CC BY
812
Анализ хромосомных аберраций в клетках млекопитающих при воздействии различных видов ионизирующего излучения
Хвостунов И.К., Пятенко В.С., Шепель Н.Н., Коровчук О.Н., Голуб Е.В.,
Жиронкина А.С., Хвостунова Т.И., Лычагин А.А.
ФГБУ МРНЦ Минздрава России, Обнинск
В работе исследована частота радиационно-индуцированных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека и в клетках перевиваемой культуры китайского хомячка Chinese hamster ovary (CHO) в зависимости от дозы облучения. Аберрации анализировались в клетках первого митоза при облучении клеток in vitro гамма-квантами 60Co, протонами с энергией 73 МэВ и нейтронами с энергией 14 МэВ. Помимо аберраций была исследована выживаемость клеток китайского хомячка методом анализа колоний клеток при облучении гамма-квантами 60Co и нейтронами с энергией 14 МэВ. Зависимость частоты аберраций и выживаемости клеток от дозы была представлена при помощи соответствующих регрессионных коэффициентов, что позволило оценить величину относительной биологической эффективности исследованных излучений. Показано, что помимо практической биологической дозиметрии, знания закономерностей возникновения хромосомных повреждений в лимфоцитах крови человека могут быть полезны при анализе индивидуальной радиационной чувствительности клеток и хромосомной нестабильности генома человека.
Ключевые слова; хромосомные аберрации, лимфоциты, клетки китайского хомячка,
ОБЭ, ионизирующее излучение.
Введение
Анализ частоты радиационно-индуцированных аберраций хромосом в клетках млекопитающих при их облучении in vitro различными видами ионизирующих излучений играет важную роль в задачах исследования радиобиологических свойств клеток [2], при количественной оценке качества излучения на основе относительной биологической эффективности (ОБЭ), а также для биологической дозиметрии на основе цитогенетического теста [1]. Так, метод оценки поглощённой дозы по радиационным маркерам, возникающим в ядре клетки под действием радиации, имеет целью дополнить методы физической дозиметрии, когда последние неприменимы или требуют уточнения. Обычно это касается нештатного обращения с источниками излучений, аварийных ситуаций или подтверждения факта радиационного воздействия в прошлом. Таким методом является анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека, чему способствовал ряд существенных фундаментальных достижений в области радиобиологии клеток млекопитающих. В первую очередь к ним относится доказательство одинаковой радиационной чувствительности хромосом лимфоцитов человека in vitro и in vivo [9]. Кроме того, внедрению метода анализа хромосомных аберраций способствовали открытые в 60-е годы возможности получения метафазных препаратов и метод дифференциального («арлекино-вого») окрашивания хроматид, что позволило различать митотические деления, а также метод поперечного сегментного окрашивания (G-banding), что позволило идентифицировать все возможные типы аберраций хромосом, включая симметричные аберрации.
Хвостунов И.К.* - зав. лаб., д.б.н.; Пятенко В.С. - вед. научн. сотр., к.б.н.; Шепель Н.Н. - ст. научн. сотр., к.б.н.; Коровчук О.Н. - научн. сотр.; Голуб Е.В. - вед. научн. сотр., д.б.н.; Жиронкина А.С. - научн. сотр.; Хвостунова Т.И. - научн. сотр.; Лычагин А.А. - зав. лаб., к.ф.-м.н. ФГБУ МРНЦ Минздрава России.
'Контакты: 249036, Калужская обл., Обнинск, ул. Королева, 4. Тел.: (48439) 9-73-92; e-mail: 726727@mrrc.obninsk.ru.
В последние годы для целей биологической дозиметрии, в основном ретроспективной, широко применяется метод селективного окрашивания хромосом, основанный на их гибридизации in situ при помощи ДНК-проб, специфичных к отдельным хромосомам - FISH-метод (fluorescence in situ hybridization). На его основе также был разработан уникальный способ окрашивания хромосом в виде поперечных многоцветных полос (mBand) [6], что позволяет абсолютно точно идентифицировать любые внутрихромосомные обмены, например, пери- и парацентрические инверсии. Такого рода хромосомные аберрации, а также сложные межхромосом-ные обмены, являются перспективными биологическими маркерами для плотноионизирующих излучений [5]. На практике наибольшее распространение получили методы биологической дозиметрии, основанные на анализе аберраций хромосом обменного типа - дицентриков и симметричных транслокаций. При этом методической основой соотношения частоты наблюдаемых аберраций и поглощённой дозы для цели калибровки являются соответствующие зависимости, полученные in vitro [4, 7, 11]. Основой всех перечисленных выше задач являются дозовые зависимости частоты хромосомных аберраций, полученные в контролируемых лабораторных условиях на различных типах клеток млекопитающих. В настоящей работе такие исследования выполнены на лимфоцитах крови человека и двух линиях перевиваемой культуры клеток китайского хомячка.
Материалы и методы
В настоящей работе для оценки радиобиологических свойств клеток млекопитающих использовали лимфоциты периферической крови человека и клетки двух линий перевиваемой культуры клеток китайского хомячка Chinese hamster ovary (Панэко). Радиационное воздействие на клетки млекопитающих реализовывалось с помощью стандартного облучения гамма-квантами 60Co, а также пучком нейтронов с энергией 14 МэВ [10] и пучком протонов ускорителя И-100 с энергией 73 МэВ [3].
Для гамма-облучения 60Co применялась медицинская установка «Луч» при высокой мощности дозы порядка 0,5 Гр/мин. Дозиметрическое обеспечение осуществлялось путём измерения мощности экспозиционной дозы ионизационной камерой VAK-253 с у-дозиметром 27012, а также при помощи термолюминесцентных дозиметров-«свидетелей» ТЛД-100 (Toledo). ТЛД-дозиметры представляли собой пластиковые цилиндры высотой 5 мм и диаметром 3 мм, заполненные радиационно-чувствительным порошком на основе LiF, которые крепились на облучаемые флаконы с клетками.
Облучение клеток протонами с энергией 73 МэВ осуществлялось на ускорителе И-100 (Протвино). При облучении биологических объектов использовали два режима с мощностью дозы: ~ 0,14 Гр/импульс (0,1 • 106 Гр/с) и ~ 5 Гр/импульс (0,8-106 Гр/с). Для определения полученной биологическим объектом дозы использовали следующие специально разработанные, изготовленные и откалиброванные детекторы: прецизионный токовый трансформатор (ИД-10), цилиндр Фарадея и термолюминесцентные детекторы [3].
Облучение клеток нейтронами с энергией 14 МэВ производилось при помощи портативного импульсного нейтронного генератора на запаянных трубках ИНГ-03 (МРНЦ) с мощностью дозы до 0,1 Гр/мин. Физико-дозиметрические расчёты характеристик нейтронной установки на
базе импульсного нейтронного генератора ИНГ-03 были получены с помощью программы MCNP-4B, и верифицированы путём экспериментального измерения потока нейтронов на различных расстояниях от коллиматора. Сборку из 5 флаконов с исследуемыми клетками размещали вплотную к коллиматору генератора. Поглощённые дозы в каждом из флаконов оценивали расчётным методом в зависимости от расстояния до коллиматора [10].
Анализ нестабильных аберраций в лимфоцитах крови человека производили стандартным методом [7]. Образцы крови четырёх доноров (2 мужчины и 2 женщины) в возрасте от 30 до 40 лет подвергались воздействию гамма-квантов 60Co в дозах от 0,035 Гр до 4,27 Гр. На каждую величину дозы нами проанализировано суммарно от 300 до 7999 метафаз. При исследовании воздействия нейтронов с энергией 14 МэВ образцы крови одного донора женского пола, 18 лет, облучали в дозах от 0,2 Гр до 2 Гр. На каждую величину дозы приходилось от 150 до 760 метафаз.
При анализе нестабильных аберраций культивировали цельную кровь (0,8 мл) во флаконах Карреля в культуральной питательной среде следующего состава: 6,16 мл среды RPMI-1640; 1,6 мл инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки; 0,08 мл L-глютамина;
0,08 мл раствора антибиотиков; 0,15 мл фитогемагглютинина. Инкубация культур клеток производилась в термостате при 37 оС в течение 48 ч. Для накопления метафаз за 2 ч до окончания инкубации во флаконы добавляли раствор демеколцина в концентрации 0,2 мкг/мл среды. Гипотонизацию, фиксацию клеток и приготовление препаратов хромосом производили согласно протоколу [7]. Окраску препаратов осуществляли красителем Гимза. При этом анализировали все виды аберраций хромосом, распознаваемых без кариотипирования.
Среди аберраций хромосомного типа учитывали парные ацентрики, (включающие фрагменты, относящиеся к классу терминальных делеций, и точки - интерстициальные делеции), центрические кольца и дицентрики. Эти виды аберраций относятся к классу нестабильных хромосомных аберраций. К дицентрику и центрическому кольцу относили по одному парному фрагменту или парные точки при отсутствии парных фрагментов. Точки и ацентрические кольца относятся к одному классу - интерстициальные делеции, и отличаются лишь размерами, поэтому при анализе данных их объединяли в один класс - точки. Стандартный метод метафаз-ного анализа (без кариотипирования) позволяет регистрировать и определенную часть, до 20% от их общего числа, стабильных аберраций в виде аномальных моноцентриков, являющихся в подавляющем числе случаев следствием симметричных (реципроктных) транслокаций.
Из аберраций хроматидного типа учитывали одиночные фрагменты, симметричные и асимметричные обмены. Последние при анализе объединяли в один класс - хроматидные обмены. Критерием отличия хроматидного фрагмента от пробела (gap) являлось смещение положения фрагмента относительно оси или длины хроматид.
Анализ стабильных аберраций в лимфоцитах крови человека производился методом селективной окраски хромосом (#2, #3, #8) - методом FISH. Образцы крови двух доноров мужского пола в возрасте 29 и 37 лет подвергались воздействию гамма-квантов 60Co в дозах от 0,25 Гр до 4,0 Гр. На каждую величину дозы было проанализировано суммарно от 580 до 3346 метафаз.
Культивирование клеток, приготовление препаратов и фиксацию выполняли по стандартной методике в соответствии с международными рекомендациями МАГАТЭ [7] с использовани-
ем фитогемаглютинина (PHA M-form, Gibco) и фиксацией на 48 ч после начала культивирования. Для анализа стабильных аберраций хромосом использовали FISH-метод. При окраске FISH-методом применяли гибридизацию in situ с использованием в качестве зондов биотинили-рованные ДНК-пробы, специфичные к отдельным хромосомам человека, которые составляли 19,5% всего генома. Для контрастного окрашивания оставшихся хромосом применяли DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole).
При анализе части генома методом FISH оценка ожидаемой частоты аберраций с участием всех хромосом производилась в рамках гипотезы об однородном распределении первичных повреждений по генетическому материалу клетки. В этом случае частота аберрации на весь геном составляла FG=FP/NGE, где FP - парциальная частота аберраций с участием только «окрашенных» хромосом, Nge - число геном-эквивалентных клеток (клеточный эквивалент-GE). Эти величины связаны между собой известным соотношением NGE=fg N; fg=2,05 fp (1 - fp), где fp - доля генома, N - число проанализированных метафаз. В настоящем исследовании fg=0,322 [12]. При анализе методом FISH учитывали простые транслокации: полные, которые классифицировали при наличии двух окрашенных обменных моноцентриков, и неполные - с наличием только одного окрашенного обменного моноцентрика в анализируемой метафазе. Дицентрики, центрические кольца и парные фрагменты классифицировались по общей схеме.
В работе использовали перевиваемую культуру клеток китайского хомячка Cricetulus griseus линий CHO и CHO-К (Панэко) в экспоненциальной фазе роста - через 1 сутки после посева и в стационарной стадии роста, выращенную во флаконах Карреля без смены питательной среды в течение 5 суток, когда клетки достигают конфлюэнтности. В настоящем исследовании число хромосом в клетках данной линии варьируется от 17 до 20, а модальное число хромосом равно 18. Доля спонтанных полиплоидных клеток не превышает 6%. Клетки получены из банка клеточных культур МГЦ РАМН (Москва) в 2006 и 2008 гг. соответственно.
Посев клеток производили в закрытые резиновыми пробками флаконы Карреля с площадью основания 25 см2, содержащие 10 мл среды. Клетки культивировали при температуре 37 оС в среде DMEM (Панэко) с добавлением сыворотки крупного рогатого скота (КРС) и антибиотиков (пенициллин и стрептомицин в концентрации 50 ед/мл и 50 мг/мл соответственно). Для анализа частоты хромосомных аберраций добавляли 10% сыворотки КРС (Панэко). Для блокирования митоза на стадии метафазы за 2 часа до окончания инкубации во флаконы добавляли раствор демеколцина в концентрации 0,2 мкг/мл среды. Клетки снимали со стекла раствором трипсина-ЭДТА (ПанЭко) в течение 3 мин. Культуру клеток в растворе трипсина-ЭДТА переливали в центрифужные пробирки и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 2 мин для осаждения клеток. Надосадочную жидкость удаляли, добавляли предварительно подогретый до 37 оС гипотонический раствор (0,75 М KCl) и ресуспендировали в нём осадок. Далее пробирки с культурой клеток выдерживали на водяной бане (37 оС) 6 мин. По окончании гипотонизации вновь центрифугировали при тех же условиях с последующим удалением надосадочной жидкости.
Для фиксации клеток осадок ресуспендировали в 3 мл свежеприготовленного фиксатора (смесь метилового спирта и ледяной уксусной кислоты в пропорции 3 : 1) на шейкере в течение 1 мин. Смену фиксатора с последующим центрифугированием производили трижды. Препара-
ты готовили непосредственно после окончания фиксации. Суспензию клеток капельно распределяли на смоченные дистиллированной водой, предварительно охлаждённые предметные стекла. После высыхания препараты гидролизовали в течение 10 мин в растворе соляной кислоты с концентрацией, равной 5 молярным долям (5 N). Окраска препаратов хромосом проводилась по методу Гимза. Цитогенетический анализ проводили на бинокулярном световом микроскопе CETI-N 101 B, SMT (Germany) под иммерсией при увеличении 100x10. Анализировали аберрации хромосомного типа (ацентрические фрагменты, центрические кольца и дицентрики) и хроматидного типа (делеции, изоделеции и обмены).
Выживаемость определялась стандартным методом подсчета макроколоний. Клетки культивировали в течение 12 суток в углекислотном инкубаторе MCO-5AC (производства фирмы Sanyo, Япония) при температуре 37 оС и 5% содержании CO2. Выжившими считались клетки, образующие колонии из 50 и более дочерних клеток. На каждую точку использовали не менее 3 флаконов Карреля.
Стандартные ошибки вычисляли для аберрантных клеток в предположении биномиального распределения, а для частоты аберраций - распределения Пуассона. В отдельных случаях ошибки оценивались по выборочным значениям. В качестве критерия значимости для проверки гипотезы о равенстве средних использовалась Z-статистика, без дополнительных предположений о дисперсиях исследуемых распределений. Наблюдаемые распределения аберраций по клеткам сравнивали с теоретически ожидаемым распределением Пуассона с помощью ^-критерия [8]. Для получения интервальных оценок при биодозиметрическом анализе был использован подход, основанный на учёте 95% доверительных интервалов как для индивидуальной ошибки единичного измерения, так и для зоны регрессии среднего хода регрессионной зависимости [7].
Результаты исследования и обсуждение
Для решения поставленных в работе задач были проведены экспериментальные лабораторные исследования частоты радиационно-индуцированных аберраций хромосом в лимфоцитах крови здоровых доноров и клетках перевиваемой культуры китайского хомячка при облучении образцов in vitro. В целом представленные в статье результаты были получены в период 2000-2013 гг. в лаборатории радиационной цитогенетики ФГБУ МРНЦ Минздрава России (Обнинск).
В таблице 1 приведены результаты анализа радиационно-индуцированных нестабильных аберраций в лимфоцитах крови человека при у-облучении 60Co в экспериментах in vitro. Результаты в диапазоне от 0 до 4,27 Гр включают цитогенетические данные, полученные от 1 до 4 доноров на величину каждой дозы.
В таблице 2 приведены результаты анализа радиационно-индуцированных нестабильных аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении образцов крови нейтронами с энергией 14 МэВ с помощью импульсного нейтронного генератора ИНГ-03.
Таблица 1
Число нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении образцов донорской крови у-квантами 60Со в зависимости от дозы облучения
(данные 2010-2012 гг.)
Доза, Гр Число метафаз Число абер- рантных клеток Число фраг- ментов Число центри- ческих колец Число дицен- триков Частота дицентриков /100 кле-to^SE Распределение дицентриков по клеткам u o?/y
0 1 1 hi 3 1 4 1 б
0 7799 17 16 0 1 0,013±0,013 7798 1 0 0 0 0 1,00 0,00
0,03б 2000 16 1б 0 1 0,0б±0,0б 1999 1 0 0 0 0 1,00 0,00
0,0б9 2000 16 11 0 6 0,30±0,12 1994 6 0 0 0 0 1,00 -0,09
0,089 2000 23 18 3 3 0,1б±0,09 1997 3 0 0 0 0 1,00 -0,04
0,114 2000 17 11 2 б 0,2б±0,11 199б б 0 0 0 0 1,00 -0,07
0,128 2000 21 13 0 8 0,40±0,14 1992 8 0 0 0 0 1,00 -0,12
0,246 2000 18 11 1 7 0,3б±0,13 1993 7 0 0 0 0 1,00 -0,10
0,294 1071 43 14 7 2б 2,33±0,47 1046 2б 0 0 0 0 0,98 -0,б3
0,б1 900 60 16 б 44 4,89±0,74 8б8 40 2 0 0 0 1,04 0,93
1,04 700 131 49 16 83 11,9±1,3 622 73 б 0 0 0 1,00 0,06
1,91 700 272 100 66 207 29,6±2,1 б17 164 16 2 0 1 1,01 0,28
2,14 600 309 106 60 2б7 42,8±2,7 376 193 29 2 0 0 0,8б -2,68
3,42 300 231 129 б4 246 82,0±б,3 120 121 б3 б 1 0 0,78 -2,64
4,27 600 бб1 362 282 812 13б,3±4,8 137 221 1б9 63 16 4 0,84 -2,77
Таблица 2
Число нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении образцов донорской крови нейтронами с энергией 14 МэВ в зависимости
от дозы облучения (данные 2009 г.)
Доза, Гр Число метафаз Число абер- рантных клеток Число фраг- ментов Число центри- ческих колец Число дицен- триков Частота дицентриков /100 кле-TOfctSE Распределение дицентриков по клеткам u o02/y
0 1 1 | 2 | 3 1 4 б
0 760 1 0 0 1 0,13±0,13 7б9 1 0 0 0 0 0,00 1,00
0,2 б00 48 2б 2 2б б,0±1,0 4б2 44 4 0 0 0 -0,78 0,9б
0,б 320 б3 38 2 24 7,б0±1,б3 269 41 7 3 0 0 1,23 1,10
1 2б0 102 б2 22 62 24,8±3,2 148 71 28 3 0 0 -0,93 0,92
2 1б0 101 46 22 90 60,0±6,3 49 б8 30 12 1 0 -1,11 0,87
В таблицах 1 и 2 приведены просуммированные по дозовым интервалам результаты для числа дицентриков в лимфоцитах крови человека в зависимости от поглощённой дозы. Для каждой дозы выполнен анализ распределения дицентриков по клеткам с оценкой его соответствия распределению Пуассона. В последних двух колонках приведена относительная дисперсия (d2/Y) и параметр u [8]. При u<1,95 распределение соответствует Пуассоновскому. В настоящей работе были исследованы по отдельности дозовые зависимости общей частоты нестабильных аберраций и частоты дицентриков с целью использования этих зависимостей в задачах биологической дозиметрии или индикации лучевого воздействия.
В таблице 3 приведены объединённые в дозовые группы результаты анализа стабильных аберраций в лимфоцитах крови человека при у-облучении 60Co in vitro. Дозовые группы в диапазоне от 0 до 5 Гр включают данные для образцов крови от двух доноров каждая - в таблице 3 они разделены сплошными горизонтальными линиями. Суммарные результаты по группе выделены жирным шрифтом. Здесь же представлены полные (tc) и неполные (ti) транслокации, а также терминальные делеции (ГО), проанализированные методом FISH. Результаты анализа
аберраций в образцах крови двух доноров суммированы для каждой дозы. В колонке «число метафаз» представлено общее число проанализированных метафаз и число клеточных эквивалентов в круглых скобках. Для каждой дозы рассчитаны соответствующие значения частоты аберраций на 100 клеток и ошибка среднего.
Таблица 3
Число стабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении образцов донорской крови у-квантами 60Co в зависимости от дозы облучения
(данные 2000 г., метод FISH)
Доза, Г р Донор № Число метафаз (Nge)* Полные транслокации Сумма всех транслокаций Терминальные делеции
0 1 2 всего 204б 1301 3346 (1101) 3 4 0,64±0,24** 4 4 0,73±0,26 3 1 0,36±0,18
0,2б 1 2 всего 2000 2000 (658) 3 0,46±0,26 12 1,82±0,53 6 0,91 ±0,37
0,б 1 2 всего 1000 338 1338 (440) 5 4 2,04±0,68 9 7 3,63±0,91 б 4 2,04±0,68
1,0 1 2 всего 1000 1000 (329) 16 4,86±1,22 23 6,99±1,46 12 3,65±1,05
2,0 1 2 всего 2б0 462 712 (234) 15 25 17,08±2,70 22 43 27,75±3,44 11 1б 11,10±2,18
3,0 1 2 всего 300 293 593 (195) 31 28 30,24±3,94 40 44 43,06±4,70 12 17 14,86±2,76
4,0 1 2 всего 393 187 580 (191) 49 38 45,59±4,89 65 51 60,79±5,64 16 12 14,67±2,77
* Nge - число проанализированных геном-эквивалентных метафаз; ** частота аберраций на 100 геном-эквивалентных метафаз.
Представленные в таблице 3 частоты стабильных аберраций были использованы для анализа соответствующих дозовых зависимостей наблюдаемых стабильных аберраций, а также радиационно-индуцированного компонента. Таким образом, были получены уравнения регрессии для важной в ретроспективной биологической дозиметрии зависимости суммы полных и неполных транслокаций от дозы, а также аналогичная зависимость для радиационно-индуцированных транслокаций.
В таблице 4 представлены результаты анализа нестабильных аберраций в клетках китайского хомячка линии CHO-K1 при их облучении в стационарной стадии роста у-квантами 60Co в экспериментах in vitro. Результаты по дозе в диапазоне от 0 до 6 Гр были получены при двух сроках фиксации клеток после облучения: через 19 и 24 ч после облучения. Исследования проводили параллельно экспериментам с облучением клеток на ускорителе И-100 (Протвино) для изучения относительной биологической эффективности протонов с энергией 73 МэВ [3].
Таблица 4
Число нестабильных хромосомных аберраций в клетках китайского хомячка линии CHO-K1 при облучении в стационарной стадии роста у-квантами 60^ в зависимости от дозы облучения при различных сроках фиксации (данные 2008-2009 гг.)
Цмґ'пп яйопп Хромосомные аберрации У нпматм nuuo
Доза, Гр Число метафаз Число аиерр. клеток* дицентрики центрич. кольца фрагменты хрома т идные аберрации
фиксация через 19 ч
0 б96 4 3 1 0 0
0,4 б97 11 9 0 2 б
0,б 200 4 4 0 0 1
0,8 396 18 13 2 3 б
1 200 9 б 1 3 1
1,6 394 б3 39 7 12 0
2 200 34 20 7 9 0
3 396 139 123 22 34 7
4 396 193 172 38 4б 13
б 200 119 131 31 18 8
е 496 393 б47 104 143 28
фиксация через 24 ч
0 б93 3 1 0 0 0
0,4 394 12 7 2 3 3
0,б 200 б б 0 0 0
0,8 39б 19 14 1 7 6
1 200 10 е 2 3 0
1,6 39б б8 42 12 8 3
2 200 23 21 2 б 0
3 492 1б0 128 24 38 12
4 39б 194 188 39 38 16
б 200 10б 116 22 17 7
е 390 334 424 92 206 39
* число клеток, содержащих аберрации хромосомного типа.
В таблице 5 представлены результаты анализа нестабильных аберраций в клетках китайского хомячка линии CHO-K1 при их облучении в стационарной стадии роста протонами с энергией 73 МэВ в экспериментах in vitro на ускорителе И-100 (Протвино). Результаты по дозе в диапазоне от 0 до 6,3 Гр были получены при аналогичных двух сроках фиксации клеток после облучения - через 19 ч и 24 ч. В работе были исследованы как дозовые зависимости общей частоты нестабильных аберраций, так и частоты дицентриков, необходимые для оценки относительной биологической эффективности протонов с энергией 73 МэВ при различных дозах облучения.
В таблице 6 представлены результаты анализа нестабильных аберраций в клетках китайского хомячка линии CHO-K1 при их облучении в экспоненциальной стадии роста у-квантами 60Co в экспериментах in vitro. Результаты по дозе в диапазоне от 0 до 4,5 Гр были получены при фиксации клеток после облучения на 24 ч. Исследования проводили параллельно экспериментам с облучением клеток на импульсном нейтронном генераторе ИНГ-03 (МРНЦ) для изучения относительной биологической эффективности нейтронов с энергией 14 МэВ.
В работе были исследованы по отдельности дозовые зависимости общей частоты нестабильных аберраций и частоты дицентриков с целью оценки относительной биологической эффективности нейтронов с энергией 14 МэВ при различных дозах облучения.
Таблица 5
Число нестабильных хромосомных аберраций в клетках китайского хомячка линии CHO-K1 при облучении в стационарной стадии роста протонами с энергией 73 МэВ в зависимости от дозы облучения при различных сроках фиксации (данные 2008-2009 гг.)
Цмґ'пп яйопп Хромосомные аберрации У нпматм пиио
Доза, Гр Число метафаз число аберр. клеток* дицентрики центрич. кольца фрагменты хрома іидные аберрации
фиксация через 19 ч
0 597 4 3 0 1 0
0,32 396 22 13 3 6 2
0,56 200 8 6 2 0 3
0,7 391 31 18 9 7 5
1,13 200 15 11 2 2 5
1,61 396 89 69 12 23 4
2,24 200 59 49 9 10 7
3 200 90 79 22 13 5
3,08 198 105 112 22 37 4
3,84 200 90 81 20 30 7
4 195 142 166 35 48 13
4,87 200 132 161 33 23 6
5,92 493 391 557 84 122 27
6,3 300 248 353 76 64 17
фиксация через 24 ч
0 596 5 4 1 0 2
0,32 394 18 15 0 3 2
0,56 200 13 11 1 1 0
0,7 394 36 28 6 5 6
1,13 200 21 16 4 3 7
1,61 396 117 101 19 18 4
2,24 200 39 28 12 13 5
3 200 69 55 19 13 7
3,08 194 115 118 14 35 14
3,84 200 107 90 28 34 4
4 195 135 134 33 64 9
4,87 200 128 139 34 43 11
5,92 247 217 345 70 106 17
* число клеток, содержащих аберрации хромосомного типа.
Таблица 6
Число нестабильных хромосомных аберраций в клетках китайского хомячка линии CHO-K1 при облучении в экспоненциальной стадии роста у-квантами 60^ и нейтронами с энергией 14 МэВ в зависимости от дозы облучения при фиксации на 24 ч
(данные 2012-2013 гг.)
Доза, Гр Число метафаз Число аберр. клеток* Хромосомные аберрации Хроматидные аберрации
дицентрики центрич. кольца фрагменты
7-кванты 60Со
0 298 3 2 0 1 0
1 100 7 6 1 2 3
2 100 20 16 1 4 2
2,2 50 24 17 3 8 6
3 100 25 23 1 4 1
4 100 36 30 2 6 4
4,5 50 28 29 5 12 6
нейтроны 14 МэВ
0 298 3 2 0 1 0
2,2 95 62 50 5 26 19
4,5 54 53 75 4 31 11
* число клеток, содержащих аберрации хромосомного типа.
В таблице 7 представлены результаты оценки выживаемости клеток китайского хомячка линии CHO при их облучении в стационарной стадии роста у-квантами 60Co в экспериментах in vitro. Также в данной таблице представлены оценки выживаемости клеток китайского хомячка линии CHO-K1 при их облучении в экспоненциальной стадии роста у-квантами 60Co и нейтронами с энергий 14 МэВ. В работе были исследованы дозовые зависимости выживаемости клеток китайского хомячка линии CHO-K1 с целью оценки относительной биологической эффективности нейтронов с энергией 14 МэВ.
Таблица 7
Оценка выживаемости клеток китайского хомячка при облучении линии CHO в стационарной стадии роста (S-фаза) у-квантами 60Co (данные 2006 г.) и линии CHO-K1 в экспоненциальной стадии роста (L-фаза) у-квантами 60Co и нейтронами с энергий 14 МэВ (данные 2012-2013 гг.) в зависимости от дозы облучения
Доза, Г р Число высеянных клеток Число выживших клеток (повторности) Величина выживаемости, (%) ±SE
CHO, S-фаза, Y-кванты 60Co, 2006 г.
500 153 145 140
500 132 12В 145
0 500 170 147 145 100
500 131 125 122
1000 240 269 235
1000 200 19В 255
1 1000 233 194 192 7В,3±1,1
1000 204 213 203
1500 236 262 253
1500 214 211 202
2 1500 302 245 262 56,0±1,0
1500 210 206 225
2000 20В 237 2В0
2000 174 150 -
4 2000 2В7 227 - 3В,2±1,1
2000 195 19В 1В5
CHO-K1, L-фаза, Y-кванты 60Co, 2012-2013 гг.
0 300 1В0 210 100
1 600 322 3В7 90,9±В,9
2 1200 365 3В3 47,9±7,1
2,2 500 232 62,7±7,1
3 1В00 276 2В7 24,1 ±7,1
4 2400 165 174 10,9±7,1
4,5 1000 252 34,1 ±7,1
CHO-K1, L-фаза, 14 МэВ нейтроны, 2012-2013 гг.
0 500 370 425 100
0,7В 500 252* 63,4±5,5
1,39 1000 260* 32,7±5,5
2,2 500 132* 33,2±5,5
2,95 1000 145* 1 В,2±5,5
4,5 1000 49* 6,2±5,5
* среднее число колоний по трём посевам.
В работе была исследована дозовая зависимость частоты стабильных аберраций в лимфоцитах крови человека при помощи стандартной линейно-квадратичной модели. Результаты оценки соответствующих регрессионных коэффициентов приведены в таблице 8. Коэффициенты
были оценены для полных наблюдаемых транслокаций, суммы полных и неполных транслокаций и частоты радиационно-индуцированных транслокаций. Последние оценивали путём вычитания из наблюдаемой частоты спонтанного уровня, равного свободному слагаемому «а». Известно, что частота спонтанных транслокаций существенно зависит от возраста человека, поэтому дозовая зависимость индуцированных транслокаций обладает свойством универсальности в задачах ретроспективной биодозиметрии. Приведенные в таблице 8 оценки выполнены с учётом экстраполяции частоты аберраций на полный геном по известной формуле Лукаса [12].
Таблица 8
Коэффициенты регрессионной дозовой зависимости частоты стабильных аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении т-квантами 60^
Тип аберраций Коэффициенты регрессии, (аберр./100кл/0Б)
а, ±ББ а, Гр-1 ±ББ в, Гр-2 ±ББ
Транслокации полные (наблюдаемые) Сумма транслокаций (наблюдаемые) Сумма транслокаций (индуцированные) 0,43±0,22 0,67±0,25 0,89±1,03 4,59±1,33 4,53±1,25 2,87±0,41 2,92±0,51 2,93±0,50
У=а+а-0+р02Т - (табл. 3).
В работе была исследована дозовая зависимость частоты нестабильных аберраций в лимфоцитах крови человека и в клетках китайского хомячка при помощи линейно-квадратичной модели следующего вида: У=а+а-О+рй2, где й - поглощённая доза, У - частота аберраций, а, а, Р - коэффициенты регрессии. Зависимость такого типа следует из гипотезы относительно механизма образования аберраций, которая состоит в том, что линейное слагаемое (а-О) описывает аберрации вследствие воздействия одного трека, тогда как квадратичное слагаемое (Р-й2) описывает аберрации вследствие одновременного воздействия двух треков. При этом два первичных повреждения, необходимые для образования дицентриков, могут являться следствием воздействия как одного, так и нескольких треков ионизирующих частиц. Ацентрические аберрации могут являться следствием как одного, так и множественных первичных повреждений хромосом. При этом при переходе к плотноионизирующим излучениям возрастает вероятность образования множественных первичных повреждений в одном треке, что сказывается на величине линейного слагаемого (а-О) в дозовой зависимости частоты аберраций.
В настоящем исследовании для оценки ОБЭ использовали показатели общей частоты хромосомных аберраций и частоты дицентриков (частота аберраций на 100 клеток) в соответствии со следующими формулами:
У у = а7 + а7й + Руй Ух = ах + ахй +гвхй ,
ОБЭ(й) й
Ох У)
где первая строка - дозовая зависимость частоты аберраций при облучении гамма-квантами 60Со; вторая строка - частота аберраций при воздействии тестируемого излучения; йх(Ут) - доза тестируемого излучения в форме решения второго уравнения при Ух=Ут
В рамках использованной линейно-квадратичной модели биологическая эффективность зависит от дозы, ОБЭ(й). При малых дозах, в пределе й ^ 0, ОБЭ возрастает и может быть оценена величиной отношения линейных коэффициентов тестируемой и стандартной зависимости, т.е. ОБЭ=а^ау, причём, при условии равенства свободных слагаемых (а^ау), эта оценка становится точной. Максимальная величина ОБЭ при й ^ 0 обычно используется в задачах оценки эффективности малых доз и радиационных рисков, тогда как для острого облучения следует рассматривать предел ОБЭ при больших дозах.
В работе были проанализированы дозовые зависимости частоты нестабильных аберраций в лимфоцитах крови человека и в клетках китайского хомячка в различных вариантах для нейтронов с энергией 14 МэВ и протонов с энергией 73 МэВ по отношению к у-квантам 60Со. Результаты приведены в таблицах 9 и 10. В указанных таблицах кроме регрессионных коэффициентов дозовых зависимостей приведено отношение линейного и квадратичного компонент, а/р. Это отношение имеет размерность дозы и характеризует величину поглощённой дозы, при которой уровни аберраций, производимые одним треком и двумя треками, примерно совпадают.
Оценка максимальных значений ОБЭМдх сделана по соотношению линейных регрессионных коэффициентов, а минимальные значения ОБЭМ|М выполнены по приведённым выше формулам для указанных в таблицах 9 и 10 значений доз.
Доза, Г р
Рис. 1. Частота хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении образцов донорской крови у-квантами 60Со и нейтронами с энергией 14 МэВ.
140- СНО-К1, L-фаза / Б
120- 60Со /
100- нейтроны 14 МэВ / /
80- / /
60- / /
40- /
1 1 1 00 2
0 1 2 3 4 5 6
Доза, Г р
Рис. 2. Частота дицентриков в клетках СНО-К1 в стационарной фазе (Б-фаза, панель А) и в фазе логарифмического роста (Ьфаза, панель Б) при облучении у-квантами 60Со, протонами с энергией 73 МэВ и нейтронами с энергией 14 МэВ.
На рисунках 1 и 2 приведены дозовые зависимости в соответствии с регрессионными коэффициентами, указанными в таблицах 9 и 10. Для сравнения дозовых зависимостей двух видов обменных аберраций: дицентриков и транслокаций, на рисунке 1 добавлена дозовая зависимость частоты транслокаций в соответствии с оценкой, взятой из таблицы 8.
Таблица 9
Коэффициенты регрессионной дозовой зависимости частоты нестабильных аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении у-квантами 60Со (табл. 1) и нейтронами с энергией 14 МэВ (табл. 2) с оценкой ОБЭ
Тип аберраций Коэффициенты регрессии (аберр./100 клеток) а/р, Гр Ї? 2 і о — ОБЭмш (0=2 Гр)
с±БЕ а, Гр-1±БЕ в, Г р-2±БЕ
7-кванты 0Со
Дицентрики 0,011 ±0,012 1,40±0,38 7,28±0,24 0,19 1,0 1,0
Хромосомные аберрации 0,255±0,050 4,05±0,68 12,3±0,4 0,33 1,0 1,0
нейтроны 14 МэВ
Дицентрики 0,14±0,13 15,6±3,2 7,2±2,6 2,2 11,4 1,6
Хромосомные аберрации 0,13±0,13 44,7±4,8 4,4±3,6 10,2 11,0 1,7
Таблица 10
Коэффициенты регрессионной дозовой зависимости частоты нестабильных аберраций в клетках китайского хомячка линии СНО-К1 при облучении 7-квантами 60Со (табл. 1), нейтронами с энергией 14 МэВ (табл. 2) и протонами с энергией 73 МэВ с оценкой,
соответствующей ОБЭ
Тип аберраций Коэффициенты регрессии (аберр./100 клеток) а/р, Гр ОБЭмах (Р^0) ОБЭм!и (0=2 Гр)
с±БЕ а, Гр-1±БЕ в, Г р-2±БЕ
7-кванты 60Со, Б-фаза, фиксация на 19 ч
дицентрики 0,60±0,27 0,48±0,72 2,81 ±0,18 0,17 1,0 1,0
хромосомные аберрации 0,67±0,31 1,27±0,87 3,98±0,22 0,32 1,0 1,0
протоны 73 МэВ, Б-фаза фиксация на 19 ч
дицентрики 0,45±0,28 5,38±0,88 2,28±0,19 2,4 7,0 1,05
хромосомные аберрации 0,59±0,32 9,17±1,06 2,90±0,23 3,2 7,2 1,04
7-кванты 60Со, Б-фаза, фиксация на 24 ч
дицентрики 0,21 ±0,17 1,47±0,70 2,52±0,19 0,58 1,0 1,0
хромосомные аберрации 0,24±0,17 1,66±0,85 3,95±0,24 0,42 1,0 1,0
протоны 73 МэВ, Б-фаза фиксация на 24 ч
дицентрики 0,91±0,32 4,79±1,06 2,47±0,28 1,9 3,3 1,10
хромосомные аберрации 1,00±0,36 7,46±1,27 3,97±0,34 1,9 4,5 1,13
7-кванты 60Со, 1_-фаза, фиксация на 24 ч
дицентрики 0,66±0,47 5,80±2,44 0,76±0,74 7,6 1,0 1,0
хромосомные аберрации 1,00±0,58 7,93±2,92 0,91±0,88 8,7 1,0 1,0
нейтроны 14 МэВ, 1_-фаза, фиксация на 24 ч
дицентрики 0,67±0,47 16,8 3,1 5,4 2,9 2,5
хромосомные аберрации 1,01±0,58 31,8 2,9 11,0 4,0 3,1
В работе была исследована дозовая зависимость выживаемости клеток китайского хомячка линии СНО-К1 при помощи модели следующего вида:
в(й) = 1 - (1 - ехр(-й))п , й0
где Эф) - доля выживших клеток, й - доза облучения, Гр, й0, Гр и п - параметры модели: й0 -доза инактивации, п - экстраполяционное число.
Таблица 11
Коэффициенты регрессионной дозовой зависимости выживаемости клеток китайского хомячка линии СНО-К1 при облучении 7-квантами 60Со и нейтронами с энергией 14 МэВ (табл. 7)
Вид облучения Регрессионные коэффициенты
йо, Гр, ±БЕ п ±БЕ
гамма-кванты 60Со, 1,60±0,61 2,5±1,6
нейтроны 14 МэВ 1,87±0,54 0,83±0,27
Результаты регрессионного анализа выживаемости китайского хомячка с параметрами приведенной выше модели показаны в таблице 11. На рисунке 3 приведены дозовые зависимости исследованной выживаемости в соответствии с регрессионными коэффициентами из таблицы 11.
Доза, Г р
Рис. 3. Выживаемость клеток CHO-K1 в фазе логарифмического роста (L-фаза) при облучении у-квантами 60Co и нейтронами с энергией 14 МэВ.
Заключение
В работе проведен анализ выживаемости и исследована частота радиационно-индуцированных аберраций хромосом в клетках млекопитающих при облучении их in vitro различными видами ионизирующих излучений. Полученные результаты позволили построить калибровочные зависимости для биологической дозиметрии на основе цитогенетического теста, уточнить радиобиологические свойства исследованных клеток, а также получить количественную оценку биологической эффективности протонов с энергией 73 МэВ и нейтронов с энергией 14 МэВ. Оценка минимальной / максимальной ОБЭ составила (1,05-3,1) / (2,9-7,2) и (1,6-
1,7) / (11,0-11,4) для протонов и нейтронов, соответственно. Доза инактивации для выживаемости клеток китайского хомячка линии CHO-K1 при облучении нейтронами составила 1,87 Гр, а при облучении гамма-квантами 1,6 Гр, при этом экстраполяционные числа существенно различались: 0,83 - для нейтронов и 2,5 - для гамма-квантов 60Co.
Исследования проведены при финансовой поддержке Российского гуманитарного научного фонда и Правительства Калужской области (проект № 12-16-40021 а(р)).
Литература
1. Елисова Т.В. Стабильные и нестабильные аберрации хромосом у человека и других млекопитающих в связи с вопросами биологической дозиметрии //Радиационная биология. Радиоэкология. 2008. Т. 48, № 1. С. 14-27.
2. Окада Ш. Радиационная биохимия клетки /Пер. с англ. М.: Мир, 1974. 407 с.
3. Ульяненко С.Е., Лычагин А.А., Корякин С.Н., Хвостунов И.К. и др. Радиобиологические оценки импульсного протонного излучения ускорителя И-100 //Медицинская физика. 2009. Т. 44, № 4. С. 8-16.
4. Хвостунов И.К., Курсова Л.В., Шепель Н.Н. и др. Оценка целесообразности применения биологической дозиметрии на основе анализа хромосомных аберраций в лимфоцитах крови больных раком лёгкого при терапевтическом фракционированном у-облучении //Радиационная биология. Радиоэкология. 2012. Т. 52, № 5. С. 467-480.
5. Anderson R.M., Stevens D.L., Goodhead D.T. M-FISH analysis shows that complex chromosome aberrations induced by a-particle tracks are cumulative products of localized rearrangements //PNAS. 2002. V. 99, N 19. P. 12167-12172.
6. Chudoba I., Plesch A., Lorch T. et al. High resolution multicolor-banding: a new technique for refined FISH analysis of human chromosomes //Cytogenet. Cell Genet. 1999. V. 84, N 3-4. P. 156-160.
7. Cytogenetic analysis for radiation dose assessment: A Manual - (Technical Reports Series/IAEA; № 405) /International Atomic Energy Agency. Vienna: IAEA, 2001. 127 p.
8. Edwards A.A., Lloyd D.C., Purrott R.J. Radiation induced chromosome aberrations and the Poisson distribution //Radiat. Environm. Biophys. 1979. V. 16, N 2. P. 89-100.
9. Kligerman A.D., Halperin E.C., Erexson G.L. et al. A cytogenetic comparison of the responses of mouse and human peripheral blood lymphocytes to 60Co gamma radiation //Radiation Research. 1988. V. 115, N 2. P. 334-346.
10. Leuthold G., Brenner H. Critical analysis of the ICRU 60 Proposal for neutron radiation and a possible solution //Radiation Protection Dosimetry. 1994. V. 54, N 3/4. P. 217-220.
11. Lloyd D.C., Purrott R.J., Dolphin G.W. et al. The relationship between chromosome aberrations and low LET radiation dose to human lymphocytes //International Journal of Radiation Biology. 1975. V. 28, N 1. P. 75-90.
12. Lucas J.N., Awa A., Stranme T., Gray M., Littlefield G. Rapid translocation frequency analysis decades after exposure to ionizing radiation //International Journal of Radiation Biology. 1992. V. 62, N 1. P. 53-63.
Analysis of chromosome aberrations induced in mammalian cells after exposure to different types of ionizing radiation
Khvostunov I.K., Pyatenko V.S., Shepel N.N., Korovchuk O.N., Golub E.V.,
Zhironkina A.S., Khvostunova T.I., Lychagin A.A.
Medical Radiological Research Center of the Russian Ministry of Health, Obninsk
Relationship between radiation doses and frequency of chromosome aberrations in irradiated human blood lymphocytes and Chinese hamster ovary (CHO) was investigated. Chromosome aberrations were analyzed in cells collected at first mitosis following exposure in vitro to y-rays of 60Co, accelerated 73 MeV protons and 14 MeV neutrons. After irradiation with y-rays of 60Co and 14 MeV neutrons survival of CHO cells was estimated by the colony formation assay. Regression coefficients of dose response curves and corresponding values of relative biological effectiveness were estimated by statistical analysis using obtained data in the form of chromosome aberration frequency and cell survival. Investigated regularities of chromosome aberrations induction in human blood lymphocytes can be used not only for cytogenetic bioldosimetry but also for estimation of individual radiation sensitivity of lymphocytes and investigation of radiation-induced chromosomal instability in humane genome.
Key words: chromosomal aberrations, lymphocytes, Chinese hamster ovary cells, RBE, ionizing radiation.
Khvostunov I.K.* - Head of Lab., D. Sc., Biol.; Pyatenko V.S. - Leading Researcher, C. Sc., Biol.; Shepel N.N. - Senior Researcher,
C. Sc., Biol.; Korovchuk O.N. - Researcher; Golub E.V. - Leading Researcher, D. Sc., Biol.; Zhironkina A.S. - Researcher; Khvostunova T.I. -
Researcher; Lychagin A.A. - Head of lab., C. Sc., Phys.-Math.
'Contacts: 4 Korolyov str., Obninsk, Kaluga region, Russia, 249036. Tel: (48439) 9-73-92; e-mail: 726727@mrrc.obninsk.ru.
