CC BY
101
ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ ОРМУСТИНА НА ПЕРЕВИВАЕМЫХ ЛЕЙКОЗАХ МЫШЕЙ
Н.С. Сапрыкина1, Л.М. Борисова1, М.П. Киселева1, З.С. Смирнова1, В.П. Краснов2, Г.Л. Левит2, В.В. Мусияк2, М.А. Барышникова1, В.М. Бухман1, З.С. Шпрах1, М.М. Давыдов1
1ФГБУ«Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478, Москва, Каширское ш., 24; 2 ФГБУН «Институт органического синтеза им. И.Я. Постовского» УрО РАН; Россия, 620990, Екатеринбург, ул. С. Ковалевской, 22
Цель исследования — изучить in vivo противоопухолевую активность лекарственной формы нового препарата из класса ни-трозоалкилмочевин «Ормустина» (алкилнитрозокарбамоил производного аминокислоты L-орнитин) на мышах с перевиваемыми лимфолейкозами.
Материалы и методы. Оценку потенциальной противоопухолевой активности ормустина проводили на мышах B6D2F1 с асцитными (L1210, L1210/ араноза, L1210/ нитруллин и P388) и солидными (P388) формами лимфолейкозов. В работе были использованы препараты из группы производных нитрозоалкилмочевины: ормустин, араноза и лизомустин. Лечение животных начинали через 24 ч после прививки лейкозов внутрибрюшинно и через 48 ч после прививки P388 подкожно. Препараты в широком диапазоне доз вводили мышам однократно внутривенно. Наблюдение за животными продолжали до их гибели. Критериями оценки противоопухолевого эффекта служили увеличение продолжительности жизни опытных мышей по сравнению с контрольными и их излечение.
Результаты Исследована противоопухолевая активность нового препарата класса нитрозалкилмочевин «Ормустин». Влияние ормустина изучено in vivo на рост перевиваемых штаммов лимфолейкозов мышей: L1210 (асцитный вариант) и P388 (асцитный и солидный варианты). Препарат эффективно ингибировал рост экспериментальных лейкозов, вызывая излечение значительной части мышей с лимфолейкозами. На L1210 и Р388установлена терапевтическая доза ормустина (125 мг/кг) при однократном внутривенном его введении.
Выводы. Выявленная активность характеризует ормустин как потенциальный противоопухолевый препарат. Ключевые слова: ормустин, нитрозоалкилмочевины, противоопухолевые препараты, перевиваемые лимфолейкозы мышей
DOI: 10.17650/1726-9784-2016-15-2-24-31
ANTITUMOR ACTIVITY OF ORMUSTINE AGAINST TRANSPLANTED LEUKEMIA IN MICE
N.S. Saprykina1, L.M. Borisova1, M.P. Kiseleva1, Z.S. Smirnova1, V.P. Krasnov2, G.L. Levit2, V.V. Musiyak2, M.A. Baryshnikova1, V.M. Bukhman1, Z.S. Shprakh1, M.M. Davydov1
1N.. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow, 115478, Russia; 2Postovsky Institute of Organic Synthesis, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; 22 S. Kovalevskaya St., Ekaterinburg, 620041, Russia
Objective: Evaluation of antitumor activity of a novel alkylnitrosoureas derivative Ormustine (an alkylnitrosocarbamoyl L-ornithine) in mouse lymphoid leukemia models.
Materials and methods. Antitumor activity of Ormustine has been evaluated in B6D2F1 mice with ascites form of leukemia (L1210, L1210/arenosa, L1210/citrullin and P388) and the solid (P388) form. In this study we used preparations from the alkylnitrosourea group: Ormustine, Aranoza and Lizomustine. Treatment of animals was started 24 hours after inoculation of leukemia intraperitoneally, and 48 hours after inoculation subcutaneous P388.
Drugs in a wide range of doses were administrated once intravenously. The follow up period of the animals continued until their death. Criteria of antitumor effect were increasing life expectancy and cure. Evaluation criteria of antitumor effect was the increase in life of experimental mice compared to control ones.
Results. Antitumor activity of a novel alkylnitrosoureas derivative, Ormustine has been studied in vivo on the growth of transplanted lymphoid leukemia, such as L1210 (ascites version) and P388 (ascites and solid tumor). Effective dose of single intravenous injection Ormustine against lymphoid leukemia L1210 and P388 was 125 mg/kg.
The drug effectively inhibited growth of experimental leukemia. The significant part of the mice with limfoleukemia has been cured. We have also established the single intravenous therapeutic dose of Ormustine on L1210 and Р388 leukemia — 125mg/kg of body weight. Conclusion. The data obtained characterizes Ormustin as a promissing anticancer drug.
Key words: Ormustine, alkylnitrosoureas, antitumor drugs, transplanted murine leukemia
Контакты: Сапрыкина Нина Семеновна Saprikina.nin@yandex.ru
Введение
Производные нитрозоалкилмочевины (НАМ) — одна из наиболее высокоэффективных групп противоопухолевых препаратов, однако низкая избирательность и высокая отсроченная и кумулятивная токсичность значительно лимитируют их эффективность. Поэтому столь актуально введение в арсенал противоопухолевых средств новых производных НАМ, менее токсичных и действующих более избирательно [1, 2]. Поиск новых противоопухолевых препаратов из класса НАМ перспективен, так как для этих соединений характерны широкий спектр противоопухолевой активности, различия в молекулярных механизмах действия у близких по структуре соединений и отсутствие полной перекрестной устойчивости с алкилиру-ющими соединениями [3, 4].
Известно, что при развитии опухолевого процесса увеличивается содержание аминокислот в опухоли и возрастает скорость их проникновения через клеточные мембраны [1, 5]. Данный факт позволил обосновать рациональность использования остатков аминокислот и олигопептидов в качестве молекул-носителей цитотоксических фрагментов для создания соединений с высокой избирательностью действия [1].
В Институте органического синтеза им. И.Я. По-стовского УрО РАН разработаны оригинальные методы синтеза большой группы алкилнитрозокар-бамоил-производных аминокислот, в которых ци-тотоксическая К-алкил-К-нитрозомочевинная группировка находится в боковой цепи аминокислоты,
а а-амино- и карбоксильная группы, определяющие основные биохимические свойства аминокислот и являющиеся важными для активного транспорта через клеточные мембраны, сохранены [1, 6, 7]. При разложении таких соединений in vivo возможно образование не только характерных для биологического действия НАМ алкилирующих и карбамоилирующих частиц, но и производных а-аминокислот — потенциальных антиметаболитов, за счет чего можно ожидать расширения спектра их противоопухолевой активности по сравнению с известными НАМ [1]. Указанная группа соединений имеет большой потенциал для создания высокоэффективных противоопухолевых агентов, так как у многих синтезированных веществ выявлено наличие более высокой специфической активности по сравнению с применяемыми в клинике препаратами группы нитрозомочевин. На основе 2-хлорэтилнитрозоуреидопроизводного аминокислоты L-лизина был создан отечественный противоопухолевый препарат «Лизомустин» (рис. 1), который разрешен к медицинскому применению для лечения злокачественной меланомы и мелкоклеточного рака легкого, хорошо переносится, обладает антиметастатическим действием [3, 8—10]. Не менее перспективен в плане создания нового противоопухолевого средства его близкий аналог, получивший название «Ормустин» (рис. 1) [10].
Ормустин представляет собой смесь изомеров положения нитрозогруппы: №-нитрозо-№-[№-(2-хлор-этил)карбамоил]^-орнитина (изомер 1) и N8-[N'-
Лизомустин
CHF 2 -COOH
CICH
Л
HN '
H2N
а - (Дифторметил)орнитин, Эфлорнитин
Ормустин
COOH
NH -
N5 - Хлорацетил-Ь-орнитин
H2N
2
Ингибиторы орнитиндекарбоксилазы
Рис. 1. Строение лизомустина, ормустина и ингибиторов орнитиндекарбоксилазы
26
Оригинальные статьи
нитрозо -№-(2-хлорэтил)карбамоил]^-орнитина (изомер 2). При развитии опухоли усиливается метаболизм полиаминов, а непротеиногенная аминокислота орнитин является основным источником синтеза полиаминов [11—14]. Следовательно, можно предположить, что использование L-орнитина в качестве молекулы-носителя может не только повысить избирательность доставки цитотоксической группировки в опухолевые клетки, но и воздействовать на их метаболизм [11, 15, 16], тем более что производное орни-тина а-(дифторметил)орнитин (DFMO, эфлорнитин) вошло в клиническую практику как противопарази-тарное средство против Trypanosoma brucei gambiense (Wëst African Sleeping Sickness) [17]. Но первоначально DFMO рассматривался как потенциальное противоопухолевое средство, так как он необратимо инги-бирует орнитиндекарбоксилазу (высоко активный в опухолевых клетках ключевой фермент синтеза полиаминов) [17]. Было установлено, что DFMO оказывает антипролиферативное действие на некоторые опухоли человека, имеет проапоптотические, антиин-вазивные и антиметастические свойства [16, 18]. Как правило, DFMO обладает обратимым цитостатиче-ским действием. При монотерапии его противоопухолевые эффекты незначительны, и на II фазе клинических испытаний он был признан недостаточно активным [19]. Несмотря на это, исследования DFMO в онкологии продолжаются, так как у него выявлен значительный потенциал для химиопрофилактики опухолевых заболеваний, основанный на его способности в малых дозах, которые нетоксичны при длительном использовании, понижать уровни полиаминов в слизистой оболочке толстого кишечника [17, 19].
Недавно M.M. Medina-Enriquez и соавт. показали, что другой ингибитор орнитиндекарбоксилазы №-хлорацетил^-орнитин (рис. 1) селективно тормозит рост клеток опухолей человека по сравнению с нормальными клетками и вызывает их гибель [20]. Кроме того, возможно, производные L-орнитина будут эффективны в существенно меньших дозах, так как данные ряда исследований указывают на то, что ин-гибирование синтеза полиаминов сопровождается повышением чувствительности клеток к действию нитрозомочевин BCNU (1,3-бис(2-хлорэтил)-1-нитро-зомочевина), ACNU (1-(4-амино-2-метилпирими-дин-5-ил)метил-3-(2-хлорэтил)-3-нитрозомочевина) и CCNU (1-(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозо-мочевина) [15, 21—23].
Ранее была выявлена высокая противоопухолевая активность фармацевтической субстанции ормустина in vitro на клеточных линиях диссеминированной ме-ланомы человека Mel Kor и Т-лимфобластного лейкоза человека Jurkat и in vivo на перевиваемых опухолях мышей LLC, В-16 и лимфолейкозе Р388 [24]. При сравнении на линии клеток меланомы человека Mel Z
цитотоксического действия различных лекарственных форм ормустина (синоним OR-2011) и разрешенных для клинического применения производных НАМ (араноза и лизомустин) было выявлено, что наиболее активным является ормустин [25].
Цель наших исследований состояла в оценке in vivo противоопухолевой активности лекарственной формы ормустина — «Ормустин лиофилизат для приготовления раствора для инъекций» — на мышах с перевиваемыми лимфолейкозами.
Материалы и методы
В работе были использованы мыши-гибриды первого поколения (C57B1/6 х DBA/ 2) F1 (B6D2F1) массой 18—25 г. Животные были получены из филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства». Мыши содержались в экспериментально-биологической лаборатории (виварий) ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России на брикетированном корме, с постоянным доступом к воде и в помещении с дневным освещением и контролем температуры и влажности воздуха.
Все экспериментальные процедуры с мышами проводились в соответствии с принятыми в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России правилами работы с животными, которые соответствуют международным и российским нормам.
Штаммы опухолей лимфолейкоз L1210 и лимфолей-коз P388 были получены из Банка опухолевых штаммов ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Штаммы сублиний лимфолейкоза L1210 с индуцированной устойчивостью к аранозе ^1210/араноза) или нитруллину (новое название — «Лизомустин») (L1210/ нитруллин) были получены Н.М. Перетолчиной в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей (ЭДиТО) ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России и любезно предоставлены автором для проведения данного исследования. Субштаммы L1210/араноза и L1210/нитруллин описаны и охарактеризованы в ряде публикаций [3, 26—27]. Штаммы перевиваемых опухолей поддерживались in vivo на мышах линии D2. В опытах использовались 2-10-й пассажи.
Оценку потенциальной противоопухолевой активности ормустина проводили на мышах B6D2F1 с асцитными (L1210, L1210/араноза, L1210/нитруллин и P388) и солидными (P388) формами лимфолейко-зов. Опухоли перевивали лабораторным животным по стандартным методикам [17]. Затем методом случайного выбора формировали контрольную (8—12 животных) и опытные группы (по 6—8 мышей).
В работе были использованы препараты из группы производных НАМ:
— «Ормустин лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 125 мг» (лекарственная форма
Оригинальные статьи 27
создана в лаборатории разработки лекарственных Излеченными считали мышей, которые прожили форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохи- 90 дней после прививки им опухоли и у которых при на» Минздрава России [28]); вскрытии не выявлено признаков опухолевого про— «Араноза лиофилизат для приготовления рас- цесса [29]. твора для инъекций 500 мг» производства филиа- Критериями оценки противоопухолевого эффек-ла «Наукопрофи» ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» та препарата также служили объем асцитной жидко-Минздрава России; сти и масса внутрибрюшинных опухолевых узлов — «Лизомустин лиофилизат для приготовления при асцитном варианте лимфолейкоза. раствора для инъекций 0,1 г» производства ООО Токсичность препаратов оценивали по гибели «Компания «Деко»» (Москва). мышей в опытной группе по сравнению с гибелью Растворы препаратов в глюкозе (декстроза 5 % животных в контрольной группе и макроскопиче-раствор для инфузий производства ООО «МОСФАРМ», ской картине внутренних органов, а также по сниже-Россия) готовили ex tempore. нию массы тела более чем на 20 %. Лечение мышей начинали через 24 ч после при- Статистический анализ полученных данных про-вивки лейкозов внутрибрюшинно и через 48 ч после водили с использованием программ Microsoft Excel, прививки P388 подкожно согласно «Методическим Statistica v. 6.0; использовали t- и непараметрический рекомендациям по доклиническому изучению про- критерий Колмогорова — Смирнова. Различия счи-тивоопухолевой активности лекарственных средств» тали статистически достоверными прир <0,05. [17]. Препараты в широком диапазоне доз вводили мышам с лимфолейкозами однократно внутривенно Результаты и обсуждение (в вену хвоста по 0,1—0,35 мл раствора / мышь), т. е. Анализ прогностической значимости используе-в соответствии с режимом, который применяется мых для скрининга моделей показал, что, несмотря в клинической практике для данной группы проти- на ряд ограничений, перевиваемые лимфолейкозы воопухолевых соединений [2]. В ряде экспериментов L1210 и P388 мышей, дополненные другими in vivo параллельно определяли влияние растворителя и in vitro моделями, позволяют выявлять большинство на рост перевиваемых опухолей: всем мышам из этой потенциально эффективных препаратов для лечения группы в том же режиме (однократно внутривенно) онкологических больных. Поэтому они продолжают вводили 5 % раствор глюкозы в объеме, равном мак- оставаться значимыми для скрининга потенциальных симальному объему (0,2—0,35 мл) раствора препара- противоопухолевых соединений [30, 31]. та, который был инъецирован животному, леченному Оценку противоопухолевой активности ормустина максимальной для данного опыта дозой ормустина. проводили на мышах B6D2F1 с асцитными вариан- Критериями оценки количества асцитной жид- тами лимфолейкозов P388 и L1210 (чувствительного кости и внутрибрюшинных опухолевых узлов при ас- и субштаммов с индуцированной устойчивостью: цитной форме лимфолейкоза Р388 являлись: L1210/араноза, L1210/нитруллин) и солидной формой — количество асцита: 1,0—1,5 мл+++; 0,5—1,0 мл++ P388. и 0,1—0,5 мл+; Была выявлена высокая противоопухолевая ак- — масса опухолевых узлов: 1,5—2,5 г+++; 1,0—1,5 г++ тивность ормустина при лечении мышей с переви-и 0,5—1,0 г+. ваемыми лимфолейкозами (табл. 1—4). Как видно из Наблюдение за животными продолжали до их ги- табл. 1, однократное внутривенное введение орму-бели. стина в диапазоне доз от 50 до 175 мг/кг мышам- Критериями оценки противоопухолевого эффек- самкам B6D2F1 с лимфолейкозом L-1210 вызывало та служили: увеличение продолжительности жизни не только высокое дозозависимое увеличение про-(УПЖ, %) опытных мышей в сравнении с контроль- должительности их жизни, но и привело к излечению ными и их излечение. части животных. Так, если в дозе 50 мг / кг ормустин Увеличение продолжительности жизни вычисля- вызывал только УПЖ на 70 %, то при дозах препарата ли по формуле 100—125 мг/кг выявлено и сильное УПЖ (242—346 %), и излечение большой части (50—67 %) мышей. В бо-УПЖ = [(СПЖо - СПЖк) / СПЖк] х 100, лее высоких (135-175 мг/кг) дозах ормустин вызывал хотя и значительное излечение (в 44-75 % случаев) где СПЖк и СПЖо — средняя продолжительность мышей с лимфолейкозом L-1210, но и их гибель жизни животных в днях в контрольной и опытной в 22-25 % случаев, т. е. выявленный на этой модели группах, соответственно. Минимальным критерием опухоли интервал терапевтических доз ормустина активности является УПЖ 50 % и более [29]. СПЖ является узким (табл. 1). и УПЖ рассчитывали только для животных, прожив- Аналогичные результаты были получены и при ис-ших менее 90 дней. следовании влияния ормустина в широком диапазоне
2'2016 ТОМ 15 1 VOL.15 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BIOTHERAPY
28 Оригинальные статьи
Таблица 1. Зависимость противоопухолевого эффекта ормустина от дозы при однократном внутривенном введении препарата мышам с Ь-1210
Группа Доза, мг/кг СПЖ, дни УПЖ, %* Излечение** Гибель от токсичности*** Асцит Узлы
Контроль - 7,1 ± 1,1 — - - + ++
5% раствор глюкозы 0,2 мл 7,3 ± 1,4 3 0/8 0/8 + ++
50 12,1 ± 1,4 70 0/8 0/8 + ++
100 24,3 ± 9,0 242 4/8 (50)* 0/8 + ++
Ормустин 125 31,7 ±13,3 346 6/9 (67)* 0/9 ++ ++
135 - - 6/9 (67)* 2/9 (22) ++ ++
150 - - 4/9 (44)* 2/9 (22) ++ ++
175 - - 6/8 (75)* 2/8 (25) 0 0
* р < 0,05 (достоверность различий с контрольной группой — t-критерий);
**в числителе дано число излеченных мышей, в знаменателе — общее число животных в группе, в скобках — процент излеченных животных; ***в числителе дано число погибших мышей от токсичности, в знаменателе — общее число животных в группе, в скобках — процент погибших животных.
Здесь и в табл. 2: СПЖ — средняя продолжительность жизни животных, УПЖ — увеличение продолжительности жизни животных.
Таблица 2. Зависимость противоопухолевого эффекта ормустина от дозы при однократном внутривенном введении препарата мышам с Р388 (асцитный вариант)
Группа Доза, мг/кг СПЖ, дни УПЖ, %* Излечение** Гибель от токсичности*** Асцит Узлы
Контроль - 9,7 ± 1,0 - - - +++ +++
5% раствор глюкозы 0,35 мл 9,9 ± 2,1 3 0/9 0/9 +++ +++
50 18,2 ± 1,8 90 0/9 0/9 ++ ++
100 26,7 ± 6,7 178 2/9 (22) 0/9 ++ ++
Ормустин 125 26,3 ± 2,7 174 3/9 (33)* 0/9 ++ ++
135 26,4 ± 4,0 175 3/9 (33)* 1/9 (10) ++ ++
150 25,4 ± 2,9 165 2/8 (25)* 2/8 (25) ++ ++
175 38,0 ± 3,3 186 3/9 (33)* 2/9 (22) ++ ++
*р <0,05(достоверностьразличий с контрольной группой — t-критерий);
**в числителе дано число излеченных мышей, в знаменателе — общее число животных в группе, в скобках — процент излеченных животных; ***в числителе дано число погибших мышей от токсичности, в знаменателе — общее число животных в группе, в скобках — процент погибших животных.
Таблица 3. Изменение массы тела мышей с Р388 (асцитный вариант) после однократного введения ормустина
Доза, мг/кг Масса тела**, г Гибель от токсичности***
исходная после лечения
на 6-й день на 8-й день
Контроль 50 100 125 135 150 175
19,7 ± 1,4
21.4 ± 1,9 20,1 ± 0,6
19.0 ± 1,3
18.5 ± 1,1
21.1 ± 1,6 19,9 ± 0,7
21,0 ± 1,5 20,0 ± 1,0 19,7 ± 0,8 19,0 ± 1,3 16,4 ± 1,2 (13) 16,4 ± 1,8 (22)* 15,1 ± 1,1 (24)*
19,9 ± 2,2 20,8 ± 1,0 19,7 ± 0,8 19,0 ± 0,8
18.5 ± 1,3
17.6 ± 2,2 17,2 ± 1,7
0/9 0/9 0/9 0/9 1/9 (10) 2/8 (25) 2/9 (22)
*р <0,05 (достоверность различий с контрольной группой — t-критерий)
**уменьшение средней массы тела мышей в группе по отношению к исходной средней массе тела, в скобках указано в процентах;
***в числителе дано число погибших мышей от токсичности, в знаменателе — общее число животных в группе, в скобках — процент погибших
животных.
Таблица 4. Зависимость противоопухолевого эффекта ормустина от дозы при однократном внутривенном введении препарата мышам с Р388 (солидный вариант)
Группа Доза, мг/кг СПЖ, дни УПЖ, %* Излечение** Гибель от токсичности***
Контроль - 17,5 ± 1,7 - - -
Ормустин 75 37,2 ± 10,5* 112 1/7 (14) 0/7
100 44,8 ± 9,0* 156 3/7 (43) 0/7
125 40 - 6/7 (86) 0/7
*р <0,05 (достоверностьразличий с контрольной группой по критерию Колмогорова—Смирнова);
**в числителе дано число излеченных мышей, в знаменателе — общее число животных в группе, в скобках — процент излеченных животных; ***в числителе дано число погибших от токсичности мышей, в знаменателе — общее число животных в группе.
■
■
доз (от 50 до 175 мг / кг) на рост лимфолейкоза Р388, привитого мышам-самкам В6Б2Р1 (С57В1/6 х ВВЛ/2) внутрибрюшинно (табл. 2). Как и в случае с лим-фолейкозом Ь-1210, была выявлена зависимость терапевтического эффекта от дозы препарата: в более низкой дозе (50 мг / кг) отмечено только УПЖ на 90 %, в дозах 100—125 мг/кг — высокий уровень УПЖ и излечение значительной части мышей. Высокая противоопухолевая активность ормустина в дозах 135 мг/кг и выше сопровождалась дозозависимой гибелью животных с признаками токсического действия препарата (табл. 2 и 3).
Проявления токсического действия ормустина оценивались при сравнении сроков гибели животных и динамики изменения средних масс тела мышей в контрольной и опытных группах (табл. 1—3). Данные, представленные в табл. 3, показывают, что однократное внутривенное введение мышам с асцит-ным вариантом Р388 ормустина в дозах 50—125 мг/кг не вызывало более ранней, чем в контрольной группе, гибели животных, а изменения средней массы тела в этих группах были практически сходными с таковыми в контрольной группе. Масса тела мышей с Р388 при внутривенном однократном введении ормустина в дозе 135 мг/кг, вызывающей гибель 10 % животных, упала на 6-й день наблюдения на 2,1 г, а к 8-му дню восстановилась. Ормустин в дозах 150 мг/кг и выше имел выраженное токсическое действие: в 22—25 % случаев более ранняя, чем в контрольной группе, гибель мышей, резкое падение средней массы тела на 4,6—4,8 г (22—24 % по сравнению с исходной) к 6-му дню после окончания введения препарата и постепенное ее увеличение к 8-му дню.
Таким образом, при однократном внутривенном введении ормустина мышам с перевиваемыми асцит-ными лимфолейкозами доза 125 мг/кг является терапевтической, 135 мг/кг — максимально переносимой (ЬБ10), а 150 кг/кг — летальной (ЬБ25).
Ормустин проявил высокий противоопухолевый эффект и при лечении мышей-самцов В6Б2Б1 с лим-фолейкозом Р388 (солидный вариант). При введении препарата также показана зависимость продолжи-
тельности жизни опытных мышей от дозы препарата (табл. 4). В контрольной группе у всех животных развились подкожные опухолевые узлы, и к 20-м сут опыта все мыши погибли при явлениях генерализованного опухолевого процесса. При этом не представилось возможным оценить активность препарата при сравнении средних объемов подкожных опухолевых узлов в контрольной и опытных группах, так как ормустин не только значительно увеличивал латентное время развития опухоли, но и сдерживал развитие опухолевых узлов у значительной части мышей в опытных группах в течение 90 дней наблюдения. Эти мыши считались излеченными [29].
Так как для препаратов из группы производных НАМ показано достаточно быстрое развитие резистентности к их действию и отсутствие полной перекрестной устойчивости, особый интерес вызывает способность новых соединений преодолевать подобные осложнения [3, 26, 27]. Было исследовано противоопухолевое действие ормустина на мышах-самцах ВБР1 с перевиваемым лимфолейкозом Ь-1210 с индуцированной устойчивостью к аранозе (Ь-1210/ара-ноза) и Ь-1210, наработанной устойчивостью к лизому-стину (Ь-1210 / нитруллин), которые имеют различные механизмы устойчивости [26].
В условиях организма для НАМ характерна реакция гидролитического распада с образованием алки-лирующих и карбамоилирующих частиц. Взаимодействие этих частиц с макромолекулами, такими как ДНК, РНК, ДНК- и РНК-полимеразы, цитоплазма-тические и ядерные белки, белковые компоненты клеточных мембран, обусловливают молекулярные механизмы биологического действия НАМ. Результаты многих исследований свидетельствуют о том, что образование в ДНК аддуктов О6-алкилгуанина и длительность существования этой модификации в значительной степени определяют цитоксичность НАМ [30].
ДНК-репарирующий акцепторный белок О6-ал-килгуанин-ДНК алкилтранфераза (О6-метилгуа-нин-ДНК метилтранфераза, МОМТ; ЕС 2.1.1.63) репарирует аддукты О6-алкилгуанина в ДНК, и уровень его активности коррелирует с чувствительностью
30
Оригинальные статьи
УПЖ -4%
УПЖ 10%
УПЖ
2%
УПЖ -7%
Контроль Ормустин Ормустин Ормустин Араноза Араноза 100 мг/кг 125 мг/кг 135 мг/кг 180 мг/кг 360 мг/кг
* 8-
УПЖ -8%
УПЖ -5%
УПЖ -6%
УПЖ -2%
УПЖ -2%
Контроль Ормустин 100 мг/кг
Ормустин 125 мг/кг
Ормустин 135 мг/кг
Лизомустин Лизомустин 80 мг/кг 150 мг/кг
Рис. 3. Влияние ормустина на продолжительность жизни мышей с лимфолейкозом Ь1210/нитруллин
14
10
8
6
6
О 4
4
2
0
0
Рис. 2. Влияние ормустина на продолжительность жизни мышей с лимфолейкозом Ь1210/араноза
клеток к цитотоксическому действию НАМ. Существует множество экспериментальных и клинических данных о том, что высокий уровень экспрессии MGMT в клетках опухоли приводит к резистентности химиотерапии НАМ [4].
Было выявлено значительное увеличение уровня M GMT в субштамме L-1210 / араноза по сравнению с чувствительным штаммом L-1210, которое, по-видимому, играет существенную роль в возникновении индуцированной устойчивости к аранозе [9].
Но существенных различий в уровнях MGMT в клетках чувствительного штамма L-1210 и клетках субш тамма L-1210 / нитруллин не выявлено, и было признано маловероятным, что эти различия ответственны за возникновение устойчивости к нитруллину [26]. В клетках субштамма L-1210/нитруллин было обнаружено менее глубокое, чем в клетках чувствительного штамма L-1210, ингибирование и существенно более быстрое восстановление синтеза ДНК и РНК, повышение активности основного фермента репарации ДНК полимеразы ß, увеличение уровня SH-групп. Такие различия в скорости репарации повреждений ДНК и могут обусловливать возникновение лекарственной устойчивости к нитруллину [26].
Араноза, которая обладает высоким противоопухолевым эффектом при лечении мышей с чувствительным штаммом L-1210 [2], ни в дозе 180 мг/кг (1/2 максимальной переносимой дозы, МПД), ни в дозе 360 мг/кг (близкой к МПД) не увеличивала продолжительности жизни мышей с L-1210/араноза (рис. 2). Ормустин в дозах 100—135 мг/кг также не проявил противоопухолевой активности у мышей с L-1210/ араноза (рис. 1).
Лизомустин, который обладает высоким противоопухолевым эффектом при лечении мышей с чувствительным штаммом L-1210 [3, 26], ни в дозе 80 мг/кг (доза, которая была использована при индукции устойчивости [12]), ни в МПД (150 мг/кг) не оказал влияния на продолжительность жизни мышей
с Ь-1210/нитруллин (рис. 3). Ормустин в дозах 100— 135 мг/кг также не проявил противоопухолевой активности у мышей с Ь-1210 / нитруллин.
Таким образом, ормустин в изученных дозах и режиме введения не проявил противоопухолевой активности при лечении мышей с лейкозами с индуцированной устойчивостью к аранозе или лизомустину. Ранее было показано [3, 26, 27], что противоопухолевое действие лизомустина на этих субштаммах тоже невысоко (отсутствие такового при Ь1210/ни-труллин, а при Ь1210 / араноза — только незначительное УПЖ) [3]. Возможно, что такое снижение эффективности лизомустина на этом субштамме (по сравнению с чувствительным штаммом Ы210) обусловлено высоким уровнем экспрессии МОМТ в Ы210 / араноза [26].
Полученные результаты позволяют предположить, что механизмы развития лекарственной устойчивости к ормустину и лизомустину сходны.
Заключение
Проведенные исследования показали высокую дозозависимую противоопухолевую активность ормустина на асцитных формах лимфолейкозов Ы210 и Р388 с излечением мышей в 67 и 33 % случаев соответственно. Ормустин проявляет еще более высокий противоопухолевый эффект при лечении мышей с солидной формой лимфолейкоза Р388 — излечение наблюдается в 86 % случаев. Кроме того, на Ы210 и Р388 установлена терапевтическая доза ормустина, которая составляет 125 мг/кг при однократном внутривенном его введении.
Однако выявлена перекрестная устойчивость ормустина на мышах с перевиваемым лимфолейко-зом Ы210 с индуцированной устойчивостью к аранозе (Ь1210/араноза) и Ь1210 с наработанной устойчивостью к лизомустину (Ь-1210/нитруллин), которые обладают разным механизмом устойчивости.
Оригинальные статьи 31
ЛИТЕРАТУРА I REFERENCES
1. Краснов В.П., Чупахин О.Н., Левит Г.Л. и др. Химические аспекты создания оригинального противоопухолевого препарата лизомустин. В кн.: Экспериментальная онкология на рубеже веков. Под ред. М.И. Давыдова
и А.Ю. Барышникова. М.: Изд-е РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2003:135-46.
2. Переводчикова Н.И. Клинико-фармакологическая характеристика противоопухолевых средств. В кн.: Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний. Под ред. Н.И. Переводчиковой и В А. Горбуновой. М.: Практическая медицина, 2015:37-48.
3. Перетолчина Н.М., Герасимова ГК., Белоусова А. К., Барышников А.Ю. Доклиническое изучение противоопухолевой активности и механизма действия лизомустина. В кн.: Экспериментальная онкология на рубеже веков. Под ред. М.И. Давыдова
и А.Ю. Барышникова. М.: Изд-е РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2003: 147-60.
4. Сыркин А.Б., Горбачева Л.Б. Биохимические механизмы действия N-алкил-М-нитрозомочевин. Возможные причины лекарственной устойчивости к этим соединениям. Экспериментальная и клиническая фармакология 1996;59(2):69-75.
5. Poschke I., Mao Y., Kiessling R. et al. Tumor-dependent increase of serum amino acid levels in breast cancer patients has diagnostic potential and correlates with molecular tumor subtypes. J Transl Med 2013;16;11:290. doi: 10.1186/1479-5876-11-290. PMID:24237611.
6. Левит Г.Л., Радина Л.Б., Краснов В.П. и др. №«-Алкилнитрозокарбамоил-а, ю-диаминокарбоновые кислоты. II. Синтез и противоопухолевая активность нитрозопроизводных Nю-(2-хлорэтил)-карбамоил-а,ю-диаминокарбоновых кислот. Химико-фармацевтический журнал 1996;30(4):15-7.
7. Левит Г.Л., Радина Л.Б., Краснов В.П. и др. №ю-Алкилнитрозокарбамоил-а, ю-диамино-карбоновые кислоты. III. Синтез и противоопухолевая активность №-нигрозо-№-[№-(2-хлорэтил)карбамоил]-Ь-лизина и Ne-[N'-(2-хлорэтил)-№-нигрозокарбамоил]-Ь-ли-зина. Химико-фармацевтический журнал 1996;30(5):23-5.
8. Горбунова B.A., Манзюк Л.В., Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю. Лизомустин — отечественный препарат из группы производных нитрозомочевины в лечении меланомы кожи. Российский биотерапевтический журнал 2014;13(1):55—6.
9. Горбунова В .А., Семина О.В., Кадагидзе З.Г. и др. Нитруллин — новый оригинальный отечественный препарат из группы нитрозомочевины. Вопросы онкологии 2001;6:680-3.
10. Краснов В. П., Левит Г. Л., Барышникова М А. и др. Нитрозомочевины на основе аминокислот. Оригинальный противоопухолевый препарат Лизомустин. Российский биотерапевтический журнал 2013;12(2):46.
11. Majumdar R., Shao L., Minocha R. et al. Ornithine: The Overlooked Molecule in the Regulation of Polyamine Metabolism. Plant Cell Physiol 2013;54(6):990—1004. doi: 10.1093/pcp/ pct053. Epub 2013 9. PMID:23574701.
12. Pegg A.E., Casero RA. Current status
of the polyamine research field. Methods Mol Biol 2011;720:3-35. doi: 10.1007/978-1-61779-034-8_1. PMID:21318864.
13. Seidenfeld J., Sprague W.S. Comparisons between sensitive and resistant human tumor cell lines regarding effects of polyamine depletion on chloroethylnitrosourea efficacy. Cancer Res 1990; 1;50(3):521—6. PMID:2137022.
14. Wèbber M.M., Buffkin D.C., Juillard G.J-F. et al. Ornithine metabolism in normal subjects and patients with cancer. J Nucl Med 1980;21(12):1194—6. PMID:6777468.
15. Ikeguchi Y., Mackintosh CA., McCloskey D.E., Pegg A.E. Effect of spermine synthase on the sensitivity of cells to anti-tumour agents. Biochem J 2003; 1;373(Pt 3):885—92. PMID:12737625.
16. Manni A., Washington S., Mauger D et al. Cellular mechanisms mediating the anti-invasive properties of the ornithine decarboxylase inhibitor alpha-difluoromethylornithine (DFMO)
in human breast cancer cells. Clin Exp Metastasis. 2004;21(5):461—7. PMID:15672871.
17. Casero RA, Wbster P.M. Recent Advances in the Development of Polyamine Analogues
as Antitumor Agents. J Med Chem. 2009; 13;52(15):4551—73. doi: 10.1021/jm900187v. PMID: 19534534.
18. O'Shaughnessy JA, Demers L.M., Jones St.E. et al. a-Difluoromethylornithine as Treatment for Metastatic Breast Cancer Patients. Clin Cancer Res. 1999;5(11):3438—44. PMID:10589756.
19. Raul F. Revival of 2-(difluoromethyl)orni-thine (DFMO), an inhibitor ofpolyamine biosynthesis, as a cancer chemopreventive agent. Biochem Soc Trans. 2007;35(Pt 2):353—5. PMID:17371277.
20. Medina-Enriquez M.M., Alcantara-Farfan V., Aguilar-Faisal L. et al. N-ra-chloroacetyl-l-ornithine, a new competitive inhibitor of ornithine decarboxylase, induces selective growth inhibition and cytotoxicity on human cancer cells versus normal. J Enzyme Inhib Med Chem. 2015;30(3):345—53. doi: 10.3109/14756366.2014.926342. Epub 2014 Jun 18. PMID:24939101.
21. Hung D.T., Oredsson S.M., Pegg A.E. et al. Potentiation of 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitro-sourea cytotoxicity in 9L rat brain tumor cells by methylglyoxal-bis(guanylhydrazone), an in-
hibitor of S-adenosyl-L-methionine decarboxylase. Eur J Cancer Clin Oncol. 1984;20(3):417-20. PMID:6538500.
22. Hunter K.J., Deen D.F., Pellarin M., Marton L.J. Effect of alpha-difluoromethylorni-thine on 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea and cis-diamminedichloroplatinum(II) cytotox-icity, DNA interstrand cross-linking, and growth in human brain tumor cell lines in vitro. Cancer Res. 1990; 1;50(9):2769-72. PMID:2109657.
23. Wlff S., Feeney L., Afzal V. Depletion of cellular polyamines by alpha-difluoromethylorni-thine increases 1,3-bis (2- chloroethyl)-1-nitro-sourea-induced sister-chromatid exchanges. Mutat Res 1993;289(1):107-14. PMID:7689156.
24. Барышникова М А, Альбассит Б., Сапрыкина Н.С. и др. Противоопухолевая активность нового соединения из класса нитрозоалкилмочевин. Российский биотерапевтический журнал 2013;12(2):8.
25. Грищенко И.В., Альбассит Б., Барышникова М А и др. Сравнение цито-токсического действия двух лекарственных форм противоопухолевых препаратов
из класса нитрозомочевины. Российский биотерапевтический журнал 2014;13(1):49-54.
26. Горбачева Л.Б., Дедерер Л.Ю. Исследование механизмов лекарственной устойчивости к нитруллину (лизомустину). Российский биотерапевтический журнал 2005;4(3):42-7.
27. Перетолчина Н.М., Семина О.В. Араноза - новый отечественный противоопухолевый препарат из группы нитрозо-мочевины. В кн.: Экспериментальная онкология на рубеже веков. Под ред. М.И. Давыдова и А.Ю. Барышникова. М.: Изд-е РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2003:201-14.
28. Николаева Л.Л., Ланцова А.В., Санарова Е.В. и др. Парентеральная лекарственная форма нового соединения из класса алкилнитрозомочевины. Российский биотерапевтический журнал 2015;14(1):113.
29. Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К. и др. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств . Под ред. А.Н. Миронова и др. М.: Гриф и К, 2012:640-54.
30. Bibby M.C. Making the most of rodent tumour systems in cancer drug discovery. Br J Cancer 1999;79(11-12):1633-40. PMID:10206270
31. Marsh J.C., Shoemaker R.H., Suffness M. Stability of the in vivo P388 leukemia model in evaluation of antitumor activity of natural products. Cancer Treat Rep 1985;69(6):683-5. PMID:4016772.
