CC BY
43
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Коллектив авторов, 2013 УДК 615.244:616-005.4
АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ РЕАЛИЗАЦИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ Ь-НОРВАЛИНА И ИШЕМИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ ПРИ ИШЕМИИ/РЕПЕРФУЗИИ ПЕЧЕНИ
М.В. Покровский1, С.А. Алехин2, Д.В. Лопатин2, Д.И. Колмыков2, Л.В. Иванова2,
В.Д. Луценко1, С.Л. Сперанский1, И.В. Сухотерин1
Институт последипломного медицинского образования НИУ «БелГУ», г. Белгород (1) Курский государственный медицинский университет, г. Курск (2)
В статье проведен фармакологический анализ механизмов действия и эффективности ишемического прекондиционирования и Ь-норвалина при ишемии/реперфузии печени в эксперименте. В ходе исследования была показана высокая эффективность ишемического прекондиционирования, которое полностью блокировалось применением глибенкламида. Ь-норвалин также оказывал выраженный гепатопротекторный эффект отменяемый глибенкланкламидом лишь частично.
Ключевые слова: ишемия, реперфузия, ишемическое прекондиционирование, печень, Ь-норвалин.
Ишемическое прекондиционирование (ИПК) показало себя как мощнейший протекторный механизм при таких патологических состояниях, как инфаркт миокарда, инсульт и многое другие [6, 8]. Изучение механизмов реализации данного защитного феномена привело к его разделению на раннее и позднее (или первое и второе окно) с несколько различными механизмами действия, а соответственно, и активаторами или триггерами [4, 5, 7]. Открытие триггеров стало первым этапом в направлении фармакологического моделирования действия ИПК. Так, триггером раннего прекондиционирования является аденозин, однако наиболее перспективным в отношении фармакологического моделирования является основной триггер второго окна - оксид азота (NO) [2, 3]. В настоящее время известен большой спектр различных веществ, действующих по механизмам данного триггера, наименее изученными из них являются ингибиторы аргиназ. Особый интерес приобретают исследования возможности использования ингибиторов аргиназ при абдо-
минальной хирургической патологии, в частности заболеваниях печени, где ишемическая травма, обусловленная самой патологией, усугубляется повреждающим действием ишемической и реперфузион-ной травмы, связанной с хирургическим вмешательством.
В связи, с чем целью настоящего исследования явился анализ механизмов реализации гепатопротекторного действия L-норвалина и ишемического прекондицио-нирования при ишемии/реперфузии печени.
Материалы и методы
Эксперимент выполнен на 72 самцах крыс линии Wistar массой 180-220 г. Все животные содержались в стандартных условиях вивария Курского государственного медицинского университета. Группу А (п=12) составили интактные животные, в группу B (п=12) вошли животные с ре-перфузионным поражением печени после эпизода 15-минутной ишемии, группу C (п=12) составили животные, которым с целью защиты тканей печени было применено прямое ишемическое прекондиционирование, в группе D (п=12) прово-
дилось исследование влияния прямого ишемического прекондиционирования на течение 30-минутной ишемии тонкого кишечника с последующей 30-минутной реперфузией на фоне введения блокатора К+-АТФазы глибенкламида в дозировке 5 мг/кг, в группе E (п=12) вводили L-норвалин в дозе 100 мг/кг, животным группы F (п=12) с целью анализа действия за 30 минут до L-норвалина вводился гли-бенкламид внутрибрюшинно в дозировке 5 мг/кг. Ишемическое прекондициониро-вание производили путем пережатия аналога печеночно-двенадцатиперстной связки у крыс на 10 минут с последующей 30минутной реперфузией до эпизода более глубокой (15-минутной) ишемии [1]. L-норвалин в дозе 10 мг/кг вводился животным внутрибрюшинно за 30 мин до моделирования ишемии и повторно в такой же дозировке по возобновлении кровотока.
Манипуляции выполнялись под общим обезболиванием (хлоралгидрат в дозе 300 мг/кг внутрибрюшинно). Забор крови производился через 24 часа после проведения эксперимента. Для оценки выраженности гепатоцеллюлярного повреждения определялась активность аспартатами-
нотрансферазы (АСТ) и аланинами-нотрансферазы (АЛТ) кинетическим фото-колориметрическим способом на автоматическом биохимическом анализаторе «Вита-лаб Флексор Е» (Нидерланды) с использованием реагентов фирмы “Biocon” и “Human” (Германия). Для проведения гистологического исследования печени забирали участки размером 1х1х0,5 см в стандартных местах c последующим приготовлением гистологических микропрепаратов и окраской их гематоксилином и эозином, по Ван-Г изону, Мак-Манусу и Паппенгейму.
Результаты и их обсуждение Исследования влияния ишемического прекондиционирования на функциональное состояние печени, а именно активность ферментов цитолиза (АСТ и АЛТ), выявили значительное повышение после эпизода ишемии/реперфузии уровня АСТ в 1,93 раза, а АЛТ в 3,16 раза. Применение прямого ишемического прекон-диционирования приводило к падению активности АСТ в 1,74 раза, а АЛТ в 3,14 раза. Эффект защитного действия ИПК полностью отменялся введением блокато-ра К+-АТФазы глибенкламида в дозе 5 мг/кг (табл. 1).
Tаблица1
Влияние ишемического прекондиционирования (ИПК) и L-норвалина на активность
Группы животных Уровень АСТ (Ед/л) Уровень АЛТ (Ед/л)
Интактные (группа А, п=12) 100,0±1,8 62,1±3,8
Ишемия/реперфузия (группа В, п=12) 193,0±27,1* 196,8±26,9*
Прямое ИПК (группа С, п=12) 110,45±2,9" 62,5±5,3**
Прямое ИПК+глибенкламид (группа D, п=12) ж ж 203,6±14,7 189,4±26,9**
L-норвалин 100 мг/кг (группа E, п=12) 113,9±9,4" 31,2±5,3**
L-норвалин + глибенкламид (группа F, п=12) 164,4±16,4** 119,7±23,8**
Примечание: * - p<0,05 - в сравнении с интактными, ** - p<0,05 - в сравнении с ишемией-реперфузией.
Введение L-норвалина в дозе 100 мг/кг приводило к снижению активности АСТ в 1,69 раза, а АЛТ в 6,3 раза. Применение же блокатора К+-АТФазы глибенк-ламида не приводило к полной отмене влияния L-норвалина, что отражалось на активности АСТ, которая была в 1,17 раза
меньше, чем при ишемии/реперфузии, и активности АЛТ, которая была ниже в 1,64 раза.
Ишемия/реперфузия в группе B приводила к выраженным морфологическим изменениям в печени, которые проявлялись изменениями ядер, характеризующимися
вакуолизацией, фрагментацией хроматина до полного исчезновения, с кариолизисом и кариопикнозом, резко выраженной зернистой и жировой дистрофией цитоплазмы, значительным отёком с резким расширением пространства Диссе. Характерной морфологической чертой данной группы являлись выраженные очаги субкапсулярных и перипортальных некрозов с регенераторными гипертрофическими гепатоцитами по периферии и очагами лимфо-лейкоцитарной инфильтрации. Площадь некрозов в среднем составила 0,215±0,014 мм2.
Применение блокатора К+-АТФазы глибенкламида за 30 минут до ИПК практически полностью снимало его защитный эффект, наиболее ярким показателем чего является суммарная площадь некрозов, которая в данной группе составила 0,207±0,021 мм2.
Морфологическая картина в группе c L-норвалином 100 мг/кг напоминают таковую в группе ИПК, с несколько меньшей выраженностью протекторного эффекта. Отмечаются микронекрозы суммарной площадью 0,161±0,017 мм2. Средне- и мелкокапельный характер дистрофии, явления кариолизиса. Отёк не выражен.
В группе глибенкламид + L-норвалин отмечается частичная отмена защитного эффекта, обусловленного введением L-норвалина в дозе 100 мг/кг. Очаги некроза площадью до 0,191±0,018 мм2 чередуются с зонами выраженной лимфо-лейкоцитарной инфильтрации с отеком стромы и пространств Диссе.
Отличительной морфологической чертой в группе с ишемическим прекон-диционированием стало значительное уменьшение как количества, так и площадей некрозов, а соответственно, и практически полное отсутствие отека и лимфолейкоцитарной инфильтрации. Так, суммарная площадь некрозов в группе С составила 0,082±0,014 мм2, что наглядно отображено в таблице 2. Большинство морфологических проявлений хоть и имели значительно меньшую выраженность, однако не достигали таковой в группе А.
Выводы
Ишемическое и реперфузионное повреждение обладает выраженным патологическим влиянием на морфофункциональное состояние печени, вызывая гибель паренхиматозных элементов и активацию ферментов цитолиза. Ишемическое прекондиционирование в значительной степени уменьшает выраженность печеночного повреждения, причем, протекторный эффект обусловлен активацией митохондриальных К+ATФаз. Применение L-норвалина в дозе 100 мг/кг позволяет фармакологически смоделировать эффект ишемического прекондиционирова-ния, однако выраженность защитного действия несколько ниже и до конца не может быть объяснена активацией митохондриальных К+ATФаз.
Литература
1. Прекондиционирование при ишемических и реперфузионных повреждениях
Tаблица 2
Влияние ишемического прекондиционирования (ИПК) и L-норвалина
на размеры очагов некроза печени крыс при ишемии/реперфузии___________
Группы животных Площадь (мм2)
Ишемия/реперфузия (группа В, п=12) ж 0,215±0,014
Прямое ИПК (группа С, п=12) ж ж 0,082±0,014
Прямое ИПК+глибенкламид (группа D, п=12) ж ж 0,207±0,021
L-норвалин 100 мг/кг (группа E, п=12) ж ж 0,161±0,017
L-норвалин + глибенкламид (группа F, п=12) ж ж 0,191±0,018
Примечание: * - p<0,05 - в сравнении с интактными, ** - p<0,05 - в сравнении с
ишемией-реперфузией
печени / Н.И. Жернакова [и др.] // Научные Ведомости БелГУ. - 2012. -№4(123). - С. 157-162.
2. Bolli R. Cardioprotective function of inducible nitric oxide synthase and role of nitric oxide in myocardial ischemia and preconditioning: an overview of a decade of research / R. Bolli // J. Mol. Cell. Cardiol. - 2001. - Vol. 33. -Р. 1897-1918.
3. Cohen, M.V. Adenosine: trigger and mediator of cardioprotection / M.V. Cohen, J.M. Downey // Basic. Res. Cardiol. -2008. - Vol. 103, № 3. - P. 203-215.
4. Downey J.M. Signaling pathways in ischemic preconditioning / J.M. Downey,
A.M. Davis, M.V. Cohen // Heart. Fail. Rev. - 2007. - Vol. 12. - P. 181-188.
5. Kirino T. Ischemic tolerance / T. Kirino // J. Cerebr. Blood. Flow. Metabol. - 2002. - Vol. 22. - P. 1283-1296.
6. Murry C.E. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium / C.E. Murry, R.B. Jennings, K.A. Reimer // Circulation. -1986. - Vol. 14. - P. 1124-1136.
7. Rezkalla S.H. Preconditioning in humans /
S.H. Rezkalla, R.A. Kloner // Heart. Fail. Rev. - 2007. - Vol. 12. - P. 201-206.
8. Upper limb ischemic preconditioning prevents recurrent stroke in intracranial arterial stenosis / Ran Meng [et al.] // Neurology. -2012. - Vol. 79. - P. 1853-1861.
L-NORVALIN AND ISCHEMICAL PRECONDITIONING ACTION MECHANISMS ANALYSIS
AT LIVER ISCHEMIA/REPERFUSION
M. V. Pokrovsky, D.V. Lopatin, S.A. Alehin, D.I. Kolmykov,
L. V. Ivanova, V.D. Lucenko, S.L. Speransky, I. V. Suhoterin
In this article ischemical preconditioning and L-norvalin efficacy and mechanisms of action pharmacological analysis at liver experimental ischemia/reperfusion were made. During investigation ischemical preconditioning high effectiveness totally wasn’t blocked by glibenclamide showed. L-norvaline also showed marked hepatoprotective effect abolished by glibenclamide just partly.
Key words: ischemia, reperfusion, ischemical preconditioning, liver, L-norvalin.
Покровский М.В. - д.м.н., проф., зав. кафедрой фармакологии и фармацевтических дисциплин Института последипломного медицинского образования НИУ «БелГУ», г. Белгород.
E-mail: mpokrovsky@yandex.ru.
Алехин С.А. - к.м.н., докторант кафедры хирургических болезней №2 ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, г. Курск.
Лопатин Д.В. - аспирант кафедры фармакологии ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, г. Курск.
Колмыков Д.И. - аспирант кафедры хирургических болезней №2 ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, г. Курск.
Иванова Л.В. - аспирант кафедры хирургических болезней №2 ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, г. Курск.
Луценко В.Д. - зав. кафедрой общей хирургии НИУ «БелГУ», г. Белгород.
Сперанский С.Л. - проф. кафедры общей хирургии НИУ «БелГУ» Минздравсоцразвития, г. Белгород.
Сухотерин И.В. - проф. кафедры общей хирургии НИУ «БелГУ», г. Белгород.
