных клеток, б) поглощение металлов клетками, в) их химическое превращение.
Поверхностное связывание ионов ТМ клетками цианобактерий и бактерий осуществляется в течение первых часов инкубации и обусловлено электростатическим взаимодействием с отрицательно заряженными группами клеточных оболочек, включая клеточные стенки и поверхностные структуры (слизистые слои, капсулы и чехлы) и диффузный слой полисахаридов вблизи клеток. Степень диссоциации ионогенных групп на поверхности клеток зависит от рН среды [3, 6].
От величины pH зависит как жизнедеятельность микроорганизмов, так и скорость миграции ТМ. Это важный параметр, влияющий на адсорбцию, обмен ионов, их доступность, окислительно-восстановительные реакции, комплексообразование и пр. То же относится к окислительно-восстановительному потенциалу Eh среды.
Внутриклеточное связывание ионов ванадата клетками Ps. diminuta и цианобактерий обусловлено их взаимодействием с такими внутриклеточными компонентами, как металлотионеины и гамма^1и-Су8-пептиды, включая глутатион. Эти соединения характеризуются низким молекулярным весом и высоким содержанием SH-групп [6]. Ранее установлено, что под действием различных ТМ клетки Ps. diminuta выделяют в среду тиоловые соединения, увеличение концентрации которых коррелирует с уменьшением величины Eh среды. При добавлении ванадата величина Eh в культуре цианобактерии снижалась от 540 до 500 мВ, в культуре Ps. diminuta величина Eh падала значительно ниже - до 390 мВ. Соответственно внутриклеточная концентрация SH-групп в ответ на добавление ионов ванадата увеличивается для Synechococcus 6301 в 4-5 раз, а для Ps. diminuta - в 100-150 раз [6].
Таблица
Оценка детоксикации среды от соединений ТМ с помощью тест-культуры и по остаточному содержанию ТМ в среде
Варианты опыта Количество клеток тест-культуры % от контроля Остаточное содержание ТМ в среде мг/л через 7 сут
Nostoc sp., VO3- 84,1 3-5
Ps. diminuta, VO3- 78,5 30-35
смешанно-раздельная культура, VO3- 91,5 8-10
Nostoc sp., Au3+ 73 < 1
смешанно-раздельная культура, Au3+ 82,2 < 1
смешанно-раздельная культура Synechococcus 6301, CuCl2 65 < 0,03
смешанно-раздельная культура Synechococcus 6301, Cu (пластинки) 78 < 1,17 мг/л
100% содержание клеток тест-культуры Synechococcus 6301~1 млн/мл, инкубация на тестируемой среде - 2 сут.
В таблице приведена сравнительная оценка остаточного содержания металла в среде и де-токсикации среды от ванадата (после 7 сут очистки), измеренной с помощью диализной тест-культуры Synechococcus 6301 на 2-е сут инкубации (в % от контроля). Максимальная степень детоксикации наблюдалась для смешанно-раздельной культуры (ингибирование тест-культуры при внесении в неочищенную среду - 62%), но при этом важно отметить, что чистые культуры цианобактерий и Ps. diminutа меньше отличаются по степени детоксикации среды, чем по уровню связывания металла. Поскольку низкомолекулярные SH-содержащие соединения свободно проходят через диализную мембрану, их появление во «внешней» среде совпадает с повышением уровня остаточного содержания «ванадия» в культуральной жидкости. Для определения содержания ванадия в среде культивирования нами использована цветная реакция, для которой необходимо присутствие перекиси водорода и азотной кислоты, т.е. весь содержащийся в пробе металл переходит в высокоокисленную форму (IV, V). Можно предположить, что ранее
поглощенный металл выводится из клеток совместно с тиолсодержащими соединениями и в культуральной жидкости он присутствует в менее токсичной (II, III) форме.
Минимальное повышение концентрации ванадия в среде смешанно-раздельной культуры по сравнению с таковым для аксеничных культур может быть объяснено значительным увеличением биомассы цианобактерий относительно периодической культуры и взаимным влиянием компонентов ассоциативной культуры.
Природные и культивируемые популяции микроводорослей и цианобактерий гетерогенны и часто включают в качестве гетеротрофного компонента бактерии, грибы, актиномицеты. Отсутствие строгой приуроченности микроорганизмов к цианобактериальному партнеру позволяет создавать в экспериментальных условиях сообщества, не встречающиеся в природе, включающие, например, лабораторные штаммы цианобактерий и аборигенные бактерии из промышленных водоемов. При смешанно-раздельном культивировании цианобактерии концентрируются в диализном мешке, а гетеротрофные бактерии - во внешнем объеме. В этих условиях ингибирую-щий эффект, связанный с межклеточными контактами разных культур отсутствует. В природных ассоциациях суммарный гетеротрофный компонент составляет 0,1-1%, при диализном культивировании доля бактерий увеличивается до 10-20% [4].
Взаимная регуляция компонентов проявляется, в частности, в поддержании постоянства рН среды в динамике развития смешанно-раздельной культуры на уровне 7-7,5. В периодической культуре Synechococcus 6301 уже в начале логарифмической фазы роста рН увеличивается до 10-10,5 (что снижает накопление большинства ТМ), а в культуре Ps. diminuta pH снижается до 5 - 4,5.
В присутствии ТМ большинство цианобактерий синтезирует повышенное количество органических веществ, главным образом отрицательно заряженных полисахаридов. Как и полисахариды клеточной оболочки, диффузионный слой экзополисахаридов выполняет барьерную функцию между организмом и окружающей средой, лимитируя процессы биосорбции ТМ. В условиях диффузионного культивирования высокомолекулярные углеводы накапливаются внутри диализного мешка. [2,6].
Рост гетеротрофных бактерий на минеральной среде при смешанно-раздельном культивировании обеспечивается поступлениями низкомолекулярных углеводов из диализного мешка с цианобактериями. В свою очередь, клетки Ps. diminuta интенсивно поглощают из среды ионы ванадата, накапливают тиоловые соединения, связывающие ионы ванадия в клетках. Усиление роста бактериального компонента в смешанно-раздельной культуре обеспечивает связывание ими большей части ванадия, следовательно, соотношение устойчивости и степени очистки среды от ТМ должно возрастать при воздействиях, способствующих повышенной экскреции углеводов цианобактериями в среду культивирования [3, 5].
После концентрирования металла в микроорганизме возникает проблема извлечения из него металла. Для этого можно использовать либо недеструктивный способ высвобождения металла из микроорганизма, либо экстракцию путем разрушения. Выбор метода определяется тем, насколько легко высвобождается металл из микроорганизма, что в свою очередь зависит от способа связывания (поверхностное или внутриклеточное) и насколько ценен сам микроорганизм для того, чтобы имело смысл повторно его использовать.
Для проверки возможности удаления связанного металла и многократного использования культуры при очистке использовали наиболее устойчивую смешанно-раздельную пару Nostoc sp. и Ps. diminuta. При инкубации в течение 10 сут на среде с добавлением золотосодержащего промышленного концентрата (содержание Au3+ 11-12 мг/л) концентрация клеток Ps. diminuta и Nostoc sp практически не менялась. После отмывки клеток средой культивирования, содержащей 0,01 М ЭДТА, культуры начинают расти; причем количество клеток Nostoc sp. и Ps. diminuta через 14 сут культивирования увеличивается более чем в 5 и 8 раз соответственно.
Концентрация Au3+ в среде смешанно-раздельной культуры снижается через 1 сут в 10 раз и в дальнейшем не меняется. Определение содержания ионов золота в клетках показывает, что максимальное их количество клетками Nostoc sp. накапливается в течение 1 сут, а клетками Ps. diminuta. - в течение 10 сут. Удельное количество связанных с клетками Ps. diminuta ионов золота более чем в 2 раза превышает таковое для Nostoc sp. Таким образом, можно заключить, что большая часть поглощенного Au3+ в клетках цианобактерии Nostoc sp. связывается, главным образом, с поверхностными структурами клеточной стенки и слизистого чехла, тогда как в случае Ps. diminuta обнаруживается также и значительное связывание ионов золота внутриклеточными низкомолекулярными тиолами, что подтверждается при оценке Eh среды культивирования [7].
Отличия в степени детоксикации (таблица) могут объясняться сложным составом промышленного концентрата Au3+ - ряд компонентов эффективнее обезвреживается ассоциативной культурой.
В период с декабря по апрель загрязнители накапливаются главным образом в придонной части водоема, в теплый период они метаболизируются фитопланктоном и снова выявляются в поверхностном слое. Для проверки возможности очистки вод от данного типа загрязнителей исследовали взаимодействие модельных культур с медью. Медь является одним из наиболее распространенных альгицидов. Ингибирующее действие ионов Cu на фитопланктон проявляется при концентрациях 10-8 - 10-5 М. Некоторые фототрофные микроорганизмы способны в той или иной степени противостоять токсическому действию Cu [8]. Взаимодействие биопленок Chlorella sp. с медью включает как растворение металлической меди под действием метаболитов микроорганизмов, так и воздействие ионов Cu на растущие клетки.
Концентрация ионов Cu2+, добавленных к периодическим культурам Chlorella sp. и Syn-echococcus 6301 уже через 1 сут снижается в 10 раз. Смешанно-раздельные диализные культуры также активно поглощают ионы Cu, но, как наблюдалось при взаимодействии модельных систем с V5+ и Au3+, практически не выделяют Си2+ в среду.
В присутствии ионов Cu2+ концентрация клеток ^loreRa sp. и цианобактерии Synechococ-cus 6301 при выращивании в аксеничной культуре снижается на 40 и 80% соответственно, тогда как на средах с медными пластинками такое снижение составляет 20 и 50%. Напротив, ингиби-рование роста бактерий значительно выше в присутствии медной пластинки, чем ионов Cu2+. Смешанно-раздельные диализные культуры отличаются значительно большей устойчивостью автотрофного компонента к действию Cu, а также увеличением концентрации клеток гетеротрофного компонента в 2-5 раз, что может быть обусловлено как общей устойчивостью Ps. diminuta к токсическому действию ТМ, так и стимуляцией выделения органических субстратов клетками автотрофного компонента.
Растворение медных пластинок аксеничными и смешанно-раздельными культурами оценивалось как по физиологическому состоянию клеток, так и по появлению растворимой меди. В среде культивирования аксеничных культур Chlorella sp. и Synechococcus 6301 накапливается соответственно 2,8 и 0, 72 мг/л комплексных соединений Cu, суммарная концентрация в среде смешанно-раздельных культур - 1,35 и 1,17 мг/л.
Диализная (диффузионная) культура представляет собой одну из разновидностей культуры иммобилизованных клеток (на поверхности носителя, в гранулах гелей). Такие культуры характеризуются сниженной скоростью роста и фотосинтеза при сохранении высокой скорости метаболизма. Иммобилизованные аксеничные и смешанные культуры микроорганизмов используются для биотестирования, получения экзометаболитов, для очистки промышленных стоков и пр. Кроме того, при иммобилизации решается проблема отделения клеток микроорганизмов от очищенных сточных вод, что позволяет перейти от периодических схем очистки к более производительным непрерывным технологиям. предусматривающим использование проточных биореакторов. [4, 9]. Повышенную устойчивость иммобилизованных клеток можно объяснить образованием внеклеточного полимерного матрикса, покрывающего иммобилизованные клетки и частично сорбирующего токсиканты на своей поверхности, а также снижением токсической нагрузки на единицу площади поверхности прикрепленных микроорганизмов.
Заключение. Авторы считают, что в данной работе новыми являются следующие положения и результаты.
Диализные культуры цианобактерий могут использоваться при удалении и концентрировании ТМ из промышленных стоков, природных водоемов и почв. Наиболее эффективны смешанно-раздельные культуры цианобактерий и гетеротрофных бактерий. Данные по остаточному содержанию ионов ТМ в среде коррелируют со степенью детоксикации среды, измеренной с помощью тест-культуры и зависят от способа культивирования. Эффективность детоксикации среды от ванадата наиболее велика в диализной и особенно смешанно-раздельной культуре цианобактерий, в том числе и для Nostoc sp. Включение цианобактерий и микроводорослей в состав смешанных культур микроорганизмов, различающихся по типу питания, способствует как де-токсикации среды, так и максимальному накоплению токсикантов в биомассе.
Цитируемая литература
1. Янин Е.П. Ремедиация территорий, загрязненных химическими элементами: общие подходы, правовые аспекты, основные способы (зарубежный опыт). Проблемы окружающей среды и природные ресурсы: обзорная информация/ ВИНИТИ РАН. 2014. № 3. С. 3-105.
2. ГусевМ.В., ЛебедеваА.Ф., СаванинаЯ.В. Способность цианобактерий и микроводорослей к накоплению тяжелых металлов и возможность их использования для очистки водной среды // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. 1999. № 3. С. 12-22.
3. СаванинаЯ.В., ЛебедеваА.Ф., СавельевИ.Б. Смешанно-раздельное культивирование цианобактерий Anacystis nidulans и Nostoc muscorum и бактерий рода Pseudomonas в присутствии ванадия Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. 1994. № 2. 29-34.
4. ЛебедеваА.Ф., СаванинаЯ.В., БарскийЕ.Л. Диализное культивирование цианобактерий. Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. 2008. № 2. С. 16-25.
5. Саванина Я.В., Барский Е.Л., Фомина И.А., Лобакова Е.С. Диализная культура цианобактерий в биомониторинге качества водной среды. Материалы XXV Международн. конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». М.: ООО «Новые информационные технологии». 2016. C. 249-261.
6. Лебедева А.Ф., СаванинаЯ.В., Барский Е.Л. Изменения редокс-потенциала и содержания углеводов в среде при периодическом и диализном культивировании цианобактерии Anacystis nidulans и бактерии Pseudomonas diminuta. Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. 2002. № 2. С. 24-29.
7. Саванина Я.В., Лебедева А.Ф., Барский Е.Л., ГусевМ.В. Взаимодействие клеток микроорганизмов с ионами золота // Вестн. Моск. ун-та. Сер. «Биология». 2006. № 1. С. 31-44.
8. Саванина Я.В., Лебедева А.Ф., Барский Е.Л. Взаимодействие биоплёнок Chlorella sp. с медью. X Межд. конф. "Новые информационные технологии в медицине и экологии". 2007. Гурзуф, Тез. докл. С. 154-156.
9. Лобакова Е.С., Васильева С.Г., Дольникова Г.А., КащееваП.Б., Дедов А.Г. Изучение иммобилизации ассоциации бактерий-нефтедеструкторов на полимерных материалах различной химической природы // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16: Биология. 2014. № 4. С. 36-42.
Сведения об авторах
Information about authors
Янина Вячеславовна Саванина
Канд. биол. наук, научный сотрудник Эл. почта: v.savanin@gmail.com
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Россия, Москва
Евгений Львович Барский
Канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник
Эл. почта: gene_b@mail.ru
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
Россия, Москва
Елена Сергеевна Лобакова
Д-р, биол. наук, проф.
Эл. почта: elena.lobakova@gmail.com
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Россия, Москва
Yanina Vyacheslavovna Savanina
Cand. biol. Sciences, Researcher
Эл. почта: v.savanin@gmail.com
Moscow State University Lomonosov
Russia, Moscow
Evgeny Lvovich Barsky
Cand. biol. Sciences, Leading Researcher
E-mail: gene_b@mail.ru
Moscow State University Lomonosov
Russia, Moscow
Elena Sergeevna Lobakova Dr. Biol. sciences, prof. E-mail: elena. lobakova@gmail. com Moscow State University Lomonosov Russia, Moscow
