CC BY
160
Сравнительный анализ нестабильных и стабильных хромосомных аберраций в группах лиц, облучившихся внутриутробно во время аварии на ЧАЭС в различные периоды пренатального развития
Михайлова Г.Ф.
ГУ - Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск
Цитогенетически обследована группа детей, облучившихся во время аварии на ЧАЭС внутриутробно в различные периоды пренатального развития и проживающих впоследствии на загрязненных радионуклидами территориях. Было установлено, что наибольшая частота аберраций хромосомного типа, а также суммарная частота дицентриков и колец - аберраций-маркеров радиационного воздействия, наблюдается для I-го гестационного периода развития плода (0-8 недель). Все дети, облученные в период аварии на стадии I-го гестационно-го периода, являются носителями стабильных аберраций.
Введение
К настоящему времени уже сложилось вполне определенное мнение о том, что наиболее чувствительным к радиационному воздействию является пренатальный период развития организма. Внутриутробное развитие включает в себя ряд важных, последовательно протекающих периодов формирования человеческого организма. Поэтому любое негативное воздействие на эмбрион и развивающийся плод, к числу которых, несомненно, относится и радиационное воздействие, может в последующем привести либо к его гибели, либо к возникновению врожденных пороков развития, образованию опухолей в детском возрасте и др. Причем чувствительность к таким воздействиям и степень их выраженности во многом может определяться стадией пренатального развития. С учетом последовательности морфогенеза, в пренатальном развитии человеческого организма выделяют три главных периода: эмбриональный (до 8 недель), ранний (с 9 по 28 недели) и поздний (с 29 по 40 недели беременности) фетальные периоды. Развивающийся организм высоко чувствителен к действию ионизирующей радиации, особенно это, касается периода внутриутробного развития. Имеется достаточно данных, что даже малые дозы диагностического облучения (до 10 мГр), полученные в период антенатального развития, могут приводить к увеличению частоты лейкемии [3, 7, 8, 10, 12]. Исследования, проведенные в Японии на группе лиц, облучившихся внутриутробно при взрыве бомб в Хиросиме и Нагасаки, выявили следующие эффекты по сравнению с контрольной группой: более высокий процент лиц с умственной отсталостью и снижением антропометрических показателей (рост, масса тела, окружность головы и т.д.). Также было обнаружено уменьшение в группе облученных in utero доли лиц, облучение которых пришлось на эмбриональный период (до 4 недель). Авторы связывают это с увеличением числа выкидышей и мертворождений, за счет врожденных пороков развития [6].
Таким образом, учитывая все вышеизложенное, целью данного исследования было проведение сравнительного анализа цитогенетических показателей у детей и подростков, облу-
чившихся внутриутробно во время аварии на ЧАЭС в различные периоды пренатального развития и проживающих на загрязненных радионуклидами территориях Брянской и Калужской областей. Обследования проводились в период 1989-2003 гг.
Методы исследования
Исследования, представленные в настоящей работе, были выполнены на культуре лимфоцитов периферической крови человека с использованием метафазного метода учета нестабильных и стабильных аберраций хромосом.
Культивирование лимфоцитов
Кровь отбирали из локтевой вены обследуемых лиц, помещали в стерильную пробирку, содержащую раствор гепарина (200 ЕД/мл крови). В стерильных условиях образцы крови переливали по 0,8 мл в приготовленные для культивирования флаконы Карреля с культуральной средой. Состав культуральной среды (6,16 мл среды МЕМ; 1,6 мл инактивированной телячьей сыворотки; 0,08 мл L-глютамина; 0,08 мл р-ра антибиотика; 0,15 мл фитогемагглютинина). Флаконы помещали в термостат при 37 °С для инкубации клеток в течение 48 часов. Для блокирования митоза на стадии метафазы за 2 часа до окончания инкубации, во флаконы добавляли раствор демеколцина в концентрации 0,2 мкг/мл среды.
Гипотонизация клеток
После окончания культивирования культуру клеток переливали в центрифужные пробирки и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 15 мин для осаждения клеток. Надосадочную жидкость удаляли с помощью водоструйного насоса, добавляли, предварительно подогретый до 37 °С, гипотонический раствор (0,75 М KCl) и ресуспендировали в нем осадок. Далее пробирки с культурой клеток выдерживали на водяной бане (37 °С) 10-12 мин. По окончании гипотонизации вновь центрифугировали при тех же условиях, с последующим удалением надоса-дочной жидкости.
Фиксация клеток
Для фиксации клеток, осадок ресуспендировали в 1-1,5 мл свежеприготовленного фиксатора (смесь метилового спирта и ледяной уксусной кислоты в пропорции 3:1) на шейкере и доводили его объем до 10 мл. Смену фиксатора с последующим центрифугированием производили трижды.
Приготовление препаратов хромосом
Препараты готовили непосредственно после окончания фиксации. Суспензию клеток раскапывали на смоченные дистилированной водой, предварительно охлажденные предметные стекла. После высыхания препараты гидролизовали в 5N растворе соляной кислоты в течение 10 мин.
Окраска препаратов хромосом проводилась по методу Гимза.
Цитогенетический анализ проводили на световом микроскопе под иммерсией при увеличении 90х10. На каждую точку анализировали от 200 до 500 метафаз.
Анализировали все виды аберраций хромосом, распознаваемых без кариотипирования. Из аберраций хромосомного типа - ацентрические фрагменты (парные и точковые), центрические кольца и дицентрики. Это, так называемые, аберрации нестабильного типа. По современным представлениям из них дицентрики и центрические кольца являются аберрациями-маркерами радиационного воздействия. То есть, обнаружение в лимфоцитах периферической крови данного типа аберраций свидетельствует о воздействии на организм мутагенов радиационной природы.
Как это сейчас общепринято, к дицентрику и центрическому кольцу относили один сопутствующий парный фрагмент или парные точки (при отсутствии парных фрагментов). Поскольку ацентрические кольца и интерстициальные делеции (точки) не всегда удается четко дифференцировать, а также учитывая их возможный общий механизм образования, эти оба типа аберраций были объединены в один класс - ацентрические фрагменты.
Стандартный метод метафазного анализа, т.е. без кариотипирования, позволяет регистрировать и определенную часть, так называемых, стабильных аберраций. Это, так называемые, аномальные моноцентрики, являющиеся в подавляющем большинстве случаев результатом реципрокной транслокации. По последним данным [9], примерно, до 20 % от их исходной величины. В нашем исследовании они также учитывались. Чтобы уменьшить субъективизм при идентификации, аномальные хромосомы принимались за таковые лишь в двух случаях: когда имело место удлинение длинных плеч больших акроцентрических хромосом, либо если перестроенная (аномальная) хромосома имела плечи, превышающие длинные плечи хромосомы 2 (обладающей самыми длинными плечами в кариотипе), или близкие их длине при наличии обеих хромосом 2 в кариотипе.
Из аберраций хроматидного типа учитывали ацентрическое фрагменты (одиночные и парные) и обменные аберрации (в целом). К аберрациям хроматидного типа относили: концевые делеции или одиночные фрагменты, изоделеции (парные фрагменты), симметричные и ассиметричные обмены. Главную трудность в регистрации данного типа аберраций представляет отличие одиночных фрагментов от пробелов и изоделеций от парных фрагментов хромосомного типа. Критерием отличия одиночных фрагментов от пробелов служило смещение первых относительно оси хроматиды. За изохроматидные делеции принимали парные фрагменты дугообразной формы с сестринскими соединениями хроматид, а также парные фрагменты без соединений, расположенные рядом с исходной, поврежденной хромосомой. Свободно расположенные парные фрагменты учитывали как фрагменты хромосомного типа.
Для изучения стабильных хромосомных аберраций (транслокаций и делетированных хромосом) применяли метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с использованием прямомеченных хромосом 2, 4 и 12 (фирма ONKOR, Франция), составляющих 18,9 % генома. В работе использовали методические рекомендации фирмы-производителя.
Результаты
Зависимость выхода нестабильных хромосомных аберраций в группе детей, облучившихся внутриутробно в различные периоды пренатального развития,
проживающих в Брянской области
Исследование проводилось в 1992 г., т.е. через 6 лет после аварии на ЧАЭС, в г. Клинцы Брянской области. Загрязненность радионуклидами 137Сэ данного населенного пункта составляла 322 кБк/м2. Всего было обследовано 127 детей. В табл. 1 представлены полученные основные цитогенетические показатели для обследованной группы. Видно, что средние частоты ацентрических фрагментов, аберраций хроматидного типа и аномальных моноцентриков совпадают в пределах ошибки для всех гестационных периодов. Средняя частота дицентриков и центрических колец уменьшается в зависимости от гестационного периода: от 0,12 (на 100 клеток) в I период до 0,04 (на 100 клеток) в III периоде. Средняя частота аберраций хромосомного типа также выше для I периода, по сравнению со II и III периодом: соответственно 0,41 и 0,31, 0,32 на 100 клеток.
Таблица 1
Средняя частота аберраций хромосом (на 100 клеток) у внутриутробно облученных детей, проживающих на радиоактивно загрязненных территориях Брянской области, в зависимости от гестационного периода
Гестационный период Число человек Число клеток Хромосомный тип Хроматид-ный тип Аномальные моноцен- трики
ацентрики дицентрики и центрические кольца всего*
I: 0-8 недель 31 9000 0,29±0,06 0,12±0,03 0,41 ±0,07 0,41 ±0,07 0,03±0,02
II: 9-28 недель 63 17552 0,24±0,04 0,06±0,02 0,31 ±0,04 0,35±0,04 0,01±0,01
III: 29-40 недель 33 9036 0,27±0,05 0,04±0,02 0,32±0,06 0,37±0,06 0,01±0,01
* - без учета аномальных моноцентриков.
Зависимость выхода нестабильных хромосомных аберраций в группе детей, облучившихся внутриутробно в различные периоды пренатального развития, проживающих в Калужской области
За период с 1989 по 2003 гг. в Калужской области было обследовано 298 детей и подростков, облучившихся внутриутробно во время аварии на ЧАЭС. На момент обследования их возраст варьировал от 4 до 17 лет. В табл. 2 приведены обобщенные цитогенетические данные для обследованной группы. Видно, что средние частоты ацентрических фрагментов, аберраций хроматидного типа и аномальных моноцентриков практически совпадают (в пределах ошибки). Средняя частота дицентриков и центрических колец в I и II гестационных периодах выше, чем в III: 0,14 и 0,10 соответственно, однако достоверно не отличаются. Средняя частота аберраций хромосомного типа также выше для I и II периодов, по сравнению с III периодом: соответственно 0,45, 0,44 и 0,36 на 100 клеток.
Таблица 2
Средняя частота аберраций хромосом (на 100 клеток) у внутриутробно облученных детей, проживающих на радиоактивно загрязненных территориях Калужской области, в зависимости от гестационного периода
Гестационный период Число человек Число клеток Х эомосомный тип Хроматид-ный тип Аномальные моноцен- трики
ацентрики дицентрики и центрические кольца всего*
I: G-8 недель 61 24353 G,29±G,G3 G,14±G,G3 G,45±G,G4 G,69±G,G5 G,G3±G,G1
II: 9-28 недель 139 6234G G,3G±G,G2 G,14±G,G2 G,44±G,G3 G,74±G,G3 G,G3±G,G1
III: 29-4G недель 98 43771 G,26±G,G2 G,1G±G,G2 G,36±G,G3 G,8G±G,G4 G,G3±G,G1
* - без учета аномальных моноцентриков.
Зависимость выхода стабильных хромосомных аберраций в группах облучившихся внутриутробно в различные периоды пренатального развития
Исследование проводилось в 2GG3 г., т.е. через 17 лет после аварии на ЧАЭС, в г. Жизд-ра Калужской области. Загрязненность радионуклидами 137Cs данного населенного пункта составляла 111 кБк/м2. Всего было обследовано 39 подростков. В табл. 3 представлены результаты цитогенетического анализа стабильных аберраций обследованной группы подростков в зависимости от гестационного возраста плода на момент аварии. Видно, что среднегрупповая частота транслокаций была практически одинаковой (значимо не отличалась) во все периоды пренатального развития, однако более выраженный цитогенетический эффект наблюдался все же во втором и третьем периоде. Число лиц со стабильными аберрациями в подгруппах уменьшалось в зависимости от гестационного возраста плода на момент аварии - от 1GG % в период G-В недель до 64 % в период 29-4G недель.
Таблица 3
Результаты цитогенетического анализа стабильных аберраций обследованной группы детей в зависимости от гестационного возраста плода на момент аварии
Гестационный возраст плода (недели) Родившиеся в период Число обследованных лиц Среднегрупповая частота транслокаций % лиц со стабильными аберрациями
G-8 13.12.1986 - 1G.G3.1987 11 G,22±G,G4 1GG
9-28 26.G7.1986 - 12.12.1986 13 G,28±G,G3 77
29-4G 26.G4.1986 - 25.G7.1986 15 G,29±G,G3 64
Весь период 26.G4.1986 - 1G.G3.1987 39 G,26±G,G1 82
Таким образом, в группе детей облучившихся во время аварии на ЧАЭС внутриутробно в различные периоды пренатального развития и проживающих впоследствии на загрязненных радионуклидами территориях наибольшая частота аберраций хромосомного типа, а также сум-
марная частота дицентриков и колец - аберраций-маркеров радиационного воздействия, наблюдается для I гестационного периода развития плода (G-В недель). Все дети, облученные в период аварии на стадии I гестационного периода, являются носителями стабильных аберраций. По современным представлениям в основе канцерогенеза лежат мутационные изменения в соматических клетках организма [1, 11, 13]. На достаточно представительной выборке (около 3GGG человек) была продемонстрирована достоверная корреляция между риском возникновения рака и частотой хромосомных аберраций [4, 5]. Самыми частыми хромосомными аномалиями, характерными для гемобластозов и для ряда солидных опухолей, являются транслокации и делетированные хромосомы [2]. Поэтому дети, облученные в период аварии на стадии I гестационного периода, могут быть отнесены к группе повышенного канцерогенного риска.
Литература
1. Турусов В.С. Канцерогенез. - М.: Научный мир, 2000. - С. 251-259.
2. Флейшман Е.В. Канцерогенез. - М.: Научный мир, 2000. - С. 342-360.
3. Doll R., Wakeford R. Risk of childhood cancer from fetal irradiation. Review article //British Journal of Radiology. - 1997. - V. 70. - P.130-139.
4. Hagmar L., Bonassi S., Stromberg U. et al. Chromosomal aberrations in lymphocytes predict human cancer: a report from the European study Group on Cytogenetic Biomarkers and Health (ESCH) //Cancer Res. -
1998. - V. 58. - P. 4117-4121.
5. Hagmar L., Brogger A., Hansteen J.L. et al. Cancer risk in human predicted by increased levels of chromosomal aberrations in lymphocytes: Nordic study group on the health risk of chromosome damage //Cancer Res. - 1994. - V. 54. - P. 2919-2922.
6. Miller R.W. Effects of prenatal exposure to ionising radiation //Health Physics. - 1990. - V. 59, N 1. - P. 5761.
7. Mole R.H. Antenatal irradiation and childhood cancer: causation or coincidence? //British Journal of Cancer. - 1974. - V. 30. - P. 199-208.
8. Mole R.H. Childhood cancer after prenatal exposure to diagnostic X-ray examinations in Britain //British Journal of Cancer. - 1990. - V. 62. - P. 152-168.
9. Nakano M., Kodama Y., Ohtaki K. et al. Detection of stable chromosome aberration by FISH in A-bomb survivors: comparison with previous solid Giemsa staining data on the same 230 individuals //Int. J. Radiat. Biol. - 2001. - V. 77, N 9. - P. 971 -977.
10. Rodvall Y., Pershagen G., Hrubec Z. et al. Prenatal X-ray exposure and childhood cancer in Swedish twins //Inter. Journal of Cancer. - 1990. - V. 46. - P.362-365.
11. Sorsa M., Wilbourn J., Vainio H. Mechanisms of carcinogenesis in Risk Identification. - Lyon: Inter. Agency for Research on Cancer, 1992. - P. 543-554.
12. Stewart A., Kneale G.W. Radiation dose effects in relation to obstetrics X-rays and childhood cancers //Lancet. - 1970. - June 6. - P. 1158-1188.
13. Wild C.P., Law G.R., Roman E. Molecular epidemiology and cancer: promising areas for future research in the post-genomic era //Mutat. Res. - 2002. - V. 499, N 1. - P. 3-12.
The comparative analysis of unstable and stable chromosomal aberrations in persons exposed in utero in the course of different prenatal periods as a result of Chernobyl accident
Mikhailova G.F.
Medical Radiological Research Centre, Obninsk
The group of children exposed in utero in the course of different prenatal periods as a result of Chernobyl accident was cytogenetically examined. All of them live in the radioactive contaminated territories. It was found that the frequency of chromosomal aberrations and the sum of dicentricas and centric rings (radiation markers) are exhibited for the 1st gestational period (0-8 weeks). All the children exposed in utero in the course of 1st prenatal periods have got a stable chromosomal aberrations.
