CC BY
99
Д. В. ЛОПАТИН1, С. А. АЛЕХИН2, М. В. ПОКРОВСКИЙ3, П. М. НАЗАРЕНКО2, В. П. ТРОШИН4, Д. И. КОЛМЫКОВ2, Л. В. ИВАНОВА2, А. А ШАПОШНИКОВ3, Е. Т. ЖИЛЯКОВА3, В. Д. ЛУЦЕНКО, С. Л. СПЕРАНСКИЙ, В. Ф. КУЛИКОВСКИЙ, Н. В. ОЛЕЙНИК, И. В. СУХОТЕРИН
КОРРЕКЦИЯ ИШЕМИЧЕСКИХ И РЕПЕРФУЗИОННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ПЕЧЕНИ ПРИ ХИРУРГИЧЕСКИХ ВМЕШАТЕЛЬСТВАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ДИСТАНТНОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ L-НОРВАЛИНОМ
кафедра фармакологии Курского государственного медицинского университета,
Россия, 305000, г. Курск, ул. К. Маркса, 3;
2кафедра хирургических болезней № 2 Курского государственного медицинского университета,
Россия, 305000, г. Курск, ул. К. Маркса, 3;
3кафедра фармакологии и фармацевтических дисциплин Института последипломного медицинского образования НИУ «БелГУ»,
Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85;
4патолого-анатомический институт,
Россия, 241033, г. Брянск, пр. Станке Димитрова, 86, тел. 89103183551. E-mail: s_alehin@mail.ru
Заболевания печени являются одними из самых распространенных в мире, зачастую требующими хирургической коррекции, которая, в свою очередь, приводит к ишемической и реперфузионной травме печени. В статье нами показана эффективность применения ингибитора аргиназы L-норвалина при экспериментальном ишемическом и реперфузионном повреждениях печени. В ходе исследования было установлено, что L-норвалин обладает выраженным дозозависимым гепатопротекторным действием, что выражается в снижении активности аминотрансфераз, уменьшении отека пространств Диссе, уменьшении площадей некроза и нейтрофильной инфильтрации, а также уменьшении экспрессии антиапоптотического маркера Bcl-2.
Ключевые слова: ишемия, реперфузия, печень, ингибитор аргиназ, L-норвалин.
D. V. LOPATIN1, S. A. ALEHIN2, M. V. POKROVSKY1, P. M. NAZARENKO2, V. P. TROSHIN4,
D. I. KOLMIKOV2, L. V. IVANOVA2, A. A. SHAPOSHNIKOV3, E. T. ZHILJAKOVA3, V. D. LUTSENKO,
S. L. SPERANSKIY, V. F. KULIKOVSKIY, N. V. OLEYNIK, I. V. SUHOTERIN
CORRECTION OF ISCHEMIC AND REPERFUSION INJURY OF THE LIVER AT SURGICAL INTERVENTIONS WITH THE USE OF REMOTE PRECONDITIONING AND PHARMACOLOGICAL
PROTECTION WITH L-NORVALINE
1Department of pharmacology of Kursk state medical university,
Russia, 305000, Kursk, К. Marks str., 3;
2department of surgery № 2 of Kursk state medical university,
Russia, 305000, Kursk, К. Marks str., 3;
3department of pharmacology and pharmaceutical sciences of Institute of postgraduate medical education
(Belgorod state university),
Russia, 308015, Belgorod, Pobeda str., 85;
4Patalogoanatomy university,
Russia, 305000, Briansk, S. Dimitrova prosp., 86, tel. 89103183551. E-mail: s_alehin@mail.ru
Liver diseases are one of the most widespread pathologies in the world, frequently demanding surgical correction, leading by its tune to ischemia and reperfusion liver damage. In this article we showed the efficacy of L-arginase inhibitor L-norvaline usage in experimental ischemia and reperfusion liver damage. During research L-norvaline marked dose-dependent hepatoprotective effect was determined expressing in aminotransferase action lowering, Disse's spaces edema attenuation, necrosis area and neutrophilic infiltration reduction, and antiapoptotic marker Bcl-2 expression diminishing.
Key words: ischemia, reperfusion, liver, arginase inhibitor, L-norvaline.
По данным ВОЗ, каждый третий взрослый человек на Земле страдает тем или иным заболеванием печени. Заболеваемость патологией этого органа стабильно находится на 4-м месте в структуре общей заболеваемости, и с 1960 г. отмечается неуклонный рост числа
данных пациентов. В патогенезе большинства данных патологий далеко не на последнем место находится региональная или генерализованная ишемия, в одних случаях играющая инициирующую роль, в других усугубляющая течение патологии. Большой процент тяжелых
Кубанский научный медицинский вестник № 4 (133) 2012 УДК 615.244:616-005.4
Кубанский научный медицинский вестник № 4 (133) 2012
поражений печени требует хирургической коррекции, зачастую усугубляя тяжесть ишемического повреждения, что является причиной неблагоприятных исходов [1, 16].
В связи с этим непрерывно ведется поиск фармакологических агентов, способных уменьшить влияние как ишемического, так и реперфузионного повреждения.
Одной из ключевых мишеней при ишемии является митохондрия, повреждаемая как при прекращении кровотока в сосудах органа, так и при его восстановлении [7, 8, 15, 18]. Митохондриальное окислительное повреждение усиливается образованием активных форм кислорода, провоспалительных цитокинов, факторов активации апоптоза [9, 10]. Во многом регуляция как оксидативного стресса, так и функции различных систем, в том числе и регуляция кровообращения, принадлежит универсальному мессенджеру - оксиду азота NO, который образуется из L-аргинина под действием ферментов эндотелиальной и индуцибельной NO-синтаз [11, 13, 17].
Уровень NO является ключевой точкой фармакологической коррекции, его изменение сказывается на выраженности как ишемического, так и реперфузион-ного поражения тканей. Исследования последних лет показали, что метаболизм L-аргинина протекает двумя путями: с участием NO-синтаз до цитрулина и участием аргиназ до орнитина и мочевины [5, 6]. Другими словами, аргиназы и NO-синтазы конкурируют за один и тот же субстрат - L-аргинин, причем активность аргиназ значительно превосходит активность NO-синтазы, что приводит к субстратному ингибированию продукции оксида азота [5]. Угнетение активности аргиназ сказывается на повышении доступности L-аргинина для NO-синтаз. Ранее была показана in vitro активность целого ряда веществ, обладающих ингибирующей активностью в отношении аргиназ [14].
Одним из наименее изученных препаратов данной группы является L-норвалин (2-аминопентановая кислота) - неметаболизирующийся аналог L-валина, по данным ряда исследователей, являющийся одним из самых мощных ингибиторов аргиназы [5]. L-норвалин ингибирует активность аргиназы в связи с его структурным подобием орнитину по механизму обратной связи, угнетающему активность фермента [4]. Ранее в нашей лаборатории были показаны роль L-норвалина в коррекции L-NAME индуцированного дефицита азота, а также его эдотелио- и кардиопротективные эффекты [2, 3, 12].
В связи с вышеизложенным особый интерес приобретает исследование влияния данного препарата в возможной коррекции ишемического и реперфузионного поражения печени.
Материалы и методы исследования
Эксперимент проведен на 48 самцах крыс линии Wistar массой 180-220 г. Животные были распределены
на группы следующим образом: группа А - интактных животные (n=12), группа B - с реперфузионным поражением печени после эпизода 15-минутной ишемии (n=12), группа С - с применением L-норвалина в дозировке 10 мг/кг при ишемии-реперфузии (n=12), группа D - с применением L-норвалина в дозировке 100 мг/кг при ишемии-реперфузии (n=12). Ишемию печени воспроизводили путем наложения латексного турникета на аналог печеночно-двенадцатиперстной связки у крыс в течение 15 минут. L-норвалин в дозах 10 мг/кг и 100 мг/кг вводился животным внутрибрюшинно за 30 мин до моделирования ишемии и повторно в такой же дозировке по возобновлении кровотока. Манипуляции выполнялись под общим обезболиванием (хлоралгидрат в дозе 300 мг/кг внутрибрюшинно). Забор крови производился через 24 часа после проведения эксперимента. Для оценки выраженности гепатоцеллюлярного повреждения определялась активность аспартатамино-трансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) кинетическим фотоколориметрическим способом на автоматическом биохимическом анализаторе «Виталаб Флексор Е» (Нидерланды) с использованием реагентов фирмы «Biocon» и «Human» (Германия). Для проведения гистологического исследования печени забирали участки размером 1х1х0,5 см в стандартных местах с последующим приготовлением гистологических микропрепаратов и окраской их гематоксилином и эозином, по Ван Гизону, Мак Манусу и Паппенгейму. На гистологических препаратах определяли большой и малый диаметры гепатоцитов и их ядер при помощи специальной установки «pVizo-103», вычисляли площадь поперечного сечения гепатоцитов, их ядер, цитоплазмы, ядерноцитоплазматическое отношение гепатоцитов.
Результаты и обсуждение
С целью определения влияния L-норвалина на выраженность цитолитического синдрома нами определен уровень активности печеночных трансаминаз. Так, активность АСТ у животных, перенесших ишемию-реперфузию печени, превышала показатели контрольной группы в 1,93 раза - соответственно 100,0±1,8 Ед/л у интактных и 193,0±27,1 (p<0,005) Ед/л у животных после ишемии-реперфузии печени. Активность АЛТ у животных, перенесших ишемию-реперфузию печени, превышала показатели интактной группы в 3,2 раза -соответственно 62,1±3,8 Ед/л у интактных и 196,8±26,9 (р<0,05) Ед/л у животных после ишемии-реперфузии печени. Полученные данные свидетельствуют о выраженной активации цитолитического синдрома в ткани печени. Меньшие значения активности трансаминаз сыворотки крови наблюдались в группе с использованием L-норвалина в дозировке 10 мг/кг, они составили 120,0±2,9 Ед/л (АСТ) и 59,3±2,5 Ед/л (АЛТ). Увеличе-
Влияние L-норвалина в дозировках 10 мг/кг и 100 мг/кг на активность печеночных транзаминаз при ишемии-реперфузии печени (M±m)
Группы животных Уровень АСТ (Ед/л) Уровень АЛТ (Ед/л)
Интактные (группа А, n=12) 100,0±1,8 62,1±3,8
Ишемия/реперфузия (группа В, n=12) 193,0±27,1* 196,8±26,9*
L-норвалин, 10 мг/кг (группа С, n=12) 120,0±2,9** 59,3±2,5**
L-норвалин, 100 мг/кг (группа D, n=12) 113,9±9,4* 31,2±5,3**
Примечание: * - p<0,05 в сравнении с интактными животными, ** - p<0,05 в сравнении с ишемией-реперфузией.
ние же дозировки L-норвалина до 100 мг/кг приводило к уменьшению активности АСТ и АЛТ до уровня 113,9±9,4 Ед/л и 31,2±5,3 Ед/л соответственно, что наглядно отражено в таблице.
На наш взгляд, уменьшение активности трансаминаз связано с уменьшением реперфузионного повреждения за счет нормализации кровотока в микроциркуляторном русле и регуляции сосудистого тонуса, к которому приводит угнетение аргиназы II, с последующим увеличением доступности L-аргинина и повышением концентрации NO, что благоприятно сказывается на энергетическом и, как следствие, функциональном статусе гепатоцита.
В контрольной группе при морфологическом исследовании установлено: контуры гепатоцитов чёткие. Гипертрофия гепатоцитов не отмечается. Ядра
преимущественно ровные , овальные , с зернистым хроматином. На отдельных участках отмечается очаговое расширение пространства Диссе. В единичных гепатоцитах просматриваются гипертрофированные 1-2 ядрышка. Жировой инфильтрации, некрозов нет. Расширения центральных вен не отмечается. Гликоген диффузно присутствует в гепатоцитах в виде мелких зерен, распределен равномерно по всем долькам, что отчетливо видно на рисунке 1.
При иммуногистохимическом исследовании в гепатоцитах выявлена выраженная диффузная экспрессия Вс1-2, наглядно показанная на рисунке 2.
В группе животных, не получавших ингибитора аргиназы, выраженные изменения ядер характеризуются вакуолизацией, фрагментацией хроматина до полного
Рис. 1. Морфологические изменения в печени различных групп: группа А, интактная - структура ткани печени сохранена, дольки и портальные тракты четкие (А), группа Б - структура нарушена, видны очаги некрозов, жировой инфильтрации гепатоцитов (Б), группа С - умеренные очаги некрозов, отек пространств Диссе (В), группа й - микронекрозы, жировая инфильтрация гепатоцитов.
Окраска гематоксилином и эозином. Микрофото. Х100
Кубанский научный медицинский вестник № 4 (133) 2012
Кубанский научный медицинский вестник № 4 (133) 2012
Рис. 2. Распределение Вс1-2 при иммуногистохимическом исследовании: диффузное в группе В с ишемическим и реперфузионным поражением печени (А), локальное распределение умеренной степени выраженности в группе й с применением Ь-норвалина в дозировке 100 мг/кг (Б). Микрофото. Х100
исчезновения, с остатками хроматина по периферии ядра, с кариолизисом и кариопикнозом. В гепатоцитах отмечаются немногочисленные неизмененные ядрышки. Цитоплазма с резко выраженной зернистой и жировой дистрофией. Отмечается значительный отёк, характеризующийся резким расширением пространства Диссе. Выраженные очаги некроза с регенераторными гипертрофическими гепатоцитами по периферии и очагами лимфоцитарной и густой лейкоцитарной инфильтрации. Некрозы локализуются субкапсулярно и вокруг печеночных трактов. В среднем площадь некрозов составила 0,215±0,014 мм2. По ходу портальных трактов отмечается диффузная лимфолейкоцитарная инфильтрация с участками ступенчатых некрозов. Концентрация гликогена преимущественно по периферии долек.
Гликоген в гепатоцитах расположен диффузно, имеется не во всех клетках. При иммуногистохимиче-ском исследовании в гепатоцитах выявлена локальная экспрессия Вс1-2.
В группе, получавшей 10 мг/кг 1_-норвалина, отмечаются отёк, расширение пространства Диссе, лейкоцитарная инфильтрация портальных трактов, что заметно на рисунке 1. Выраженная вакуольная дистрофия -мелко- и среднезернистая. В ядрах хроматин конденсируется по периферии в виде кольца, ядра светлые. Острые некрозы с лимфоцитарной инфильтрацией. В среднем площадь некрозов составила 0,186±0,011 мм2. При иммуногистохимическом исследовании в ге-патоцитах выявлена локальная экспрессия Вс1-2 от средней до умеренной степени выраженности.
В группе с использованием 100 мг/кг препарата отмечаются микронекрозы суммарной площадью 0,161±0,017 мм2. Средне- и мелкокапельный характер дистрофии, явления кариолизиса. Отёка нет. При иммуногистохимическом исследовании в гепатоцитах выявлена умеренная локальная экспрессия Вс1-2, продемонстрированная на рисунке 2.
Результаты морфологического исследования в сочетании с данными иммуногистохимического исследования фактора апоптоза Вс1-2, на наш взгляд, свидетельствуют о выраженной гепатопротекторной активности 1_-норвалина, причем максимальную эф-
фективность показывающего в группе с применением в дозировке 100 мг/кг и реализующего свое действие за счет повышения экспрессии факторов антиапоптоза, в частности Вс1-2.
С целью количественного определения эффективности влияния 1_-норвалина на структурное состояние гепатоцитов при ишемическом и реперфузионном повреждении печеночной паренхимы нами были морфометрически измерены большой и малый диаметры гепа-тоцитов и их ядер, однако в ходе данного исследования не было выявлено достоверных отличий в группах, что говорит о неспецифичности изменений в размерах ядер и ядерно-цитоплазматического соотношения.
Полученные в ходе исследования данные свидетельствуют о выраженном протекторном влиянии 1_-норвалина при ишемической и реперфузионной травме печени, реализующемся, с одной стороны, через изменение энергетического и функционального состояния гепатоцитов и через уменьшение повреждения и повышение экспрессии факторов антиапоптоза - с другой, причем данное протекторное действие носит дозозависимый характер. Таким образом, можно сделать вывод о том, что подавление активности аргиназ при реперфузии печени оказывает положительное защитное действие путем активации синтеза N0, который, в свою очередь, являясь универсальным мессенджером, снижает повреждение печеночной паренхимы и, как следствие, улучшает переносимость и ишемического, и реперфузионного повреждения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вишневский В. А. Операции на печени / В. А. Вишневский, В. А. Кубышкин, А. В. Чжао, Р. З. Икрамов. - М., 2003.- 155 с.
2. Цепелева С. А., Белоус А. С., Гудырев О. С. и др. Эндо-телио- и кардиотропные эффекты Ьнорвалина в эксперименте // Материалы 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность». - Курск, 2011. - Ч. 3. - С. 299.
3. Цепелева С. А., Покровский М. В., Корокин М. В. и др. Роль Ьнорвалина в коррекции 1_^АМЕ-индуцированного дефицита оксида азота // Материалы V конгресса «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология». - СПб. - Т. 1. - С. 294.
4. Bommarius A. S., Drauz Bommarius K. An enzymatic route to L-ornithine from arginine - activation, selectivity, and stabilization of L-arginase // Bioorganical and medical chemistry. - 1994. - Vol. 2.-P. 617-626.
5. Chang C. I., Liao J. C., Kuo L. Arginase modulates nitric oxide production in activated macrophages // Am. j. physiol. heart. circ. physiol. - 1998. - Vol. 274. - P. 342-348.
6. Chicoine L. G., Paffet M. L., Young T. L et al. Arginase inhibition increases nitric oxide production in bovine pulmonary arterial endothelial cells // Am. j. physiol. lung. cell. mol. physiol. - 2004. - Vol. 287. - P. 60-68.
7. Jaeschke H. Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning // Am. j. physiol. gastrointest. liver. physiol. - 2003.- P. 15-26.
8. Jassem W., Fuggle S. V., Rela M. et al. The role of mitochondria in ischemia/reperfusion injury // Transplantation. - 2002. - Vol. 73. -P. 493-499.
9. Jia C. Advances in the regulation of liver regeneration. Expert Rev // Gastroenterol. hepatol. - 2011. - Vol. 5 (1). - P. 105-121.
10. Kin H., Wang N. P., Mykytenko J. et al. Inhibition of myocardial apoptosis by postconditioning is associated with attenuation of oxidative stress-mediated nuclear factor-kappa B translocation and TNF alpha release // Shock. - 2008. - Vol. 29 (6). - P. 761-768.
11. Lauzier B., Delemasure S., Debin R. et al. Beneficial effects of myocardial postconditioning are associated with reduced oxidative stress in a senescent mouse model // Transplantation. - 2008. -Vol. 85 (12). - P.1802-1808.
12. Pokrovsky M. V., Korokin M. V., Tsepeleva S. A. et al. Arginase Inhibitor in the pharmacological correction of endothelial dysfunction // International journal of hypertension. - 2011. - PMCID: PMC3124670.
13. Raat N. J., Shiva S., Gladwin M. T. Effects of nitrite on modulating ROS generation following ischemia and reperfusion // Adv drug. deliv. rev. - 2009. - Vol. 61 (4). - P. 339-350.
14. Reid K. et al. Liver I/R injury is improved by the arginase inhibitor, N-omega-hydroxy-nor-l-arginine (nor-NOHA) // Am j. physiol. gastrointest. liver. physiol. - 2006. - Vol. 292. - P. 512-517.
15. Sinay L., Kürthy M., Horvath S. et al. Ischemic postconditioning reduces peroxide formation, cytokine expression and leukocyte activation in reperfusion injury after abdominal aortic surgery in rat model // Clin. hemorheol. microcirc. - 2008. - Vol. 40 (2). - P. 133-142.
16. Yuan G. J., Ma J. C., Gong Z. J. et al. Modulation of liver oxidant-antioxidant system by ischemic preconditioning during ischemia/reperfusion injury in rats // World j. gastroenterol. - 2005. -Vol. 11. - P. 1825-1828.
17. Zaouali M. A., Ben Mosbah I., Boncompagni E. et al. Hypoxia inducible factor-1alpha accumulation in steatotic liver preservation: role of nitric oxide // World j. gastroenterol. - 2010. - Vol. 16 (28). P. 3499-3509.
18. Zhou G., Dada L. A., Wu M. et al. Hypoxia-induced alveolar epithelial-mesenchymal transition requires mitochondrial ROS and hypoxia-inducible factor 1 // Am. j. physiol. lung. cell. mol. physiol. -2009. - Vol. 297 (6). - P. 1120-1130.
Поступила 13.09.2012
К. Г. МИТЦИЕВ1, А. К. МИТЦИЕВ2, В. Б. БРИН12, О. Т. КАБИСОВ1
ВЛИЯНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПОКАЛЬЦИЕМИИ НА ГЕМОДИНАМИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ХРОНИЧЕСКОЙ СВИНЦОВОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
1Институт биомедицинских исследований ВНЦ РАН и РСО — Алания,
Россия, 362019, России, г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40, тел. (8672) 53-76-61. E-mail: digur1985@mail.ru;
2 кафедра нормальной физиологии ГБОУ ВПО СОГМА Минздравсоцразвития России,
Россия, 362019, г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40, тел. (8672) 53-76-61. E-mail: digur1985@mail.ru
Хроническая свинцовая интоксикация приводит к повышению среднего артериального давления, несмотря на снижение ударного и сердечного индексов. Формирующаяся гипертензивная реакция в условиях хронического отравления свинцом обусловлена увеличением удельного периферического сосудистого сопротивления. Токсическое влияние свинца на сердечно-сосудистую систему в условиях экспериментальной гипокальциемии приводит к более выраженным нарушениям сократительной способности миокарда и сопровождается повышением а-адренореактивности и увеличением активности ренин-ангиотензиновой системы.
Ключевые слова: сердечно-сосудистая система, гипокальциемия, ацетат свинца, гемодинамика.
К. G. MITTSIEV1, A. К. MITTSIEV2, V. B. BRIN12, O. T. KABISOV
EFFECT OF EXPERIMENTAL HYPOCALCEMIA ON HEMODYNAMIC EFFECTS OF CHRONIC LEAD INTOXICATION
1Institute for biomedical research, Vladikavkaz scientific centre and North Ossetia - Alania,
Russia, 362019, Vladikavkaz, str. Pushkinskaya, 40, tel. (8672) 53-76-61. E-mail: digur1985@mail.ru;
2 department of physiology SBEE HPE NOSMA health ministry of Russia,
Russia, 362019, Vladikavkaz, str. Pushkinskaya, 40, tel. (8672) 53-76-61. E-mail: digur1985@mail.ru
Chronic lead intoxication leads to increased mean arterial pressure despite the decline in stroke and cardiac index. Emerging hypertensive reaction in chronic lead poisoning caused by increase in the proportion of peripheral vascular resistance. The toxic
Кубанский научный медицинский вестник № 4 (133) 2012 УДК 615.9-616.61.001.6
