CC BY
181
6. Частота цитогенетических нарушений в лимфоцитах периферической крови у жителей Орловской области, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях после чернобыльской аварии
С увеличением времени после аварии на Чернобыльской АЭС на первый план выдвигается проблема оценки и прогноза отдаленных последствий радиационного воздействия и, в первую очередь, для популяций людей, проживающих на радиоактивно-загрязненных территориях. Как известно, существуют два основных негативных отдаленных эффекта облучения - генетический и канцерогенный. И в основе каждого из них лежат мутационные изменения, соответственно, в половых и соматических клетках организма. Поэтому исследование мутаций, в частности, структурных нарушений хромосом в соматических клетках популяций чернобыльского контингента позволяет, в первом приближении, выделять группы повышенного канцерогенного риска.
Научно обоснованная оценка и прогноз отдаленных последствий чернобыльской аварии невозможны без знания доз, полученных или получаемых населением, проживающим на загрязненных территориях. Следует отметить, что именно для населения наиболее сложно получить объективную информацию о дозовых нагрузках, вследствие специфичности сценария радиационного воздействия, которое включает в себя как внешнее низкоинтенсивное хроническое облучение от выпавших при аварии радионуклидов, главным образом, долгоживущего радиоизотопа 137Сэ, так и внутреннего облучения от инкорпорированных радионуклидов, включая радиоизотоп 1311. В результате очень трудно восстановить динамику накопления кумулятивной дозы. Тем не менее, в Российском государственном медико-дозиметрическом регистре (Обнинск) к настоящему времени проведены дозиметрические расчеты для населенных пунктов загрязненных областей России, включая и Орловскую область, на территории которой было выполнено настоящее цитогенетическое исследование.
Следует подчеркнуть особую важность применения цитогенетического метода в популяционных исследованиях. Во-первых, в плане оценки состояния окружающей среды. Как известно, культура лимфоцитов человека входит в число обязательных тест-систем при оценке влияния негативных факторов окружающей среды. Обнаружение у биологических объектов, включая человека, повышенного уровня цитогенетических нарушений свидетельствует о неблагоприятном, в мутагенном отношении, состоянии окружающей среды. И что особенно важно, как показали многочисленные радиационно-цитогенетические исследования, обнаружение в общем спектре аберраций их определенных типов позволяет вполне определенно идентифицировать тип мутагенного воздействия, т.е. является ли он радиационной или химической природы. Наличие в спектре наблюдаемых аберраций дицентриков и центрических колец вполне однозначно свидетельствуют о радиационной природе мутагена. Поэтому данный тип аберраций получил название аберраций-маркеров радиационного воздействия.
Повышенный же уровень аберраций хроматидного типа может свидетельствовать о химической природе мутагена, хотя и не так однозначно, как в случае с маркерными аберрациями радиации, поскольку повышенный уровень хроматидных аберраций может индуцироваться в организме и вирусной инфекцией, применением некоторых медикаментов и др.
Во-вторых, использование цитогенетического метода в популяционных исследованиях позволяет выявлять лиц с повышенным уровнем хромосомных аберраций, в особенности, долгоживущих стабильных аберраций. А, учитывая тесную взаимосвязь мутагенеза с канцерогенезом, это позволяет уже на ранних стадиях выделять группы повышенного канцерогенного риска.
Таким образом, основной целью настоящего исследования являлось проведение сравнительного анализа результатов цитогенетического обследования жителей загрязненных районов Орловской области с учетом уточненных среднерайонных кумулятивных доз внешнего облучения всего тела и средних дозовозрастных нагрузок на щитовидную железу от инкорпорированного радиоактивного йода [2], а также улиц с выявленной патологией щитовидной железы.
Материалы и методы
На цитогенетическое исследование были взяты 248 образцов крови у жителей, постоянно проживающих в четырех районах Орловской области. На момент аварии их возраст составлял 0-14 лет. С помощью УЗИ [1] у части из них были выявлены узловые новообразования в щитовидной железе. Были составлены группы, в которых каждому обследованному с наличием узлового заболевания были подобраны 1-2 человека нормы аналогичного возраста, пола и места жительства. Параллельно, в образцах крови этих же жителей исследовали частоту генных соматических мутаций, результаты которых представлены в предыдущем разделе.
Методика культивирования лимфоцитов крови и приготовление препаратов хромосом
Культивирование лимфоцитов
Кровь отбирали из локтевой вены здорового донора, помещали в стерильную пробирку, содержащую раствор гепарина (200 ЕД/мл крови). В стерильных условиях образцы крови переливали по 0,8 мл в приготовленные для культивирования флаконы Карреля с культуральной средой. Состав культуральной среды (6,16 мл среды МЕМ; 1,6 мл инактивированной телячьей сыворотки; 0,08 мл L-глютамина; 0,08 мл р-ра антибиотика; 0,15 мл фитогемагглютинина). Флаконы помещали в термостат при 37°С для инкубации клеток в течение 48 часов. Для блокирования митоза на стадии метафазы за 2 часа до окончания инкубации во флаконы добавляли раствор демеколцина в концентрации 0,2 мкг/мл среды.
Гипотонизация клеток
После окончания культивирования культуру клеток переливали в центрифужные пробирки и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 15 мин для осаждения клеток. Надосадочную
жидкость удаляли с помощью водоструйного насоса, добавляли, предварительно подогретый до 37°С, гипотонический раствор (0,75 М KCl) и ресуспендировали в нем осадок. Далее пробирки с культурой клеток выдерживали на водяной бане (37°С) 10-12 мин. По окончании гипотонизации вновь центрифугировали при тех же условиях с последующим удалением надосадочной жидкости.
Фиксация клеток
Для фиксации клеток осадок ресуспендировали в 1-1,5 мл свежеприготовленного фиксатора (смесь метилового спирта и ледяной уксусной кислоты в пропорции 3:1) на шейкере и доводили его объем до 10 мл. Смену фиксатора с последующим центрифугированием производили трижды.
Приготовление препаратов хромосом
Препараты готовили непосредственно после окончания фиксации. Суспензию клеток раскапывали на смоченные дистиллированной водой, предварительно охлажденные предметные стекла. После высыхания препараты гидролизовали в 5^ном растворе соляной кислоты в течение 10 мин.
Окраску препаратов хромосом проводили по методу Гимза.
Цитогенетический анализ проводили на световом микроскопе под иммерсией при увеличении 90х10. На каждую точку анализировали по 500 метафаз.
Стандартный метафазный метод учета аберраций хромосом
Анализировали все виды аберраций хромосом, распознаваемых без кариотипирования. Из аберраций хромосомного типа - ацентрические фрагменты (парные и точковые), центрические кольца и дицентрики. Это, так называемые, аберрации нестабильного типа. По современным представлениям дицентрики и центрические кольца являются аберрациями-маркерами радиационного воздействия. То есть, обнаружение в лимфоцитах периферической крови данного типа аберраций свидетельствует о воздействии на организм мутагенов радиационной природы.
Стандартный метод метафазного анализа, т.е. без кариотипирования, позволяет регистрировать и определенную часть, так называемых, стабильных аберраций. По последним данным [7] - примерно до 20% от их исходной величины. Это, так называемые, аномальные моно-центрики, являющиеся в подавляющем большинстве случаев результатом реципрокной транслокации. В нашем исследовании они также учитывались.
Из аберраций хроматидного типа учитывали ацентрическое фрагменты (одиночные и парные) и обменные аберрации (в целом).
Информационная значимость аберраций хромосом
Стандартный спектр аберраций хромосом включает следующие показатели с принятыми ниже обозначениями, приведенными в таблице 6.1.
Таблица 6.1. Определения показателей аберраций хромосом и принятые обозначения.
Показатель Символ
Число проанализированных клеток (метафаз) N
Число мультиаберрантных клеток M
Выявленное число аберрантных клеток AN
Виды хромосомных аберраций
Выявленное число фрагментов XI
Выявленное число дицентриков X2
Выявленное число центрических колец /3
Выявленное число аномальных моноцентриков X4
Виды хроматидных аберраций
Выявленное число делеций У1
Выявленное число изоделеций У2
Выявленное число обменов Уэ
Заключения и выводы о природе и причинах возникновения хромосомных нарушений могут быть сделаны на основе следующих вычисляемых величин.
1. Процент обследованных в группе, у которых в проанализированных клетках обнаружена хотя бы одна клетка (метафаза), содержащая один из видов хромосомных аберраций.
Р1 = 100 х (число лиц с аберрациями) / (число обследованных)
2. Процент обследованных в группе, у которых в проанализированных клетках обнаружена хотя бы одна клетка (метафаза), содержащая один из видов «радиационных маркеров», к которым относятся дицентрики и центрические кольца.
Р2 = 100 х (число лиц с «радиационными маркерами») / (число обследованных)
3. Индивидуальная и усредненная по группе обследованных частота выявленных хромосомных аберраций на 100 проанализированных клеток.
Е = 100 х(Х1 + Х2 + Х3) / N
4. Индивидуальная и усредненная по группе обследованных частота выявленных «радиационных маркеров» - аберраций на 100 проанализированных клеток.
Р2 = 100 х (Х2 + Х3) / N
5. Индивидуальное и усредненное по группе обследованных отношение выявленных хромосомных аберраций к выявленным хроматидным аберрациям при условии, что сумма последних больше нуля.
Ез = (Х1 + Х2 + Хз) / (У1 + У2 + Уз)
Величины Р1 и Е отражают суммарную нагруженность генома возможными видами хромосомных нарушений. Эти величины могут иметь существенную индивидуальную вариабельность и превышение их над спонтанным уровнем свидетельствует об общем «неблагополучии» генетического материала, возможно о некой нестабильности генома.
Следует отметить, что основной вид спонтанных хромосомных нарушений - это фрагменты, Х1, которые обычно составляют более 90% от общего числа аберраций. Кроме того, величина Е3 для спонтанных аберраций обычно близка к 0,5 в возрастной группе до 30 лет и уменьша-
ется с возрастом до 0,3 в группе около 60 лет. Причина этому - увеличение количества аберраций с возрастом за счет аберраций хроматидного типа.
Отклонения выявленных закономерностей от спонтанных интерпретируют как индуцированные аберрации. Поскольку для образования дицентриков и колец требуются локальные разрывы хромосом, которые являются следствием воздействия ионизирующей радиации, то повышенный выход аберраций данного типа интерпретируют как свидетельство радиационного воздействия, что позволяет рассматривать дицентрики и кольца в качестве «радиационных маркеров» - соответственно величины Р2 и F2.
Повышенный выход аберраций хроматидного типа соответственно интерпретируют как следствие воздействия генотоксического агента химической природы. К ним могут относиться загрязняющие вещества хлорорганической природы, нитрозоамины, бензолы и ряд других.
Особое значение имеет наличие выявленных мультиаберрантных клеток - M. Эти клетки представляют собой совокупность настолько значимых и существенных хромосомных нарушений, затрагивающих почти весь геном, что принятая классификация видов аберраций для них оказывается неприемлемой. Спонтанный уровень возникновения клеток данного типа исключительно мал, поэтому в группах обследованных до 100 человек при числе анализированных клеток до 500 очень редко удается обнаружить хотя бы одну мультиаберрантную клетку. Точная причина возникновения подобных клеток до сих пор является предметом научных дискуссий. Это может быть и экстремально большое локальное облучение как от инкорпорированной «горячей» частицы, так и воздействие определенного вида вируса. В любом случае практически полное разрушение генома, наблюдаемое в мультиаберрантной клетке, свидетельствует о существенном отклонении от нормы.
Результаты анализа структурных мутаций в соматических клетках жителей Орловской области
В таблицах 6.2-6.4 приведены усредненные по группам основные цитогенетические показатели обследованных жителей Орловской области. В таблице 6.2 цитогенетические показатели по районам и в целом по области сопоставлены со спонтанным уровнем из трех различных источников.
Контроль 1 [4] Севанькаев и др., 1995, - группа из 87 человек, проживавших в «чистых» населенных пунктах Гомельской (поселок Октябрь) и Брянской (Почепский район) областях. Контрольная группа была сформирована в 1990-1992 гг. [4]. Дети и подростки.
Контроль 2 [3] Севанькаев и др., 1974, - группа из 89 человек, проживавших преимущественно в г. Обнинске, возраст 20-29 лет (53 мужчин, 36 женщин). Контрольная группа была сформирована 1965-1972 гг.
Контроль 3 [5] Бочков и др., 2001, - группа из 289 человек, проживающих на чистых территориях. Результаты собраны за период 1971-1999 гг. по данным цитогенетического обследо-
вания в Институте медгенетики, Москва, АМН СССР. Статистически значимой зависимости от возраста не обнаружено.
Контроль 4 [6] Lloyd et al., 1987, - межлабораторное исследование результатов 12 западных цитогенетических лабораторий. За исключением одной из них - в качестве спонтанного уровня регистрировалось в среднем 1 «маркер» на 1000 метафаз. Здесь в таблицах приведены нулевые коэффициенты для дозиметрических калибровочных кривых, которые получены статистической оценкой совокупности данных различных лабораторий.
Перечисленные контрольные группы являются внешними по отношению к обследованной группе жителей Орловской области.
Таблица 6.2. Цитогенетические показатели группы из всех обследованных в Орловской области по отдельным районам.
Район Кол-во обслед. Доля лиц с хрмс. абер., Pi, % Доля лиц с маркер., Р2, % Частота хрмс. абер./100, Fi Частота маркеров/100, f2 Хрмс./хроматид. абер., F3
Болховский 34 79,4 52,9 0,47±0,07 0,19 ±0,04 1,56±0,28
Колпнянский 20 85,0 50,0 0,46±0,08 0,20±0,06 1,16±0,27
Урицкий 8 75,0 25,0 0,69±0,29 0,25±0,16 1,67±0,76
Всего 62 80,6 48,4 0,49±0,06 0,20±0,04 1,44±0,20
Контроль 1 87 46,0 10,3 0,27±0,04 0,024±0,008 0,66±0,29
Контроль 2 89 - - 0,30±0,055 0,0091 ±0,0006 0,63±0,21
Контроль 3 289 - - 0,75±0,07 0,064±0,018 -
Контроль 4 12 лаб. - - 0,35±0,10 0,05±0,02 -
Анализ результатов таблицы 6.2 показывает, что почти по всем приведенным цитогенетическим показателям у жителей обследованных районов Орловской области выявлено статистически значимое (р<0,05) превышение над спонтанным уровнем аберраций хромосом. Данный вывод не зависит от вида внешнего контроля. По показателям суммарных хромосомных аберраций превышение над спонтанным уровнем составляет до 2, а по «радиационным маркерам» -до 2-10 раз в зависимости от вида контроля. Одновременно наблюдается нехарактерное для данной возрастной группы отношение суммарных хромосомных аберраций к хроматидным. Таким образом, результаты таблицы 6.2 демонстрируют наличие в клетках обследованных людей существенной доли индуцированных аберраций хромосом, преимущественно хромосомного типа. Данный факт свидетельствует в пользу интерпретации избыточного числа аберраций как следствия воздействия ионизирующей радиации.
Статистический анализ данных таблицы 6.2 показывает отсутствие значимых различий в частоте наблюдаемых аберраций для жителей любых двух районов, а также любого из районов и всей области в целом. Однако на данном этапе трудно дать однозначную интерпретацию полученным фактам. Определенную ясность может внести окончательный цитогенетический анализ всей обследуемой группы (248 чел.).
В таблицах 6.3 и 6.4 сопоставлены показатели групп обследованных с выявленной патологий щитовидной железы и сформированной к ним внутригрупповой контрольной группы. Ана-
лиз результатов показывает, что статистически значимой разницы между этими группами как по районам, так и по области в целом, не обнаружено.
Таблица 6.3. Цитогенетические показатели группы из обследованных, у которых методом УЗИ выявлена патология щитовидной железы.
Район Кол-во обслед. Доля лиц с хрмс. абер., Рі, % Доля лиц с маркер., Рг, % Частота хрмс. абер./100, Рі Частота маркеров/100, Рг Хрмс./хроматид абер., Р3
Болховский 16 81,3 56,2 0,51 ±0, 11 0,20±0,06 1,55±0,47
Колпнянский 10 90,0 30,0 0,40±0,10 0,08±0,04 1,43±0,47
Урицкий 4 75,0 25,0 0,71±0,44 0,25±0,25 1,67±1,20
Всего 30 83,3 43,3 0,50±0,09 0,17±0,05 1,52±0,31
Контроль 1 87 46,0 10,3 0,27±0,04 0,024±0,008 0,66±0,29
Контроль 2 89 - - 0,30±0,055 0,0091 ±0,0006 0,63±0,21
Контроль 3 289 - - 0,75±0,07 0,064±0,018 -
Контроль 4 12 лаб. - - 0,35±0,10 0,05±0,02 -
Таблица 6.4. Цитогенетические показатели группы из обследованных, которые были выбраны в качестве саэе-контроля для лиц с выявленной патологией щитовидной железы.
Район Кол-во обслед. Доля лиц с хрмс. абер., Рі, % Доля лиц с маркер., Рг, % Частота хрмс. абер./100, Рі Частота маркеров/100, Рг Хрмс./хроматид. абер., Р3
Болховский 18 77,8 50,0 0,43±0,08 0,20±0,06 1,57±0,35
Колпнянский 10 80,0 70,0 0,51 ±0, 11 0,32±0,11 0,86±0,20
Урицкий 4 75,0 25,0 0,68±0,45 0,25±0,25 1,67±1,20
Всего 32 78,1 53,1 0,49±0,08 0,23±0,05 1,36±0,24
Контроль 1 87 46,0 10,3 0,27±0,04 0,024±0,008 0,66±0,29
Контроль 2 89 - - 0,30±0,055 0,0091 ±0,0006 0,63±0,21
Контроль 3 289 - - 0,75±0,07 0,064±0,018 -
Контроль 4 12 лаб. - - 0,35±0,10 0,05±0,02 -
Проанализирован показатель наличия аномальных моноцентриков (аналог долгоживущих транслокаций) в двух подгруппах. Результаты таковы.
Частота аномальных моноцентриков в группе обследованных с патологией щитовидной железы по всем районам составила (0,053±0,021) на 100 клеток.
Частота аномальных моноцентриков в группе обследованных с саэе-контролем (без патологии щитовидной железы) по всем районам составила (0,079±0,023) на 100 клеток.
Статистический анализ показывает, что с 95% вероятностью частоты аномальных моноцентриков в указанных группах не различаются.
Заключение
При анализе группы из 62 человек, проживающих в Болховском, Колпнянском и Урицком районах, обнаружено значимое (р<0,05) превышение частоты цитогенетических нарушений в лимфоцитах периферической крови по сравнению со спонтанными уровнями аберраций.
Не выявлено статистически значимых различий в частоте наблюдаемых аберраций для жителей отдельных районов.
Не выявлено статистически значимых различий в частоте аберраций между группами лиц с патологией щитовидной железы и без патологии как в целом по области, так и по отдельным районам.
Повышенный уровень хромосомных аберраций у жителей исследованных районов свидетельствует о мутагенном воздействии на организм факторов окружающей среды, а повышенный уровень маркерных аберраций (дицентриков и центрических колец) позволяет сделать заключение о радиационной природе мутагенного фактора.
Однако выборка (число обследованных лиц) еще недостаточна, чтобы делать какие-либо окончательные заключения, в особенности в плане различий между отдельными районами.
Литература
1. Паршин В.С. Ультразвуковая диагностика заболеваний щитовидной железы в Калужской области -15 лет после Чернобыля //Медико-психологические, радиоэкологические и социально-экономические аспекты ликвидации последствий аварии на ЧАЭС в Калужской области: Материалы научнопрактической конференции. Калуга, Обнинск. Вып. 3 /Под ред. В.А.Игнатова. - Калуга: Облиздат, 2001. - С. 166-169.
2. Власов О.К., Годько А.М., Шишканов Н.Г., Щукина Н.В. Реконструкция доз облучения населения Калужской области вследствие аварии на ЧАЭС по уточненным данным //Медико-психологические, радиоэкологические и социально-экономические аспекты ликвидации последствий аварии на ЧАЭС в Калужской области: Материалы научно-практической конференции. Калуга, Обнинск. Вып. 3 /Под ред. В.А.Игнатова. - Калуга: Облиздат, 2001. - С. 30-34.
3. Севанькаев А.В. и др. Частота спонтанных хромосомных аберраций в культуре лейкоцитов человека //Генетика. - 1974. - Т. X, № 6. - С. 114-119.
4. Севанькаев А.В. и др. Результаты цитогенетического обследования детей и подростков, проживающих в загрязненных радионуклидами районах Брянской области //Радиационная биология. Радиоэкология. - 1995. - Т. 35, № 5. - С. 607-611.
5. Бочков Н.П. и др. База данных для анализа количественных характеристик частоты хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов периферической крови человека //Генетика. - 2001. - Т. 37, № 4. -С. 549-557.
6. Lloyd D.C. et al. A collaborative exercise on cytogenetic dosimetry for simulated whole and partial body accidental irradiation //Mutation Research. - 1987. - V. 179. - P. 197-208.
7. Nakano M. et al. Detection of stable chromosome aberration by FISH in A-bomb survivors: comparison with
previous solid Giemsa staining data on the same 230 individuals //Int. J. Radiat. Biol. - 2001. - V. 77, N 9. -
P. 971-977.
