CC BY
32
УДК 615.244:616-0054
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕПАТ0ПР0ТЕКТ0РН0Г0 ДЕЙСТВИЯ 1-НОРВАЛИНА И АДЕМЕТИОНИНА ПРИ ИШЕМИЧЕСКИХ И РЕПЕРФУЗИОННЫХ ПОРАЖЕНИЯХ ПЕЧЕНИ
В ходе исследования было установлено, что Ь-норвалин в дозе 10 мг/кг обладает выраженным гепатопротекторным действием, в сравнении с адеметионином в дозе 400 мог/кг, что выражается в снижении активности аминотрансфераз, уменьшении экспрессии антиапоптотического маркера Вс1-2, а также площадей некроза и нейтрофильной инфильтрации в печени.
Ключевые слова: ишемия, реперфузия, печень, ингибитор аргиназ, Ь-норвалин, адеметионин.
з) Брянский патологоанатомический институт
e-mail: s_alehin@mail.ru
Заболевания печени занимают, по данным ВОЗ, четвертое место в общей заболеваемости. От ю до 40% всего взрослого населения страдают неалкогольной жировой болезнью печени, которая является, по мнению ряда авторов, причиной цирроза печени и гепатоцеллюлярного рака, что, как правило, диктует необходимость хирургического лечения. Хирургическая травма приводит к ишемическому повреждение ткани печени, добавляя к нему еще и реперфузионную травму, как следствие восстановления кровотока в сосудах органа [1, 9]. В связи с чем немаловажным является фармакологическая коррекция ишемических и реперфузионных повреждений, однако до настоящего момента данный вопрос остается открытым в связи с недостаточной изученностью одних агентов и умеренной либо малой эффективностью других.
Как при прекращении кровотока, так и при его восстановлении одной из основных мишеней является митохондрия [1, 4, 15, 18]. Образование активных форм кислорода, провоспалительных цитокинов, факторов активации апоптоза усиливает развивающееся митохондриальное повреждение, при этом во многом регуляция ишемического и реперфузионного повреждения зависит от уровня универсального мессенджера - оксида азота (N0), образующегося под действием индуцибельной и конституциональной ЫО-синтаз [5, 6, 7,13,17]-
В исследованиях было показано, что метаболизм Ь-аргинина протекает двумя путями: с участием ЫО-синтаз до цитрулина и участием аргиназ до орнитина и мочевины, при этом активность аргиназ значительно выше таковой ЫО-синтаз, что проявляется в субстратном ингибировании синтеза N0 [5, 6]. Таким образом, становится понятно, что изменение уровеня N0 - ключевой точки фармакологической коррекции, сказывается на выраженности как ишемического, так и реперфузионного поражения тканей.
Подавление активности аргиназ приводит к повышению уровня N0, таковой активностью обладает большое количество различных веществ [14], однако наименее изученным и при этом одним из самых активных является Ь-норвалин (2-аминопентановая кислота) - неметаболизирующийся аналог Ь-валина, что объясняется его структурным подобием орнитину по механизму обратной связи, угнетающему активность фермента [5, 4]. Ранее в нашей лаборатории изучалась активность Ь-норвалина в отношении коррекции 1.-ЫАМЕ индуцированного дефицита азота, а также его эдотелио- и кардиопротективные эффекты [о, з, 12].
Д.В. ЛОПАТИН1 С.Й. АЛЕХИН1 М.В.ПОКРОВСКИЙ2 П.М. НАЗАРЕНКО1 В.П.ТР0ШИН3 Д.И. колмыков1 Л.В. ИВАНОВА1
B.Д. ЛУЦЕНКО2
C.П. СПЕРАНСКИЙ2
1} Курский государственный медицинский университет
Белгородский государственный национальный исследовательский университет
В связи с вышеизложенным особый интерес приобретает исследование гепатопротекторной активности в сравнении с известными гепатопротекторами, в частности с адеметионином.
Материалы и методы. Эксперимент выполнен на 48 самцах крыс линии Wistar массой 180-220 г. Животные были распределены на группы следующим образом: группа интактных животных - А (п=12), группа с реперфузионным поражением печени после эпизода 15-минутной ишемии - В (п=12), группа с применением L-норвалина в дозировке ю мг/кг внутрибрюшинно при ишемии-реперфузии - С (п=12), группа с применением адеметионина в дозе 400 мг/кг внутрибрюшинно при ишемии-реперфузии - D (п=12).
Ишемию печени воспроизводили путем наложения латексного турникета на аналог печеночно-двенадцатиперстной связки у крыс на 15 минут. L-норвалин и адеметионин вводили животным за 30 мин. до моделирования ишемии и повторно по возобновлении кровотока. Манипуляции выполнялись под общим обезболиванием (хлоралгидрат в дозе 300 мг/кг внутрибрюшинно). Забор крови производился через 24 часа после проведения эксперимента. Для оценки выраженности гепатоцеллюлярного повреждения определялась активность аспартатаминотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) кинетическим фотоколориметрическим способом на автоматическом биохимическом анализаторе «Виталаб Флексор Е» (Нидерланды) с использованием реагентов фирмы «Biocon» и «Human» (Германия). Для проведения гистологического исследования печени забирали участки размером lxix 0,5 см в стандартных местах с последующим приготовлением гистологических микропрепаратов и окраской их гематоксилином и эозином по Ван Гизону, Мак Манусу и Паппенгейму.
На гистологических препаратах определяли большой и малый диаметр гепатоцитов и их ядер при помощи специальной установки «i.iVizo-103», вычисляли площадь поперечного сечения гепатоцитов, их ядер, цитоплазмы, ядерно-цитоплазматическое отношение гепатоцитов.
Результаты. Для определения сравнительной эффективности L-норвалина и адеметиона при влиянии на ишемический и реперфузионный синдром нами определена активность цитолитического синдрома. Активность ACT у животных, перенесших ишемию-реперфузию печени, превышала показатели контрольной группы в 1,93 раза и составила юо,о±1,8 Ед/л в группе А и I93,0±27,i(p<0,005) Ед/л в группе В. В то же время активность АЛТ у животных, перенесших ишемию-реперфузию печени, превышала показатели интактной группы в 3,2 раза - соответственно б2,1±з,8 Ед/л у интактных и 19б,8±2б,9 Ед/л (pso,os), что свидетельствует о выраженном повреждении печени. При применении L-норвалина в дозировке ю мг/кг внутрибрюшинно нами было отмечено снижение уровня активности ACT в 1,6 раза и АЛТ в 3,33 раза, применение же адеметионина в дозировке 400 мг/кг приводило к снижению активности ACT лишь в 1,1 раза, в то время как активность АЛТ падала в 2,7 раза по сравнению с группой В, что наглядно отображено в таблице.
Уменьшение активности трансаминаз, по нашему мнению, обусловлено уменьшением реперфузионного повреждения за счет нормализации кровотока в микроциркуляторном русле и регуляции сосудистого тонуса, к которому приводит угнетение аргиназы II, с последующим увеличением доступности L-аргинина и повышением концентрации N0, что благоприятно сказывается на функциональном статусе гепатоцита, в то время как адеметионин не оказывает существенного влияния на микроциркуляцию, исходя из механизма его действия.
Таблица
Результаты изучения влияния L-норвалина в дозировке ю мг/кг
и адеметионина в дозировке 400 мг/кг на активность печеночных транзаминаз
при ишемии-реперфузии печени
Группы животных Уровень ACT (Ед/л) Уровень АЛТ (Ед/л)
Интактные (группа А, 11=12) ioo,o±i,8 62,1±3,8
Ишемпя/реперфузия (группа В, 11=12) 193,о±27,1* 19б,8±2б,9*
Ь-норвалин в дозе 10 мг/кг (группа С, 11=12) 120,0±2,9" 59,3±2,5**
Адеметионин в дозе 400 мг/кг (группа Б, 11=12) 174,9± 6,5* 72,8±4,з"
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с интактными, ** - р<0,05 в сравнении с ишемией-реперфузией.
Стандартное морфологическое исследование выявило в группе В без
фармакокоррекции выраженные изменения ядер, проявляющиеся вакуолизацией, фрагментацией хроматина до полного исчезновения, с остатками хроматина по периферии
ядра, с кариолизисом и кариопикнозом, резкий отек цитоплазмы с резко выраженной
зернистой и жировой дистрофией, отек и резкое расширение пространств Диссе.
Отличительной чертой данной группы являются выраженные очаги субкапсулярных и перипортальных некрозов с регенераторными гипертрофическими гепатоцитами по периферии, средней площадью до 0,215±0,014 мм2. По ходу портальных трактов отмечается диффузная лимфо-лейкоцитарная инфильтрация с участками ступенчатых некрозов. Гликоген в гепатоцитах расположен диффузно, имеется не во всех клетках. При иммуногистохимическом исследовании в гепатоцитах выявлена сниженная по сравнению с контрольной группой локальная экспрессия Вс1-2.
Рис. 1. Морфологические изменения в печени различных групп: группа А интактная - структура ткани печени сохранена, дольки и портальные тракты четкие (А), группа Б - структура нарушена, видны очаги некрозов, жировой инфильтрации гепатоцитов (Б), группа С - умеренные очаги некрозов, отек пространств Диссе (В), группа Б - отек пространств Диссе, крутлоклеточная инфильтрация. Окраска гематоксилином и эозином. Микрофото. X 100.
Морфологические изменения в группе С, получавшей ю мг/кг L-норвалина, в целом значительно менее выражены, чем в группе В. Так, отмечается умеренный отек и расширение пространства Диссе, лейкоцитарная инфильтрация портальных трактов, что заметно на рисунке. Острые некрозы с лимфоцитарной инфильтрацией имели меньшую площадь, в среднем составлявшую од86±о,ои мм2. При иммуногистохимическом исследовании в гепатоцитах выявлена локальная экспрессия Вс1-2 от средней до умеренной степени выраженности.
Изменения в группе D хоть и носили менее выраженный характер, чем в контрольной группе, все же не достигали таковых в группе с применением L-норвалина в дозировке ю мг/кг. Площадь некрозов была больше и составила од9б±о,ои мм2. Отек как самих гепатоцитов, так и пространств Диссе также выражен в большей степени, чем в группе С. При иммуногистохимическом исследовании в гепатоцитах выявлена сниженная локальная экспрессия Вс1-2.
Результаты морфологического исследования в сочетании с данными иммуногистохимического исследования фактора апоптоза Вс1-2 свидетельствуют о явной гепатопротекторной активности L-норвалина ю мг/кг в отношении уменьшения повреждающего действия ишемии-реперфузии, причем активность L-норвалина выражена в большей степени, чем у адеметионина.
Морфометрические исследования больших и малых диаметров ядер гепатоцитов, ядерно-цитоплазматических взаимоотношений не выявили статистических различий между изучаемыми группами, что позволило сделать вывод о том, что данные изменения, на исследуемом сроке, не носят специфический характер.
Заключение. Полученные данные говорят о выраженной гепатопротекторной активности L-норвалина в дозе ю мг/кг при ишемической и реперфузионной травме печени, реализующейся, с одной стороны, через изменение энергетического и функционального состояния гепатоцитов и через уменьшение повреждения и повышение экспрессии факторов антиапоптоза - с другой, причем протекторное действие L-норвалина имеет большую выраженность, чем у адеметионина в дозе 400 мг/кг. Таким образом, подавление активности аргиназ при реперфузии печени оказывает положительное защитное действие, приводя к активации синтеза N0, который, в свою очередь, улучшает переносимость и ишемического и реперфузионного повреждения.
Литература
1. Вишневский, В.А. Операции на печени / В.АВишневский, ВА. Кубышкин, А.В. Чжао, Р.З. Икрамов. - М., 2003.- 155 с.
2. Цепелева, СА., Эндотелио- и кардиотропные эффекты L-норвалина в эксперименте / СА. Цепелева, А.С. Белоус, О.С. Гудырев и др. // Материалы 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность». - Курск, 2011. - 4.3. - С. 299 .
3. Цепелева, С А. Роль L-норвалина в коррекции L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота / С.А. Цепелева, М.В. Покровский, М.В. Корокин и др. // Материалы V конгресса «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология». - СПб. - Т. 1. - С. 294.
4. Bommarius, AS. Drauz Bommarius К. An enzymatic route to L-omithine from arginine — activation, selectivity, and stabilization of L-arginase / AS. Bomrn arius, K. Drauz Bommarius // Bioorganical and Medical Chemistry. - 1994. - Vol .2. - P. 617-626.
5. Chang, C.I. Arginase modulates nitric oxide production in activated macrophages / C.I. Chang, J.C. Liao, L. Kuo // Am J Physiol. Heart. Circ. Physiol. - 1998. - Vol. 274. - P. 342-348.
6. Chicoine, L.G. Arginase inhibition increases nitric oxide production in bovine pulmonary arterial endothelial cells / L.G. Chicoine, M.L. Paffet, T.L. Young et al. // Am J Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. - 2004. -Vol.287. - P- 60-68.
7. Jaeschke, H. Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning/ H. Jaeschke // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. - 2003. - P. G15-G26.
8. Jassem, W. The role of mitochondria in ischemia/reperfusion injury / W. Jassem, S.V. Fuggle, M. Rela et al. // Transplantation. - 2002. - Vol. 73. - P. 493-499.
9. Jia, C. Advances in the regulation of liver regeneration. Expert Rev / C. Jia // Gastroenterol Hepatol. - 2011. - Vol. 5(1). - P. 105-121.
10. Kin, H. Inhibition of myocardial apoptosis by postconditioning is associated with attenuation of oxidative stress-mediated nuclear factor-kappa В translocation and TNF alpha release / H. Kin, N.P. Wang, J. Mykytenko et al. // Shock. - 2008. - Vol. 29(6). - P. 761-768.
11. Lauzier, B. Beneficial effects of myocardial postconditioning are associated with reduced oxidative stress in a senescent mouse model / B. Lauzier, S. Delemasure, R. Debin et al. // Transplantation. - 2008. -Vol. 85(12). - P. 1802-1808.
12. Pokrovsky, M.V. Arginase Inhibitor in the Pharmacological Correction of Endothelial Dysfunction / M.V. Pokrovsky, M.V. Korokin, S.A. Tsepeleva et al. // International Journal of Hypertension. - 2011. -PMCID: PMC3124670.
13. Raat, N.J. Effects of nitrite on modulating ROS generation following ischemia and reperfusion / N.J. Raat, S. Shiva, M.T. Gladwin // Adv Drug Deliv Rev. - 2009. - Vol. 61(4). - P. 339-350.
14. Reid, K. Liver I/R injury is improved by the arginase inhibitor, N-omega-hydroxy-nor-l-arginine (nor-NOHA) / K. Reid et al. // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. - 2006. - Vol. 292. - P. G512-G517.
15. Sinay, L. Ischemic postconditioning reduces peroxide formation, cytokine expression and leukocyte activation in reperfusion injury after abdominal aortic surgery in rat model / L. Sinay, M. Kiirthy, S. Horvath et al. // Clin Hemorheol Microcirc. - 2008. - Vol. 40(2). - P. 133-142.
16. Yuan, G.J. Modulation of liver oxidant-antioxidant system by ischemic preconditioning during ischemia/reperfusion injury in rats / G.J. Yuan, J.C. Ma, Z.J. Gong et al. // World J Gastroenterol. - 2005. - Vol. 11.
- P. 1825-1828.
17. Zaouali, M.A. Hypoxia inducible factor-lalpha accumulation in steatotic liver preservation: role of nitric oxide / M.A. Zaouali, I. Ben Mosbah, E. Boncompagni et al. // World J Gastroenterol. - 2010. - Vol. 16(28).
- P- 3499-3509-
18. Zhou, G. Hypoxia-induced alveolar epithelial-mesenchymal transition requires mitochondrial ROS and hypoxia-inducible factor 1 / G. Zhou, L.A. Dada, M. Wu et al. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. - 2009.
- Vol. 297(6). - P. 1120-1130.
COMPARATIVE ANALYSIS OF l-NORVAIINE AND ADEMETIONINE HEPATOPROTECTIVE ACTION EFFICACY IN ISCHEMIC AND REPERFOSION INJURY OF LIVER
D.V. LOPATIN \ SA ALEHIN1 M.V. POKROVSKIY2 P.M. NAZARENKO1 V.P. TROSHIN3, D.I. KOLMIKOV1 L.V. IVANOVA1, V.R. LUTSENKO2 S.L. SPERANSKIY2
Kursk state medical university
s> Belgorod state national research university
3) Bryansk pathologic anatomy institute
During the research it was determined that L-norvaline at 10 mg/kg has a hepatoprotective effect in comparison with ademetionine at 400 mg/kg showing an aminotransferase action lowering, antiapoptotic marker Bcl-2 expression diminishing and liver necrotic areas and neutrophilic infiltration reduction.
Keywords: ischemia, reperfusion, liver, arginase inhibitor, L-norvaline, ademetionine.
e-mail: s_alehin@mail.ru
