CC BY
111
DOI: 10.15690/опоо.у313.1597
Б.И. Круглый2, Е.Д. Никольская1, Е.С. Северин1, Г.Г. Барсегян1, Н.Г. Яббаров1, О.Г. Терещенко2, О.А. Жунина1, В.А. Зенин2, А.И. Тюляев3
Открытое акционерное общество «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения»,
Москва, Российская Федерация Общество с ограниченной ответственностью «Лаборатория инновационных научных исследований
в медицине», Москва, Российская Федерация Общество с ограниченной ответственностью «Адиком», Москва, Российская Федерация
Сравнительные исследования противоопухолевой активности и безопасности нового препарата белково-векторной доставки актиномицинового ряда на экспериментальных опухолевых
моделях у мышей
Актуальность. Исследованы острая токсичность и противоопухолевое действие нового препарата белко-во-векторной доставки. Действующим цитостатическим агентом является противоопухолевый антибиотик дактиномицин, инкапсулированный в полимерную PLGA-нанокапсулу, а белковым вектором — рекомбинант-ный альфа-фетопротеин. Целью исследования является сравнительное изучение токсичности и противоопухолевой активности нового препарата и прототипа на экспериментальных опухолевых моделях у мышей. Материалы и методы. Исследование эффективности препарата проводили на 90 самках беспородных мышей с асцитной моделью аденокарциномы Эрлиха и 140 мышей-самок йВА/2 с моделью лимфолейкоза Р388. Производилась токсикометрия с определением выживаемости мышей при введении возрастающих доз по Литчфилду-Уилкоксону. Противоопухолевое действие препаратов определялось путем расчета торможения роста опухоли и удлинения продолжительности жизни. Результаты. Препарат белково-векторной доставки обладает отчетливо меньшей токсичностью, при этом выявлен феномен значительного снижения ее у мышей с моделированной опухолью по сравнению со здоровыми животными. Показатель ЛД50 возрастал до 1,580 против 0,601 мг/кг для прототипа у здоровых животных. Такой феномен кардинально расширяет возможности для проведения лекарственной терапии новым препаратом с применением относительно более высоких разовых и курсовых доз, что приводит к повышению его клинической эффективности при существенном снижении частоты и выраженности побочных действий. Отмечается достоверно более высокий уровень (в 4,6 раз; р<0,0001) накопления 7-амино-дактиномицина (7-АД) в опухолевых клетках при включении его в наночастицы, конъюгированные с альфа-фетопротеином, по сравнению с 7-АД, инкапсулированным в нано-частицы и чистой субстанцией 7-АД при внутрибрюшинном введении мышам с асцитной карциномой Эрлиха. Отмечается существенное повышение противоопухолевого эффекта препарата белково-векторной доставки по сравнению с прототипом по критериям торможения роста опухоли, у чувствительной к дактиномицину модели в 1,48 раза, у резистентной модели — в 2,32 раза. По критерию увеличения продолжительности жизни — в 2,71 и 3,525 соответственно. Заключение. Использование препарата белково-векторной доставки актиномицинового ряда у мышей с моделированными опухолями приводит к значительному повышению противоопухолевой эффективности и безопасности по сравнению с прототипом.
Ключевые слова: белково-векторная доставка, дактиномицин, противоопухолевая активность, острая токсичность.
(Для цитирования: Круглый Б.И., Никольская Е.Д., Северин Е.С., Барсегян Г.Г. , Яббаров Н.Г., Терещенко О.Г., Жунина О.А., Зенин В.А., Тюляев А.И. Сравнительные исследования противоопухолевой активности и безопасности нового препарата белково-векторной доставки актиномицинового ряда на экспериментальных опухолевых моделях у мышей. Онкопедиатрия. 2016; 3(3): 188-199. Doi: 10.15690/опоо.у313.1597)
АКТУАЛЬНОСТЬ
Одной из основных сторон современной фармакологии является направленный транспорт лекарственных препаратов к специфическим локусам организма человека. Преимуществом «адресной»
доставки препарата к опухолевым клеткам-мишеням в сравнении с пассивной диффузией является снижение лекарственной нагрузки на организм пациента в виде уменьшения дозы препарата без потери ее эффективности.
Требования к макромолекулам препаратов
белково-векторной доставки
Принципиальным для данного подхода является создание химически или биологически сконструированных макромолекул, состоящих из векторной и неспецифической частей, содержащих противоопухолевый лекарственный препарат [1-3]. В качестве векторной части должны использоваться молекулы, обладающие специфическим сродством к рецепторам клеток-мишеней: например, моноклональные антитела, специфичные к тому или иному антигену на поверхности клетки-мишени [4]. Неизбежным недостатком иммуноконъ-югатов является возможность провоцирования иммунного ответа на сам препарат; быстрая приспособляемость опухолевых клеток, приводящая к изменчивости и модификации целевых тканеспе-цифичных антигенов. Кроме того, для достижения
клинического эффекта существует необходимость одновременного применения нескольких цитоста-тических препаратов с высокой токсичностью.
Существует другой класс биологических макромолекул, высокоспецифичных для опухолевых клеток, так называемые онкофетальные белки, которые не являются чужеродными для человеческого организма, и рецепторы к ним присутствуют преимущественно на опухолевых клетках. К этой группе белков относится альфа-фетопротеин (АФП) [5].
Дактиномицин
В настоящее время в клинической онкологии используется достаточно большое количество (более 60) химиопрепаратов антинеопластическо-го действия. В качестве цитостатического агента неспецифической части препарата белково-век-торной доставки нами был выбран противоопу-
B.I. Kruglyi2, E.D. Nikolskaya1, E.S. Severin1, G.G. Barsegyan1, N.G. Yabbarov1, O.G. Tereshchenko2, O.A. Zhunina1, V.A. Zenin2, A.I. Tyulyaev3
Russian Research Center of Molecular Diagnostics and Therapy, OJSC, Moscow, Russian Federation 2
The Laboratory of Innovative Studies in Medicine, LTD, Moscow, Russian Federation.
«Adicom», LTD, Moscow, Russian Federation
The Comparative Study of Antitumor Activity and Safety of the Novel Protein-targeted Actinomycin Drugs Delivery in Experimental Tumor Models of Mice
Introduction. The possible acute toxicity and antitumor activity of the novel protein-targeted delivery drug — «Afotid» — was investigated. The biodegradable PLGA nanoparticles were loaded by active cytostatic agent and then conjugated with AFP. Objective. Main research objectives are the precise determination of toxicity levels and study of anti-neoplasctic activity of the drug synthesized on ascites and solid in vivo tumor models. Materials and Methods. Ehrlich ascites carcinoma (EAC) model was developed in 90 out-bred female mice, and Lymphocytic leukemia P388 solid tumor model — in 140 female DBA/2 mice. The toxicometry with survival rate of mice was estimated by escalation the dosing according to JJ. Litchfield and F. Wilcoxon method. The antitumor activity was estimated by the indexes of tumor growth inhibition (TGI) and average lifespan (ALS). Results. The targeted drug delivery is significantly less toxic than the prototype. The phenomenon of substantial decrease of toxic effects in mice with tumor model equalized to healthy animals was detected. LD50 increased up to 1.580 mg/kg for dactinomycin vs 0.601 mg/kg for prototype in healthy mice. This is critically upscale potentialities for clinical use of protein-targeted drug delivery of «Afotid» in therapy with higher single and course doses which results in the significant increase of antitumor activity and decrease of toxic side effects. 7-aminoactinomycin D (7-AAD) loaded nanoparticles bearing AFP showed substantially higher accumulation (4.5 fold p<0.0001) in tumor cells after intraperitoneal injection to EAC mice compared to prototype compound. The antitumor effect of protein-targeted delivery drug in comparison with prototype is significantly higher. The effect based on TGI criteria for «Afotid» is 1.48 fold higher in dactinomycin-vulnerable lymphocytic leukemia P388 model and 2.32 fold higher for dactinomycin-resistant lymphocytic leukemia P388 model. According to ALS criteria, the increasing rates are 2.71 fold and 3.525 fold higher respectively. Conclusion. The novel protein-targeted drug delivery has significantly higher antitumor activity and lower toxicity as compared with the prototype. Keywords: protein-targeted delivery, dactinomycin, antitumor activity, acute toxity. (For citation: Kruglyi B.I., Nikolskaya E.D., Severin E.S., Barsegyan G.G., Yabbarov N.G., Tereshchenko O.G., Zhunina O.A., Zenin V.A., Tyulyaev A.I. The Comparative Study of Antitumor Activity and Safety of the Novel Protein-targeted Actinomycin Drugs Delivery in Experimental Tumor Models of Mice. Onkopediatria. 2016; 3(3): 188-199. Doi: 10.15690/onco.v3i3.1597)
189
холевый антибиотик актиномицин D (дактиномицин), который является как одним из наиболее эффективных, так и наиболее токсичным антине-опластическим средством [6-8]. Механизм цито-токсического действия актиномицинов и других антрациклиновых противоопухолевых антибиотиков обусловлен главным образом ингибирова-нием синтеза нуклеиновых кислот посредством интеркаляции между парами азотистых оснований, а также нарушением процесса вторичной спирализации ДНК за счет взаимодействия с макромолекулой топоизомеразы II [9]. Все это обусловливает высокую антимитотическую активность на фоне низкой избирательности действия. Многочисленные клинические исследования продемонстрировали эффективность дактиномици-на в терапии опухоли Вильмса и рабдомиосарко-мы, хориокарциномы и саркомы матки, саркомы Юинга, мягких тканей, злокачественных лимфом, герминогенных опухолей яичка и яичников, мела-нобластом, ангиосаркомы Капоши. В большинстве случаев для повышения эффективности лечения препарат используется в комбинации с другими цитостатическими средствами: наиболее часто с метотрексатом, винкристином, циклофосфаном, а также с лучевой терапией. За счет индивидуального подбора комбинации препаратов для химиотерапии удается повысить эффективность лечения злокачественных новообразований, для которых монокомпонентная терапия дактиномицином или другим цитостатическим препаратом ранее имела низкий показатель ремиссий [6, 7].
На текущий момент дактиномицин является орфанным препаратом, его широкое распространение ограничивается высокой токсичностью и малым терапевтическим диапазоном. С момента его открытия не прекращаются попытки снизить токсичность молекулы с помощью химических модификаций и разработки новых лекарственных форм. Снижение токсичности дактиномици-на путем повышения селективности его действия должно привести, во-первых, к быстрому выведению препарата из кровотока больного и накоплению его в опухолевой ткани, а во-вторых, — к существенному снижению эффективной дозы.
В промышленных масштабах дактиномицин получают биосинтетическим путем. Наличие штамма-продуцента, выделяющего преимущественно актиномицин D в смеси актиномицинов, требует дальнейшей очистки препарата от структурно сходных примесей [10]. Важным аргументом для выбора именно дактиномицина в качестве цитостатического агента является и факт доступности высококачественной субстанции отечественного производства (ОАО «ОНОПБ», Россия). Исследование физико-химических свойств данной субстанции методами высокоэффективной жидкостной хроматографии, масс-спектроско-пии, корреляционной спектроскопии ядерного магнитного резонанса, спектрофлуориметрии, а
также подтверждение цитотоксической активности продемонстрировали полное совпадение со стандартом. Таким образом, можно сделать вывод, что отечественная субстанция дактиномицина является высокоочищенным препаратом и показывает присущую ему фармакологическую активность in vitro [11].
Сравнительное клиническое изучение препаратов «Акномид Д» (ООО «Адиком», Россия), разработанного на основе этой субстанции, и Космеген (H. Lundbeck A/S, Великобритания) у детей с нефробластомой продемонстрировало идентичную терапевтическую эффективность и достоверно более низкую подострую гепатотоксичность первого [6, 7].
Компоненты векторной доставки
Мишенью для направленного транспорта являются рецепторы АФП, а в качестве вектора предлагается использовать рекомбинантный глико-протеин [12-14]. Преимущества использования именно АФП, а не других транспортных белков (например, альбумина, трансферрина или эпидер-мального фактора роста), объясняются тем, что он относится к физиологическим транспортным белкам и осуществляет доставку жирных кислот в живые клетки для поддержания их жизнедеятельности, при этом хорошо известен факт экспрессии опухолевыми клетками рецепторов АПФ и их полное отсутствие в здоровых клетках человека [1-3, 12-22].
Экспрессия рецепторов АФП была показана на нескольких типах опухолей в различных моделях, таких как рабдомиосаркома крысы [23], нейро-бластома мыши [24], карцинома молочной железы мыши и человека [23, 25], T-лимфома мыши [26], лимфома T- и C-клеток человека [23], линия моно-цитных клеток злокачественного новообразования U937 [27], линия клеток рака толстой кишки человека НТ29 [23] и др. Эти данные характеризуют АФП как широко распространенный карцино-эмбриональный антиген — специфичный маркер злокачественной опухоли.
Важным компонентом препаратов векторной доставки являются наночастицы на основе биоразлагаемых полилактидглиголидов (Polylactic-Co-Glycolic Acid, PLGA), которые наиболее часто используются для этих целей [2831]. Полилактидглиголиды можно получить синтетическим путем — из молочной и гликолевой кислот, образующих между собой сложноэфир-ную связь. Физико-химические свойства PLGA определяются молярным соотношением и последовательным расположением молочной и глико-левых кислот.
Наноносители этого типа особенно эффективны для внутриклеточной доставки лекарственных веществ [28, 31-33]. При такой контролируемой доставке обеспечивается интактность терапевтического агента до взаимодействия с целевы-
ми мишенями, предотвращается преждевременная деградация вещества, что позволяет снизить общетоксическое действие препарата [28, 31, 33]. Парентеральное применение наночастиц связано в основном с терапией опухолевых заболеваний [28, 29, 31, 33]. Размер коллоидных наноносителей (в исследуемом препарате — 110±28 нм) в среднем в 64 раза меньше диаметра эритроцитов (~7,0 мкм), следовательно, они могут быть введены внутривенно без какого-либо риска эмболии. Попадая в кровяное русло, наночастицы циркулируют в нем до момента достижения ими зоны поражения и не выходят за пределы капилляров в здоровых тканях [31]. Наличие химически конъюгированного АФП с поверхностью полимерных частиц обусловливает взаимодействие конъюгата со специфическими АФП-аффинными рецепторами опухолевых клеток и дальнейший рецепторопосредованный эндоцитоз наночастиц, содержащих противоопухолевый препарат. Таким образом, осуществляется «адресная» доставка в опухолевую ткань, что приводит к значительному снижению эффективной дозы препарата и токсического воздействия цитостатического агента [33]. Сами же наночастицы не обладают какими-либо токсичными свойствами [28, 29, 31, 33]; известны лекарственные препараты на их основе, разрешенные для клинического применения, в том числе парентеральным способом [3, 33].
Таким образом, была сконструирована молекула препарата белково-векторной доставки «Афотид»1, в которой действующим цитостатическим агентом является дактиномицин, инкапсулированный в полимерную PLGA-нанокапсулу, а белковым вектором — рекомбинантный АФП (рис. 1) [2].
Целью настоящего исследования является сравнительное изучение противоопухолевой активности препарата белково-векторной доставки дактиномицина с прототипом на экспериментальных опухолевых моделях у мышей.
Задачи исследования
1. Сравнение общетоксического действия препарата белково-векторной доставки (препарат
1
Препарат находится в процессе Государственной регистрации в качестве лекарственного средства для медицинского применения.
выбора) с прототипом (препарат сравнения) у мышей с асцитной моделью аденокарциномы Эрлиха (ААЭ).
2. Исследование накопления опухолевыми клетками 7-амино-дактиномицина (7-АД) при вну-трибрюшинном введении субстанций 7-АД, нано-7-АД и конъюгата нано-7-АД с АФП (препарат выбора) на модели ААЭ, привитой беспородным мышам.
3. Сравнение противоопухолевой активности препарата белково-векторной доставки с прототипом у мышей с солидной моделью лимфолейко-за Р388, чувствительной к дактиномицину, и с асцитной моделью лимфолейкоза P388, резистентной к действию дактиномицина (Р388/ АСТ-D) у мышей-самок инбредной линии DBA/2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сравниваемые препараты
Для проведения исследования использовали препараты:
• «Акномид Д», раствор для внутривенного введения и перфузии 0,5 мг/мл, производство ЗАО «Брынцалов А» по заказу ООО «Адиком», серия 010515; регистрационный номер ЛП-002036;
• дактиномицин, субстанция-порошок, производство ОАО «Омутнинская НОПБ», серия 010316, годен до 03.2019;
• рекомбинантный альфа-фетопротеин (рАФП), субстанция-порошок для приготовления стерильных лекарственных форм, 1 г, производство ООО «НПК КЕМ», серия 011015, годен до 10.2018;
• «Афотид», лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения и перфузии 0,125 мг/мл, 5 ампул по 1 мл, производство ЗАО «ЭкоФармПлюс» по заказу ООО «Лина М», серия 010515, годен до 05.2018.
Технология инкапсуляции
Для производства препарата использовалась разработанная нами технология инкапсуляции дактиномицина в полимерные частицы: навеску 5 мг дактиномицина растворяли в 5 мл ацетона, перемешивая на магнитной мешалке (Variomag Multipoint, США). Затем в раствор добавляли 50 мг
Рис. 1. Схематическое изображение сконструированной молекулы препарата белково-векторной доставки Примечание. АФП — альфа-фетопротеин.
191
полимера PLGA50/50-C00H и перемешивали до полного растворения. С помощью инсулинового шприца при интенсивном перемешивании к 25 мл 0,5% поливинилового спирта добавляли дактиномицин и полимер в ацетоне. Перемешивали 30 мин. Далее удаляли органический растворитель на роторном испарителе La^ota 4000 Efficient (Германия) при вакууме 0,9-1 кгс/м2 и температуре водяной бани 35°С. С целью удаления поливинилового спирта полученную смесь вращали на центрифуге J2-J21 (Beckman, США) в течение 20 мин при 14 000 об/мин. Полученный осадок отделяли от супернатанта и ресуспендиро-вали на виброподвесе Vibrofix VF1 Electronic (IKA, ФРГ), предварительно добавив 5 мл дистиллированной воды. После этого смесь подвергали низкочастотной соникации на ультразвуковой бане Transsonic 420 (Elma, ФРГ) в течение 2 мин. Затем смесь пропускали через стеклянный фильтр (класс ПОР 40-110 мкм) в круглодонную колбу на 250 мл. Колбу с фильтратом дополнительно ваку-умировали с помощью водоструйного насоса. К полученному раствору добавляли 100 мг криопро-тектора — Д-маннита — и замораживали в бане с жидким азотом. Колбу сушили на лиофильной сушке ALFA 1-5 (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, ФРГ) в течение 20 ч, после чего хранили при 4°С.
Технология получения препарата
белково-векторной доставки
Использована следующая технология: 15 мг полимерных частиц, содержащих дактиномицин, суспендировали в 1 мл фосфатно-солевого буфера (Phosphate-Buffered Saline, PBS), после чего к раствору добавляли 240 мкл 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC) и N-гидроксисукцинимида (N-hydroxysuccinimide, NHS) из стокового раствора в PBS с концентрацией 5 мг/мл и перемешивали 20 мин; затем добавляли 3 мкл ß-меркаптоэтанола (ß-mercaptoethanol, BME) и перемешивали еще 10 мин, после чего к реакционной массе добавляли 5 мг рекомби-нантного АФП; полученную смесь перемешивали еще 30 мин. Для остановки реакции к полученному конъюгату добавляли 3 мкл этаноламина. Проводили гель-фильтрацию реакционной массы на сорбенте Superose 12 (GE Healthcare, США). Фракцию с целевым продуктом лиофилизирова-ли на лиофильной сушке ALFA 1-5 в течение 20 ч, после чего хранили при -20°С.
Для исследования модели ААЭ использовались самки белых беспородных мышей в количестве 90 особей, модели лимфолейкоза Р388 — мыши-самки породы DBA/2 в количестве 140 особей. Масса тела животных в начале исследования составила 18-20 г. Возраст на начало исследования — 8 нед; источник — питомник «Столбовая» НЦ биомедицинских технологий
РАМН (Московская обл.). Период акклиматизации — 14 сут. Содержимое ампул с раствором дактиномицина (500 мкг/мл) разводили 10% раствором реополиглюкина до концентрации 12 мкг/1,0 мл и вводили мышам внутривенно в хвостовую вену по 0,2 мл.
Содержимое ампул с лиофилизатом конъюга-та инкапсулированного в PLGA дактиномицина с АФП (0,125 мг/мл) растворяли в физиологическом растворе до концентрации 5,44 мкг/мл и вводили мышам внутривенно в хвостовую вену по 0,2 мл.
В качестве контроля использовали 10% раствор реополиглюкина и физиологический раствор, которые водили мышам внутривенно в хвостовую вену по 0,2 мл.
Изучение острого токсического действия
препарата белково-векторной доставки
дактиномицина и препарата сравнения на
белых беспородных мышах-самках с ААЭ
Использовали клетки карциномы Эрлиха; источник культуры клеток — Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина (Москва). Клетки хранили в жидком азоте. После размораживания их предварительно перевивали внутрибрю-шинно 2-3 белым беспородным мышам. Для проведения экспериментов опухолевый материал в виде суспензии опухолевых клеток брали из асцитной жидкости. Подсчет жизнеспособных опухолевых клеток проводили в камере Горяева. Асцитную жидкость разводили в стерильном физиологическом растворе до концентрации 1х107 клеток/мл и перевивали белым беспородным мышам внутри-брюшинно. Для развития асцитной опухоли клетки АЭ перевивали белым беспородным мышам вну-трибрюшинно путем введения суспензии клеток в дозе 1х106 клеток на особь, объем инъекции — 0,2 мл на особь. После перевивки опухолевых клеток животных рандомизировали, формировали экспериментальные группы и наносили индивидуальные метки насыщенным раствором пикриновой кислоты. Внутривенное введение проводили путем инъецирования препарата одноразовым шприцем объемом 1 мл в латеральную хвостовую вену фиксированной мыши. Вводимый объем — 0,2 мл. Токсикометрия включала экспериментальное определение выживаемости мышей при введении возрастающих доз по Литчфилду-Уилкоксону, компьютерный расчет показателей острой токсичности — летальной дозы (ЛД50, ЛД16, ЛД84), описание клинической картины интоксикации, вскрытие (некропсия) павших животных, а также животных, выживших и забитых через 30 дней после однократного введения препаратов, характеристику причин смертности.
Все подопытные животные были разделены на 8 групп. Группы формировались методом случайных чисел с использованием массы тела в качестве ведущего признака. Схема эксперимента приведена в табл. 1.
Таблица 1. Выживаемость белых беспородных мышей с асцитной карциномой Эрлиха в стандартном токсикологическом эксперименте
Группа Препарат / введение Пало ЛД, мкг/кг
10 животных
Контроль По 0,2 мл 10% р-ра реополиглюкина (в хвостовую вену) 1 раз через 5 дней после перевивки опухоли 0/10 -
I опытная Через 5 дней после перевивки опухоли препаратом сравнения, внутривенное введение в дозе 850,0 мкг/кг в 0,2 мл 10% р-ра реополиглюкина, однократное введение 10/10 ЛДю0 - 852
II опытная Через 5 дней после перевивки опухоли препаратом выбора, внутривенно в дозе 850,0 мкг/кг в 0,2 мл физ. р-ра, однократное введение 0/10 -
III опытная Через 5 дней после перевивки опухоли препаратом выбора, внутривенно в дозе 1050,0 мкг/кг в 0,2 мл физ. р-ра, однократное введение 1/10 -
IV опытная Через 5 дней после перевивки опухоли препаратом выбора, внутривенно в дозе 1300,0 мкг/кг в 0,2 мл физ. р-ра, однократное введение 2/10 ЛД16 - 1264
V опытная Через 5 дней после перевивки опухоли препаратом выбора, внутривенно в дозе 1550,0 мкг/кг в 0,2 мл физ. р-ра, однократное введение 5/10 ЛД50 - 1580
VI опытная Через 5 дней после перевивки опухоли препаратом выбора, внутривенно в дозе 1800,0 мкг/кг в 0,2 мл физ. р-ра, однократное введение 7/10 ЛД84 - 1980
VII опытная Через 5 дней после перевивки опухоли препаратом выбора, внутривенно в дозе 2050,0 мкг/кг в 0,2 мл физ. р-ра, однократное введение 9/10 ЛД100 - 2100
193
Примечание. ЛД — летальная доза (16 / 50 — среднесмертельная, 84 / 100 — абсолютная смертельная). ЛД50 для препарата сравнения составляет 0,601 мг/кг, для препарата выбора — 1,580 мг/кг.
Исследование накопления опухолевыми клетками 7-АД при внутрибрюшинном введении субстанции 7-АД, нано-7-АД и конъюгата нано-7-АД с АФП на модели ААЭ, привитой беспородным мышам Двум беспородным мышам массой 20-25 г прививали внутрибрюшинно по 1 млн клеток ААЭ в 100 мкл среды для культивирования клеток (DMEM, Gibco, США). На 7-9-й день клетки образовавшейся асцитной опухоли перевивали аналогичным образом 12 беспородным мышам. Все подопытные животные были разделены на 4 группы. Группы формировались методом случайных чисел с использованием массы тела в качестве ведущего признака. На 7-й день животным вводили внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл препараты в дозе 400 мкг/кг в пересчете на содержание субстанции (7-АД):
1) контроль (физ. р-р);
2) 7-АД;
3) наночастицы с 7-АД;
4) конъюгат АФП с наночастицами, содержащими 7-АД (препарат выбора).
Через 4 ч производили отбор асцитной жидкости, опухолевые клетки отмывали холодным PBS 3 раза и фиксировали 4% параформальде-гидом в течение 15 мин, затем 2 раза промывали холодным PBS. Каждый образец содержал не менее 200 тыс. клеток в 200 мкл буфера. Анализ
интернализации опухолевыми клетками 7-АД оценивали по интенсивности его флуоресценции на проточном цитофлуориметре FACS СэПЬиг (США): Л возбуждения — 488 нм, детекцию осуществляли при Л = 647 нм.
Изучение противоопухолевой активности препаратов сравнения на солидной модели лимфолейкоза P388 у мышей-самок линии DBA/2
Использовали следующие линии опухолевых клеток:
1) штамм лимфолейкоза мыши Р388. Источник культуры клеток — Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина (Москва). Клетки хранили в жидком азоте. Штамм поддерживается на мышах линии DBA/2. После размо-розки клеток Р388 суспензию предварительно перевивали внутрибрюшинно 2-3 мышам линии DBA/2;
2) штамм лимфолейкоза мыши Р388, резистентный к дактиномицину (Р388/АСТ^). Источник культуры клеток — Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина (Москва). Клетки хранили в жидком азоте. Штамм поддерживается на мышах линии DBA/2. После размо-розки клеток Р388 суспензию предварительно перевивали внутрибрюшинно 2-3 мышам линии DBA/2.
Для проведения экспериментов опухолевый материал в виде суспензии опухолевых клеток брали из асцитной жидкости. Подсчет жизнеспособных опухолевых клеток проводили в камере Горяева. Асцитную жидкость разводили в стерильном физиологическом растворе до концентрации 1х107 клеток/мл и перевивали мышам линии DBA/2 внутрибрюшинно или подкожно. Внутривенное введение проводили путем инъецирования препарата одноразовым шприцем объемом 1 мл фиксированной мыши в латеральную хвостовую вену. Вводимый объем — 0,2 мл. Количественные критерии оценки ингибирующего эффекта на опухолях животных, удлинения продолжительности жизни определяли в соответствии с методическими рекомендациями для доклинических исследований [34-36]. Схемы экспериментов приведены в табл. 2, 3.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты исследования выполнены графически.
Выживаемость белых беспородных мышей с ААЭ после внутривенного введения препарата белково-векторной доставки дактиномицина и препарата сравнения представлена на рис. 2. Исследование накопления опухолевыми клетками субстанции 7-АД, нано-7-АД и конъюгата АФП с наночастицами, содержащими 7-АД, на модели ААЭ, привитой беспородным мышам при внутри-брюшинном введении, отражено в рис. 3.
Как показано на рис. 3, отмечается достоверно более высокий уровень (в 4,6 раз, р<0,0001) накопления 7-АД в опухолевых клетках при использовании препарата белково-векторной доставки с АФП. Это согласуется с литературными данными, описывающими эксперименты in vitro [2, 14].
Таблица 2. Сравнение противоопухолевой активности препарата выбора и прототипа на солидной модели лимфолейкоза Р388 у мышей-самок линии DBA/2 в зависимости от продолжительности курса лечения
194
Группа Препарат / введение Объем опухоли, (X±m) см3 Торможение роста опухоли, % СПЖ, дни УПЖ,%
15 животных
I контроль Через 24 ч после перевивки опухоли 0,2 мл 10% р-ра реополиглюкина (в хвостовую вену) 1 раз в день, каждые 48 ч, 7 введений 12,6±3,2 - 14,9 -
II контроль Через 24 ч после перевивки опухоли 0,2 мл физ. р-ра (в хвостовую вену) 1 раз в день, каждые 48 ч, 7 введений 13,7±4,8 - 14,9 -
10 животных
III опытная Через 24 ч после перевивки опухоли препаратом сравнения, внутривенное введение в дозе 85,0 мкг/кг в 0,2 мл р-ра 10% реополиглюкина, 1 раз в день, каждые 48 ч, 3 введения 7,8±3,8 40,6 19,8 32,9
IV опытная Через 24 ч после перевивки опухоли препаратом сравнения, внутривенное введение в дозе 85,0 мкг/кг в 0,2 мл р-ра 10% реополиглюкина, 1 раз в день, каждые 48 ч, 5 введений 5,7±3,8 56,6 23,8 60
V опытная Через 24 ч после перевивки опухоли препаратом сравнения, внутривенное введение в дозе 85,0 мкг/кг в 0,2 мл р-ра 10% реополиглюкина, 1 раз в день, каждые 48 ч, 7 введений 4,9±3,8 62,7 26,4 77,1
VI опытная Через 24 ч после перевивки опухоли препаратом выбора, внутривенное введение в дозе 85,0 мкг/кг в 0,2 мл физ. р-ра, 1 раз/сут, каждые 48 ч, 3 введения 5,6±1,9 60,0 32,2 116,1
VII опытная Через 24 ч после перевивки опухоли препаратом выбора, внутривенное введение в дозе 85,0 мкг/кг в 0,2 мл физ. р-ра, 1 раз/сут, каждые 48 ч, 5 введений 2,41±1,1** 81,6 35,1 135,5
VIII опытная Через 24 ч после перевивки опухоли препаратом выбора, внутривенное введение в дозе 85,0 мкг/кг в 0,2 мл физ. р-ра, 1 раз/сут, каждые 48 ч, 7 введений 1,9±0,9** 83,2 37,8 153,7
Примечание. ** — р < 0,01.
Таблица 3. Сравнение противоопухолевой активности препарата белково-векторной доставки и прототипа на асцитной модели лимфолейкоза P388, резистентной к дактиномицину (P388/ACT-D), у мышей-самок линии DBA/2
Группа животных Доза и режим введения препарата Объем асцитной жидкости (X±m), мл ТРО, % Продолжительность жизни, дни УПЖ, %
15 животных
I контроль 0,2 мл 10% р-ра реополиглюкина в хвостовую вену и внутрибрюшинно 1 раз в день, каждые 48 ч, 7 введений 4,21±0,31 _ 11,8±1,6 -
II контроль 0,2 мл 0,9% физ. р-ра в хвостовую вену и внутрибрюшинно 1 раз в день, каждые 48 ч, 7 введений 4,43±0,21 - 12,1±1,24 -
10 животных
III опытная Через 24 ч после перевивки опухоли препаратом сравнения в дозе 85 мкг/ кг, внутрибрюшинно в 0,2 мл 10% р-ра реополиглюкина, 1 раз в день, каждые 48 ч, 5 введений 3,57±0,19* 21,9* 14,3±1,20* 20
IV опытная Через 24 ч после перевивки опухоли препаратом выбора в дозе 85,0 мкг/ кг, внутрибрюшинно в 0,2 мл физ. р-ра, 1 раз/сут, каждые 48 ч, 5 введений 2,12±0,19** 50,9 20,3 ± 1,31** 70,5
Акномид Д
Афотид
Рис. 2. Сравнение профилей токсичности препарата белково-векторной доставки и прототипа у беспородных мышей с асцитной карциномой Эрлиха
■ 7-АД I НЧ-(7-АД) ■ НЧ (7-АД) (Афотид)
Рис. 3. Интенсивность флуоресценции (в оптических единицах) опухолевых клеток после интернализации в них субстанции 7-АД (синий цвет), нано-7-АД (оранжевый) и коньюгата альфа-фетопротеина с наночастицами, содержащими 7-АД (серый), на модели ААЭ, привитой беспородным мышам при внутрибрюшинном введении
Изучение противоопухолевой активности препаратов сравнения на солидной модели лимфолей-коза P388 у мышей-самок DBA/2 представлено на рис. 4.
На рис. 5 дана сравнительная характеристика противоопухолевого действия препарата белково-векторной доставки дактиномицина (VIII опытная группа) и препарата сравнения (V опытная группа) по критериям торможение роста опухоли (ТРО) и удлинения продолжительности жизни (УПЖ).
Изучение сравнительной противоопухолевой активности препаратов сравнения на асцитной модели лимфолейкоза P388, резистентной к дак-тиномицину (P388/ACT-D), у мышей самок линии DBA/2 представлено на рис. 6.
180 7
УПЖ при внутривенном введении препарата белково-векторной доставки дактиномицина и препарата сравнения на асцитной модели лимфолейкоза Р388, резистентной к дактиномицину (Р388/АСТ^), у мышей-самок линии DBA/2 представлено на рис. 7.
ВЫВОДЫ
1. Исследуемый препарат белково-векторной доставки селективно накапливается в опухолевых клетках и тканях за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза. Этот эффект достигается наличием белково-векторной части (АФП) в конъюгате и наиболее ярко продемонстрирован более высоким уровнем (в 4,6 раз;
160
Контроль 3* 5* 7* 3* 5* 7*
* Число введений
Контроль ■ АкномидД ■ Афотид
Рис. 4. Удлинение средней продолжительности жизни в зависимости от длительности лечения у мышей с солидной моделью лимфолейкоза Р388 после введения препаратов сравнения
Дни после имплантации
Контроль —■— АкномидД —■— Афотид
Рис. 5. Сравнительная характеристика противоопухолевого действия препарата белково-векторной доставки актиномицина
(VIII опытная гр.) и препарата сравнения (V опытная гр.) по критериям торможения роста опухоли и удлинения продолжительности жизни
10 15
Дни после имплантации
Акномид Д, 85,0 мкг/кг
20
25
Афотид, 85,0 мкг/кг
Рис. 6. Противоопухолевая активность препарата белково-векторной доставки дактиномицина и препарата сравнения на асцитной модели лимфолейкоза P388, резистентной к дактиномицину (Р388/АСТ-й), у мышей самок линии DBA/2 Примечание. Критерии торможения роста опухоли и удлинения продолжительности жизни при использовании препарата сравнения статистически незначимо отклоняются от контроля — р<0,1.
80 т
Контроль ■ Акномид Д
Афотид
Рис. 7. Удлинение продолжительности жизни при внутривенном введении препаратов сравнения на асцитной модели лимфолейкоза Р388, резистентной к дактиномицину (Р388/АСТ-Э), у мышей-самок ЭВА/2
р<0,0001) накопления 7-АД в опухолевых клетках при включении его в наночастицы, конъю-гированные с АФП, при внутрибрюшинном введении мышам с асцитной карциномой Эрлиха.
2. Препарат обладает отчетливо меньшей острой токсичностью, при этом выявлен феномен значительного снижения ее у мышей с моделированной опухолью по сравнению со здоровыми животными. Это, очевидно, связано с использованием полимерных наночастиц, с их медленной деградацией, а также с быстрым выведением препарата из кровотока и накоплением его в опухолевой ткани в связи с высокой аффинностью рецепторов АФП на поверхности опухолевых клеток. Такой механизм приводит к расширению диапазона тера-
певтического окна в 6,55 раз для препарата белково-векторной доставки (119,2 против 60,6 у здоровых животных и 18,2 — у препарата сравнения). При проведении исследования острой токсичности было выявлено значительное увеличение показателя ЛД50 до 1,580 мг/ кг против 0,601 мг/кг у препарата сравнения. Такой феномен кардинально расширяет возможности для проведения длительных курсов лекарственной терапии апробируемым препаратом с относительно более высокими разовыми и курсовыми дозами, что, предположительно, должно привести к значительному повышению его клинической эффективности при существенном снижении частоты и выраженности побочных действий.
3. Механизм белково-векторной доставки определяет и существенное повышение противоопухолевого эффекта по критерию ТРО: у чувствительной к дактиномицину опухолевой модели — в 1,48 раза, у резистентной модели — в 2,32 раза. По критерию удлинения продолжительности жизни — в 2,71 и 3,525 соответственно при сравнении со значениями препарата-прототипа.
4. Препарат обладает существенными отличиями от прототипа в плане расширения спектра противоопухолевой активности, в том числе в отношении опухолей, резистентных к препарату сравнения (асцитной модели лимфолейкоза P388, резистентного к дактиномицину, Р388/ АСТ-D).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, использование препарата бел-ково-векторной доставки дактиномицина у мышей с моделированными опухолями приводит к значи-
тельному повышению противоопухолевой эффективности и безопасности по сравнению с прототипом, что согласуется с проведенными ранее экспериментальными исследованиями [1, 2, 15, 18, 20]. Эти результаты представляют серьезное основание для клинического изучения препарата в онкопедиатрии.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Исследование выполнено в рамках Государственного Контракта №14411.2049999.19.110 от 10.12.2014 г. «Трансфер зарубежных разработок инновационного лекарственного средства белково-векторной доставки актиномицинового ряда для лечения онкологических заболеваний, и проведение его доклинических и клинических исследований» (Министерство промышленности и торговли РФ, федеральная целевая программа «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу»).
ЛИТЕРАТУРА
1. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Катлинский А.В., Москалева Е.Ю., Северин Е.С., Сотниченко А.И., Северин С.Е. Направленный транспорт противоопухолевых и антибактериальных препаратов. Аллерология и иммунология. 2003;4(3):91-96.
2. Северин Е.С., Круглый Б.И., Северин С.Е. Разработка новых технологий создания лекарственных препаратов избирательного действия. Аллергология и иммунология. 2015;16(4):347-350.
3. Северин Е.С., Гнучев Н.В., Воронцов Е.А., Позднякова Н.В., Гукасова Н.В., Северин С.Е., Годованный А.В. Противоопухолевый препарат. Патент RU 2451509 C1.
4. Валиев Т.Т., Левашов А.С., Сенжапова Э.Р. Таргетные препараты в детской онкологии. Онкопедиатрия. 2016;3(1):8-15. Doi: 10.15690/onco.v3i1.1524.
5. Абелев Г.И. Что такое опухоль? Соросовский образовательный журнал. 1997;10:85-90.
6. Горбунова Т.В., Березовская И.В., Поляков В.Г. Применение дактиномицина при солидных опухолях у детей. Онкопедиатрия. 2014;4:34-39.
7. Горбунова Т.В., Березовская И.В., Постникова Т.В. Сравнительная характеристика токсичности противоопухолевых антибиотиков группы актиномицинов при лечении солидных опухолей у детей. Онкопедиатрия. 2014;1:20-24.
8. Philips FS, et al. The toxicity of Actinomycin D. Annals of the New York Academy of Sciences. 1960;89(2):348-360.
9. Векшин Н.Л. Биофизика ДНК-актиномициновых нано-комплексов. Пущино: Фотон-век. 2009. 192 с.
10. Waksman SA. Associative and antagonistic effects of microorganisms II. Antagonistic effects of microorganisms grown on artificial substrates. SA Waksman, JW Foster. Soil Sci. 1937;43(1):69-76.
11. Зенин В.А., Круглый Б.И., Никольская Е.Д., Белов А.В., Яббаров Н.Г., Сиротюк Д.О., Тюляев А.И. Изучение физико-химических и биологических свойств фармацевтической субстанции дактиномицина. Биотехнология. 2016 (в печати).
12. Ницветов М.Б. Караулов A.B., Москалева Е.Ю., Родина A.B., Посыпанова Г.А., Сологуб В.К., Попова О.Н., Шмырев И.И., Северин С.Е., Северин Е.С.
Моноклональные антитела к рецептору альфа-фетопро-теина. Возможность иммунодиагностики, иммунопрофилактики и иммунотерапии онкологических заболеваний. Материалы II Российской конференции молодых ученых с международным участием 24-27 апреля 2001. М., 2001;1:185.
13. Ницветов М.Б., Москалева Е.Ю., Сладкова Л.В., Родина А.В., Посыпанова Г.А., Лопова О.Н., Сологуб В.К., Караулов А.В., Северин С.Е., Северин Е.С. Анализ количества и активности рецепторов АФП на чувствительных и резистентных опухолевых клетках и преодоление множественной лекарственной устойчивости с помощью направленного транспорта доксорубицина через рецептор АФП. I Всероссийская научно-практическая конференция «Биотерапия рака». М., 2002. С. 73.
14. Северин Е.С., Посыпанова Г.А. Молекулярная физиология рецептор-опосредованного эндоцитоза и его роль в преодолении множественной лекарственной устойчивости. Российский физиол. журнал им. И.М. Сеченова. 2011;6:553-565.
15. Москалева Е.Ю., Шмырев И.И. Кривонос А.В., Северин Е.С. Противоопухолевая активность конъюга-тов цитотоксических препаратов с альфа-фетопротеи-ном. Рос. онкологический журнал. 1997;4:29-32.
16. Ницветов М.Б., Родина A.B., Москалева Е.Ю. и др. Характеристика моноклональных антител к рецептору АФП в сравнении с АФП по их взаимодействию с опухолевыми клетками человека. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2001;3:19-25.
17. Ницветов М.Б., Москалева Е.Ю., Макарова О.В., Сладкова Л.В., Родина A.B., Посыпанова Г.А., Попова О.Н., Сологуб В.К., Коромыслова И.А., Караулов A.B., Северин С.Е., Северин Е.С. Выявление рецептора АФП с помощью иммуногистохимического окрашивания моно-клональными антителами. 5-й Конгресс «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофарма-кологии». М., 2002. С. 106.
18. Ницветов М.Б., Москалева Е.Ю., Сладкова Л.В., Родина A.B., Посыпанова Г.А., Попова О.Н., Коромыслова И.А., Караулов A.B., Северин С.Е.,
Северин Е.С. Характеристика чувствительных и резистентных к доксорубицину опухолевых клеточных линий по уровню экспрессии рецептора альфа-фетопротеина и способности к рецептор-опосредованному эндоцитозу. Молекулярная медицина. 2003;2:57-60.
19. Ницветов М.Б., Москалева Е.Ю., Посыпанова Г.А., Макарова О.В., Степанов В.А., Рогов К.А., Попова О.Н., Сологуб В.К., Коромыслова И.А., Караулов А.В., Северин С.Е., Северин Е.С. Экспрессия РеАФП в опухолевых и нормальных тканях человека. Материалы 3-й Научной конференции и школы-семинара для молодых ученых «Белки-маркеры патологических состояний». Астрахань-Москва. 2003. С. 14-19.
20. Северин Е.С., Константинова С.В., Северин С.Е. проблемы преодоления множественной лекарственной устойчивости. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2009;2:3-13.
21. Северин Е.С., Москалева Е.Ю., Родина А.В., Клименко П.А. Противоопухолевая активность конъюгата антибиотика эсперамицина А1 с альфа-фетопротеином человека. М.: Доклады АН. 1999;366(4):561-564.
22. Северин Е.С., Ницветов М.Б., Москалева Е.Ю., Сологуб В.К., Белоусова Ю.В., Коромыслова И.А., Родина А.В., Караулов А.В. Изучение возможности использования моноклональных антител к рецептору альфа-фетопротеина для регуляции противоопухолевого иммунитета. Вторая международная ассамблея «Новые медицинские технологии». Аптека-2000. М., 2000. С. 68-69.
23. Uriel J, Villacampa MJ, Moro R, Naval J, Failly-Crepin C. Uptake of radiolabeled alpha-fetoprotein by mouse mammary carcinomas and its usefulness in tumor scintigraphy. Cancer Res. 1984 Nov;44(11):5314-9.
24. Hajeri-Grmond M, et al. The uptake of alpha-foetopro-tein by C-1300 mouse neuroblastoma cells. Br J Cancer. 1985;51:791-797.
25. Villacampa MJ, et al. a-Fetoprotein receptors in a human breast cancer cell line. Biochem Biophys Res Commun. 1984;122:1322-7.
26. Naval J, et al. Cell type-specific receptors for AFP in a mouse T-lymphoma cell line. Proc Natl AcadSci USA. 1985; 82:3301-3304.
27. Suzuki Y, et al. Isolation and characterization of a specific alpha-fetoprotein receptor on human monocytes. J Clin Invest. 1992;90:1530-1536.
28. Балабаньян В.Ю. Фармакологические и фармацевтические аспекты создания наноразмерных форм факторов роста нервной ткани, феназепама и паклитаксела. Автореф. дисс. ...канд. фармац. наук. М., 2015.
29. Дурнев А.Д. Токсикология наночастиц. БЭБМ. 2008;145(1):78-80.
30. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. Под ред. проф. В.В. Меньшикова. М.: Медицина. 1987. 368 с.
31. Методические рекомендации по выявлению наномате-риалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека. МР 1.2.2522-09. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2009. 35 с.
32. Куценко С.А. Основы токсикологии. СПб.: Фолиант. 2004. 720 с.
33. Borm PJ, Robbins D, Haubold S, Kuhlbusch T, Fissan H, Donaldson K, Schins R, Stone V, Kreyling W, Lademann J, Krutmann J, Warheit D, Oberdorster E. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 2006;3:11.
34. Глазкова Т.Г., Софьина З.П., Горбунова В.А., Смирнова З.С., Герасимова Г.К. Оценка информативности экспериментальных тестов, используемых для прогноза клинической активности противоопухолевых препаратов. Информативность различных экспериментальных опухолей мышей.
35. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть I. М.: Гриф и К. 2012. 944 с.
36. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2005. С. 59-65.
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Круглый Борис Игоревич, кандидат медицинских наук, главный научный сотрудник ООО «Лаборатория инновационных научных исследований в медицине»
Адрес: 115093, Москва, ул. Дубининская, д. 90, тел.: +7 (495) 958-16-52, e-mail: [email protected]
Никольская Елена Дмитриевна, руководитель научно-производственной лаборатории ОАО «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения»
Адрес: 117149, Москва, Симферопольский бульвар, д. 8, тел.: +7 (499) 613-23-50, e-mail: [email protected] Северин Евгений Сергеевич, доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН, директор ОАО «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения»
Адрес: 117149, Москва, Симферопольский бульвар, д. 8, тел.: +7 (499) 613-23-50, e-mail: [email protected] Барсегян Геворкбек Гайкович, кандидат биологических наук, заведующий виварием ОАО «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения»
Адрес: 117149, Москва, Симферопольский бульвар, д. 8, тел.: +7 (499) 613-23-50, e-mail: [email protected]
Яббаров Никита Григорьевич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ОАО «Всероссийский научный центр
молекулярной диагностики и лечения»
Адрес: 117149, Москва, Симферопольский бульвар, д. 8, тел.: +7 (499) 613-23-50, e-mail: [email protected]
Терещенко Оксана Геннадьевна, старший научный сотрудник ООО «Лаборатория инновационных научных исследований в
медицине»
Адрес: 115093, Москва, ул. Дубининская, д. 90, тел.: +7 (495) 958-16-52, e-mail: [email protected]
Жунина Ольга Александровна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ОАО «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения»
Адрес: 117149, Москва, Симферопольский бульвар, д. 8, тел.: +7 (499) 613-23-50, e-mail: [email protected]
Зенин Владимир Андреевич, старший научный сотрудник ООО «Лаборатория инновационных научных исследований в
медицине»
Адрес: 115093, Москва, ул. Дубининская, д. 90, тел.: +7 (495) 958-16-52, e-mail: [email protected] Тюляев Александр Иванович, кандидат фармацевтических наук, главный научный сотрудник ООО «Адиком» Адрес: 127591, Москва, ул. Дубининская, д. 79Б, тел.: +7 (495) 645-80-19, e-mail: [email protected]
