CC BY
145
84
Дискуссионные и общетеоретические работы
ДИСКУССИОННЫЕ И ОБЩЕТЕОРЕТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Сравнительное протеомное картирование опухолевых стволовых клеток, выделенных из глиобластомы линии u87, нейрональных стволовых и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека: от каталогизации клеточных белков к инновационной парадигме протеом-основанной клеточной терапии опухолей
A. С. Брюховецкий 1 2 В.Е. Шевченко 3, В.П. Чехонин 4, И.С. Брюховецкий 5, С.В. Ковалев 3,
B. П. Баклаушев 4, М.И. Давыдов 3
1 Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий ФМБА России, Москва
2 Клиника восстановительной и интервенционной неврологии и терапии «Нейровита», Москва
3 Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
4 Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского, Москва
5 Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток
Comparative proteome mapping of tumor stem cells isolated from U87 glioblastoma, neural stem
and multipotent mesenchymal stromal cells of a human: from cataloguing of cell proteins to novel paradigm
of proteome-based cell therapy of tumors
A.S. Bryukhovetskiy1-2, V.E. Shevchenko 3, VP. Chekhonin 4, IS. Bryukhovetskiy 5, S.V. Kovalev3,
VP. Baklaushev 4, M.I. Davydov 3
1 Federal Research Center for Specialized Types of Medical Assistance and Medical Technologies of FMBA of Russia, Moscow
2 «NeuroVita» Clinic of Restorative and Interventional Neurology and Therapy, Moscow
3 Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMN, Moscow
4 Serbski State Research Center of Social and Forensic Psychiatry, Moscow 5Zhirmunski Institute of Sea Biology of DVO RAN, Vladivostok
Проведено протеомное картирование и биоинформационный анализ лизатов нейральных (CD133+) стволовых клеток (НСК), выделенных из обонятельной выстилки носа человека, мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD34-) (ММСК), полученных из костного мозга человека, и опухолевых (CD133+) стволовых клеток (ОСК), изолированных из культуры клеточной линии U87 глиобластомы человека (глиомасферы). Идентифицированы 1664 белка в изученных лизатах стволовых клеток, из которых 1052 белка (63,2%) идентичны в НСК и ОСК и 607 белков (36,47%) подобны в ММСК и ОСК. Остальные белки в ОСК глиобластомы U87 являются онкоспецифичными или связанными с процессами канцерогенеза. Для белков, присутствующих во всех трех протеомах, с помощью баз данных PubMed, PANTHER, Gene Ontology и KEGG провели аннотирование биологических процессов, молекулярных функций, клеточной локализации и сигнальных путей белков. Выявили, что в глиомасферах глиобластомы линии U87 только 10 внутриклеточных путей сигнальной трансдукции
e-mail: neurovita-as@mail.ru
We performed proteome mapping, cataloguing and bioinformation analysis of protein lysates of human neural (CD133+) stem cells (NSC) isolated from olfactory sheath of a nose, multipotent mesenchymal (CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD34-) stromal cells (MMSC) isolated from human bone marrow and tumor (CD133+) stem cells (TSC) isolated from the human U87 glioblastoma cell line. We identified 1664 proteins in the examined lysates of stem cells (SC), 1052 (63.2%) of which are identical in NSC and TSC and 607 proteins (36.47%) are identical in MMSC and TSC. Other proteins in U87 glioblastoma TSC are oncospecific or carcinogenesis associated. The biological processes, molecular functions, cell localization and protein signal pathways of the proteins available in all three proteomes were annotated by PubMed, PANTHER, Gene Ontology and KEGG databases. It was shown that gliomaspheres of U87 glioblastoma had only 10 intracellular pathways of signal transduction (IPST) that were not modified by neoplastic process, but only two of them (integrin and focal adhesion pathways) were accessible for regulatory action on gene
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
Дискуссионные и общетеоретические работы
85
практически не изменены неопластическим процессом, и только 2 из них (путь интегринов и путь фокальной адгезии) доступны для регуляторного воздействия на гены-мишени в ядре ОСК. Мембранные белки неизмененных канцерогенезом внутриклеточных путей сигнальной транс-дукции и гены, кодирующие белки этих путей в ОСК глиобластомы линии U87, могут рассматриваться в качестве основных целей для регуляторного воздействия на ОСК. Предложена инновационная концепция протеом-основан-ной клеточной терапии опухолей.
Ключевые слова: нейральные стволовые клетки, мультипотентные мезенхимные стромальные клетки, опухолевые стволовые клетки, глиобластома человека линии U87, протеомное картирование, протеом-основанная клеточная терапия опухолей.
После завершения в 2005 г. глобального и амбициозного международного проекта «Геном человека» [1, 2] стало очевидно, что, несмотря на получение огромного количества фундаментальных знаний о молекулярном устройстве человеческого генома, эти знания, к сожалению, не позволили ответить на основные вызовы современной медицинской науки и практического здравоохранения, а также предложить эффективные инновационные стратегии терапии основных болезней цивилизации (рак и другие злокачественные опухоли, диабет, СПИД, ожирение, дегенеративные нервные болезни и т.д.) [3, 4]. Все взоры передовой научной общественности от геномики повернулись в сторону инновационных технологий многомерной биологии: протеомики, ме-таболомики, РНомики, секретомики и т.д. [4]. Наступившую эру ученые назвали постгеномной [5] и предложили создать не менее грандиозный международный проект «Протеом человека», в рамках которого исследователи попытаются картировать и изучить функции всех белков, имеющихся в клетках эукариот [6, 7]. Страны-участницы будущего проекта «Протеом человека» уже распределили объемы работ в будущих исследованиях [8, 9] и России предложили участие в нем по изучению белков, кодируемых генами 18 хромосомы [5, 10]. Однако пока не очень понятны прикладные цели использования этой новой «протеомной» информации в медицине и, крайне важно, чтобы эта генерация знаний имела изначально не только фундаментальное, но и четкое прикладное значение для практического здравоохранения. Необходимо помнить, что новые знания в области протеомики, с одной стороны, не должны формировать необоснованных надежд у врачей и не создавать иллюзий о протеомике, как панацее. С другой стороны, необходимо понимать, что только протеомные исследования способны с инновационных биотехнологических и информационных позиций предоставить уникальные знания о молекулярных механизмах патогенеза большинства неизлечимых болезней цивилизации. Протеомика не должна повторить методологических ошибок геномики. Поэтому при организации и планировании протеомных исследований, включающих ткани, клетки и биологические жидкости (кровь, плазма, лимфа, ликвор и т.д.) целесообразно понимать, как будет в дальнейшем использована эта информация в диагностических, прогностических или терапевтических целях [8, 9].
Целью исследования являлось проведение про-теомного картирования лизатов глиомасфер, выде-
candidates in TSC nucleus. Carcinogenesis free membrane proteins, intracellular pathways of signal transduction and genes expressing proteins of these pathways in U87 glioblastoma TSC can be viewed as main targets for regulatory effect on TSC. We offer a novel concept of proteome-based complex therapy of tumors.
Key words: neural stem cells, mesenchymal stem cells, tumor stem cells, U87 glioblastoma, proteome mapping, proteome-based therapy of tumors.
ленных из глиобластомы линии U87, и сравнение их с клеточными белками, обнаруженными в протеомах нейральных стволовых клеток (НСК) и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) нейроонкологических пациентов (контроль нормы), для выявления специфичной неопластической про-теомной структуры опухолевых стволовых клеток (ОСК), диагностики и анализа внутриклеточных путей сигнальной трансдукции (ВКПСТ) в ОСК, не пострадавших в процессе канцерогенеза, а также поиск мембранных белков — мишеней ВКПСТ ОСК для проведения регуляторного целенаправленного воздействия на эффекторные функции ОСК в клеточной терапии опухолей.
Материал и методы
Методика получения клеток
После получения письменного информированного согласия нейроонкологических пациентов эксплантацию костного мозга проводили методом пункции грудины или подвздошной кости в условиях процедурного кабинета под местным обезболиванием либо в условиях операционной под наркозом с максимально возможным соблюдением стерильности. Минимальный объём костного мозга для выделения ММСК — 5 мл. Пунктат костного мозга сразу же помещали в стерильную пробирку типа «Vacuette», содержащую антикоагулянт (№2ЭДТА).
Выделение и культивирование ММСК. ММСК выделяли из костного мозга методом, описанным ранее [11]. Образец костного мозга ресуспенди-ровали в среде RPMI-1640, гадержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% раствора пенициллина-стрептомицина. Культивирование проводили во флаконах Т150, при 37°С, в атмосфере 5% CO2. Через 4—5 сут. удаляли среду с не прикрепившимися клетками, заменив ее свежей средой. Прикрепившиеся клетки культивировали до достижения 80% конфлюэнтности, затем пассировали из расчета 1:3. Смену культуральной среды проводили каждые 3 сут. ММСК характеризовали с помощью проточной цитометрии по экспрессии поверхностных антигенов: CD29 + , CD44+, CD73 + , CD90 + , Сй34-..
Выделение и культивирование ОСК. Стволовые клетки опухоли мозга выделяли из культуры клеток глиобластомы человека U87 методом, описанным ранее [12]. Клетки глиобластомы U87 суспендировали с помощью раствора диспазы/коллагеназы (Roche) (Dispase, 0,8 U/ml PBS; Collagenase, 0,1 U/ ml PBS; инкубация 1 ч, 37°С). Затем инактивировали энзиматическую реакцию EDTA, центрифугировали
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
86
Дискуссионные и общетеоретические работы
5 мин. при 800 g. Ресуспендировали клетки опухоли в среде, применяемой для образования нейросфер (DMEM/F12; L-glutamine; B27; bFGF, 20ng/ml; EGF, 20 ng/ml; Penicillin/Streptomycin, 100 U/ml; Heparin, 5 yug/ml). Культивирование проводили во флаконах Т75, при 37°С, в атмосфере 5% CO2. Добавление свежих ростовых факторов проводили каждые 3 сут. Прикрепившиеся клетки культивировали до достижения 80% конфлюэнтности, затем пассировали из расчета 1:3. При достижении достаточного общего количества клеток проводили селекцию CD133+-клеток методом иммуносортинга с использованием магнитных шариков с иммобилизованными на них антителами к CD133 (Miltenyi Biotec). После этого культивировали CD133+-клетки в той же среде. «Чистоту» культуры оценивали с помощью проточной цитометрии с антителами к CD133.
Выделение НСК. После получения письменного информированного согласия пациента, эндоскопически забирали фрагмент 1x1 см обонятельной выстилки из верхнего носового хода. НСК выделяли из эксплантированного фрагмента обонятельного эпителия по методике, описанной ранее, с использованием иммуносепарации на магнитных шариках по CD133 [13, 14]. Клетки культивировали в среде DMEM c 10% FBS и коктейлем ростовых факторов (Invitrogen, США) до образования цитосфер. Клетки цитосфер характеризовали по экспрессии нестина, Thy1, NF200 и GFAP с помощью иммуноцитохимического анализа.
Протеомные исследования
Анализ литературных данных показал, что для картирования протеома НСК, ММСК, а также ОСК линии глиобластомы человека U87 чаще использовались методы двумерного гель-электрофореза [1519] или жидкостной хроматографии [20—24] в сочетании с масс-спектрометрией. Гель-электрофорез больше подходит для выявления дифференциально экспрессированных белков, чем для картирования протеома, поэтому мы остановились на комбинации высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС). Использование двумерной хроматографии позволяет идентифицировать порядка 1000 белков в образце (от 867 [22] до 1002 [18]), поэтому мы выбрали использовавшуюся в цитируемых работах методологию двумерного разделения триптических петидов на катионообменной, а затем обращено-фазовой колонке. Для оценки изменения экспрессии уровней белков мы использовали метод label-free, так как он не требует проведения дополнительных стадий мечения пептидов, и показано, что он дает корректные количественные результаты для стволовых клеток [22, 23]. Получили клетки, замороженные в малом количестве фосфатного буфера (PBS). После размораживания клетки подвергли лизированию при помощи Mammalian Cell Lysis Kit Sigma.
визирование полученных клеток. Готовили 1 мл лизирующего буфера. Для этого смешивали 200 мкл буфера (250 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 5мМ EDTA); 200 мкл 750 мМ NaCl; 200 мкл 0,5% SDS (Lauryl sulfate); 200 мкл 2,5% DOC (Deoxycholic acid); 200 мкл 5% Igepal; 10 мкл коктейля ингибиторов протеаз. Все процедуры выполнялись при температуре 4°С. К клеткам добавляли 1 мл лизирующего буфера. Инкубировали в течение 15 мин. в охлаждаемом
шейкере Eppendorf Thermomixer Comfort. Центрифугировали в течение 1 ч в охлаждаемой центрифуге Eppendorf Centrifuge 5415 F. Супернатант отбирали для дальнейшего исследования.
Очистка от низкомолекулярных соединений. Полученные в результате лизиса образцы очищали от низкомолекулярных соединений при помощи Agilent Spin Concentrators for Proteins 5 kDa. Образец вносили в концентратор и центрифугировали при 2000g до того момента, как в резервуаре останется 200 мкл жидкости. Добавляли в концентратор 4 мл воды (Mili-Q) и снова центрифугировали. Такую промывку производили трижды. Полученные 200 мкл образца отбирали. Дополнительно образец смывался с концентратора дважды по 200 мкл воды (Mili-Q). Полученные в итоге 600 мкл образца использовали для дальнейшего исследования — измерения общего белка по методу Бредфорд. Рассчитывали количество лизата, в котором содержится 300 мкг белка, и выпаривали досуха при 60°С в вакуумном испарителе CentriVap.
Энзиматический гидролиз (трипсинолиз) образцов. К высушенным лизатам добавляли по 25 мкл трифторэтанола, по 25 мкл 100 мМ водного раствора NH4HCO3 и по 2 мкл свежеприготовленного 50 мМ водного раствора трис-(2-карбоксиэтил)фосфи-на (TCEP). Реакционную смесь выдерживали 1 ч при температуре 60°С, затем охлаждали до 25°С, добавляли по 1 мкл свежеприготовленного 84 мМ водного раствора иодацетамида, и выдерживали 30 мин при 25°С, после чего добавляли по 100 мкл 100 мМ раствора NH4HCO3, по 300 мкл воды и раствор трипсина в 1мМ соляной кислоте (концентрация трипсина 100 нг/мкл, соотношение трипсин:белок — 1:50 по весу) и выдерживали 18 ч при 37°С. По 3 мкл растворов анализировали масс-спектрометрически для контроля проведения трипсинолиза. По окончании реакции содержимое пробирок выпаривали досуха при 60°С на центрифужном испарителе.
Разделение триптических пептидов. Триптические пептиды растворяли в 60 мкл фазы А (30% ацетонитрила, 70% воды, 0.1% муравьиной кислоты, рН 2.7) и разделяли на хроматографе Dionex Ultimate 3000, снабженном коллектором фракций, на катионообменной колонке MIC-10-CP (материал Poros 10S, 1 мм x 10 см, Dionex). Объем инжектируемой пробы 20 мкл, поток растворителя 30 мкл/мин, температура колонки 25°С, детекция по УФ-поглощению при длине волны 214 нм. Растворители: мобильная фаза А — 30% ацетонитрила, 70% воды, 0,1% муравьиной кислоты, мобильная фаза В — мобильная фаза А + 500 мМ KCl. Градиент: 0—10 мин — 0% В, 10-100 мин - 0-30% В, 100-114 мин - 30-100% В, 114-119 мин - 100% В, затем уравновешивание колонки в течение 35 мин на фазе А. Собирали 20 фракций со 2 по 122 мин через равные промежутки времени в 6 мин. Полученные фракции выпаривали до 100 мкл при 60°С на центрифужном испарителе Eppendorf Concentrator 5301 (Германия).
Масс-спектрометрический анализ. Анализ триптических пептидов проводили на нанопроточном жидкостном хроматографе Dionex Ultimate 3000 (Dionex, Нидерланды) в сочетании с масс-спектрометром LTQ Orbitrap XL (Thermo) с источником ионизации NSI. Разделение пептидов осуществляли на колонке Acclaim C18 PepMap100 (75 мкм x 150 мм, размер зерна 3 мкм, Dionex), снабженной предколон-
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
Дискуссионные и общетеоретические работы
87
кой. Образец (20 мкл) загружали на предколонку на 1 мин в 99% воды/1% ACN/0,1% муравьиной кислоты, затем отмывали от соли 4 мин. 0,05% раствором трифторуксусной кислоты в воде, и еще 1 мин уравновешивали 99% воды/1% ACN/0,1% муравьиной кислоты, проток 20 мкл/мин. Условия хроматографирования: проток 0,3 мкл/мин, мобильная фаза А — 98% воды/2% ACN/0,1% муравьиной кислоты, мобильная фаза В — 20% воды/80% ACN/0,08% муравьиной кислоты. Градиент: 0—6 мин — 0% В, 6-120 мин - 0-50% В, 120-150 мин - 50-100% В, 150-165 мин - 100% В, 165-170 мин - 1000% В, полное время анализа 175 мин. Масс-спектры регистрировали в режиме положительных ионов в диапазоне m/z 300-2000 Да, напряжение на игле - 1,7 кВ, температура источника 200°С, напряжение на капилляре 43 В, на линзе 165 В. МС спектры регистрировали в орбитальной ловушке в режиме FT (разрешение 60 тыс., число накапливаемых ионов 1х106, максимальное время накопления - 700 мс, 1 микроскан), МС/МС спектры получали при ионизации, обусловленной соударениями (CID) в линейной ловушке (режим сканирования Enhanced, число накапливаемых ионов 50 тыс., максимальное время накопления - 500 мс,
3 микроскана, энергия соударений 35% от максимальной). МСМС спектры регистрировались для 7 самых интенсивных ионов. Динамическое исключение включалось после регистрации 1 спектра, время исключения - 1 мин. Вторичной фрагментации подвергали ионы с зарядом больше +1.
Анализ данных. Для идентификации белков масс-спектры конвертировали программой Proteome Discoverer 1.0 (Thermo, США) в mgf файлы с помощью программного шаблона WF_Spectrum_Export_ MGF c настройками по умолчанию за исключением диапазона времени удерживания (0-180 мин). Поиск белков проводили на локальном сервере с помощью программы Mascot Server 2.3.02 (Matrix Science, Великобритания). Параметры поиска: база данных NCBInr (версия от 25.01.2012 г.), вид -Homo Sapience, энзим - трипсин, число пропущенных разрывов 2, фиксированные модификации -карбамидометилирование, возможные модификации - ацетилирование N-конца белка и окисленный метионин, остальные модификации проверялись с помощью метода error tolerant search. Точность масс родительского иона 10 ppm, фрагментов 0,8 Да; прибор Ion Trap. Идентифицированные белки сортировали по MudPIT score, отображали пептиды на уровне значимости p<0,05. Полученные списки идентифицированных белков вместе с хроматомасс-спектрами загружали в программу Skyline 1.2.0.3303, и получали площади пиков пептидов в каждой пробе. Затем суммировали площади всех пиков идентифицированных пептидов каждого белка и нормализовывали относительно полной площади всех идентифицированных белков в пробе.
Результаты
После проведения лизиса количество общего белка в лизатах составило: НСК (Sample01) -2032±85 мкг/мл; ОСК из глиобластомы линии U87 (Sample02) - 2150±360 мкг/мл; ММСК костного мозга (Sample03) - 3198±281 мкг/мл. Для проведения трипсинолиза брали по 150 мкл лизатов Sample01 и Sample02 и 100 мкл Sample03, трип-
син добавляли в соотношении 1:50 по массе, т.е. Sample01 - 305 мкг белка, 61 мкл раствора трипсина, Sample02 - 323 мкг белка, 64,5 мкл раствора трипсина, Sample03 - 320 мкг белка, 64 мкл раствора трипсина. Полноту проведения трипсинолиза контролировали масс-спектрометрически по наличию пиков триптических пептидов, а также по площадям пиков с m/z 842.51 Да и 421,76 Да. Триптические пептиды разделяли на катионообменной колонке SCX, для разделения использовали по 50 мкг триптических пептидов. Далее анализировали по 20 катионоообменных фракций каждого образца.
Обработка данных ВЭЖХ-МС/МС с помощью программы Mascot Server позволила идентифицировать 1664 уникальных белка во всех пробах. В результате дальнейшей обработки данных программой Skyline были определены уровни: в Sample01 - 1447 белков по 11176 пептидам (диапазон молекулярных весов белков от 3,53 до 3908,10 кДа); в Sample02 - 1225 белков по 13674 пептидам (диапазон молекулярных весов белков от 4,60 до 3908,10 кДа); в Sample03 -842 белков по 10932 пептидам (диапазон молекулярных весов белков от 5,02 до 1017,07 кДа).
Динамический диапазон для идентифицированных белков составляет 7 порядков (от 4,8-10-7% до 5,3%), что позволяет выявить регуляторные низко-копийные белки, такие как интерлейкины 25 и 36, рецепторы ростовых факторов и т.д. Также идентифицированы специфические маркеры мезенихмных (CD44, интегрины a-V и р-1) и нейральных прогени-торных клеток (нестин). Во всех трех образцах идентифицировано 606 белков.
Протеомные карты НСК, ММСК и ОСК (глиома-сферы) глиобластомы клеточной линии U87 приведены в открытом доступе на сайте www.neurovita.ru в форме научных отчетов [24-26]. Полученные данные протеомного картирования белков различных типов были подвергнуты сравнительному биоинформационному анализу. Изначально были выполнены «грубый» информационный анализ белков проте-омного картирования сравниваемых групп и исключение из протеомов функционально малозначимых протеинов стволовых клеток. Для этого были исключены из исследуемых протеомов все белки, которые идентифицированы только в одном типе клеток, из 1664 уникальных белков получили группу сравнения А - НСК и ОСК (1052 белка) [24] и группу сравнения Б - ММСК и ОСК (607 белков) [24]. Полученные результаты в группе сравнения А (63,2% идентичных белков) отражают близость морфофункциональных фенотипов НСК и глиомасфер, как клеток, имеющих нейральноподобную дифференцировку и локализацию в центральной нервной системе. В то же время в группе сравнения Б выявлено только 607 (36,47%) идентичных белков в анализируемых ММСК и ОСК. Несмотря на то, что признаки стволовости характерны для обоих типов анализируемых клеток и они не так далеко находятся друг от друга фенотипически, их уже сформированная мультипотентная диффе-ренцировка и определила значительную разницу в протеомном профиле этих клеток.
В дальнейшем были исключены из анализа каждой из групп сравнения все белки, у которых нормализованная сигнальная интенсивность (НСИ) изменилась менее, чем в 2 раза. Мы полагали, что только значимые отличия НСИ белков анализируемых клеточных систем отражают базовые регуляторные
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
88
Дискуссионные и общетеоретические работы
тенденции. В результате в группе А осталось только 637 белков (38,28%), в группе Б — 425 белка (25,54%). Составили общую таблицу из белков групп А и Б (503 белка) [24]. В ней находятся белки, НСИ которых меняется более, чем в два раза хотя бы в одной из групп А или Б. Аннотирование и дальнейшая обработка проводилась для белков из этой таблицы. Результаты аннотирования приведены в дополнительном файле «Аннотация белков НСК, ММСК и ОСК» [24]. Далее на основании данных обзора [27] и баз данных исключили уже ранее известные белки, участвующие в канцерогенезе глиобластомы головного мозга: CD44, NADP и виментин, которые в дальнейшем не рассматривали.
Следующим этапом биоинформационного анализа было проведено распределение белков на функционально значимые кластеры для внутриклеточной и межклеточной регуляции, протеиновые кластеры — цели. Был выделен первый кластер белков «Рецепторные цели»: выделили из оставшихся белков про-теомного профиля НСК и ОСК, а также ОСК и ММСК группу белков, расположенных преимущественно в (на) мембранах НСК, ММСК и ОСК, всего 105 белков (6,31 %). Для этого выбирали белки, у которых в аннотации присутствовал код G0:0005886 plasma membrane.
Затем был выделен второй кластер «Ядерные цели»: выделили из оставшихся белков протеомного профиля ОСК и НСК, а также ОСК и ММСК группу белков, содержащихся преимущественно в ядрах этих клеток, 146 белков (8,77%). Для этого выбирали белки, у которых в аннотации присутствовал код G0:0005634 nucleus.
В заключение биоинформационного анализа определили третий кластер «Белки сигнальной трансдукции и межклеточной регуляции»: выделили белки, секретируемые НСК, а также секретируемые ММСК. Составили сводную таблицу секретируемых белков НСК и ММСК. Таких белков оказалось 33 (1,98%). Для этого выбирали белки, у которых в аннотации присутствовал коды со словом extracellular: G0:0005576 extracellular region, G0:0005578 proteinaceous extracellular matrix, G0:0005615 extracellular space, G0:0031012 extracellular matrix, G0:0044420 extracellular matrix part.
Для всех отобранных белков построили графики распределения их по молекулярным функциям, биологическим процессам, а также сигнальным путям.
Третий этап биоинформационной обработки результатов протеомного картирования белков был обозначен как «тонкий» информационный анализ белков с использованием информационных баз данных протеомов и исключение из протеомного картирования протеинов, участвующих в канцерогенезе именно глиобластомы головного мозга. Оказалось, что в сформированных списках белков имеются протеины, участвующие в процессах канцерогенеза других неоплазий, но в не глиобластомы. Исключили из групп сравнения А и Б [24] митохондриальные белки и белки, ассоциированные с метаболомом НСК и ОСК: белки, обеспечивающие быстрое воспроизводство АТФ для поддержки энергетического статуса, быстрый синтез макромолекул, белки дыхательной цепи, белки эффекта Варбурга и другие белки метаболома с помощью поиска аннотаций белков по ключевым словам mitochondrion, mitochondrial, metabolic, metabolism, Warburg, electron transport.
В результате в группах осталось: 34 ядерных, 53 мембранных и 10 внеклеточных белков. Исключили из групп сравнения А и Б белки, ассоциированные с нарушенными путями сигнальной трансдукции, характерными для глиобластомы.
Исключили из групп сравнения клеточного каркаса (белки цитоскелета, белки эндоплазматического ретикулума) метаболома с помощью поиска аннотаций белков по ключевым словам cytoskeleton, cytoskeletal, reticulum. В результате в группах осталось: 19 ядернын, 20 мембранных и 5 внеклеточных белков.
Для этих белков с помощью баз данных Biocarta (http://www.biocarta.com/), KEGG PATHWAY (http:// www.genome.jp/kegg/), PANTHER PATHWAY (http:// www.pantherdb.org/) и Reactome (http://www. reactome.org/) провели аннотирование сигнальных путей белков. Белок-белковые взаимодействия аннотировали по базам данных Biomolecular Interaction Network Database (BIND: http://bind.ca), Database of Interacting proteins (DIP: http://dip.doe-mbi.ucla. edu/), Molecular Interaction Database (MINT, http:// mint.bio.uniroma2.it/mint/), NCICB CAPATHWAY interaction (http://cgap.nci.nih.gov/ Pathways/), и Reactome Interaction (http://www.reactome.org/).
В результате, было выявлено 10 сигнальных путей, в которых участвуют два и более белка, а именно: сигнальный путь фосфоинозитидов и их мишеней, путь заражения холерным вибрионом, путь фокальной адгезии, лизосомальный путь, сигнальный путь интегрина, путь хореи Хантингтона, передача сигнала Ро-ГТФазами, путь ВИЧ-инфицирования, путь мембранного транспорта, путь гемостаза. Наибольший интерес представляют белки из разных локализаций (например, из ядра и из мембраны).
Обсуждение
Сопоставив протеомный профиль белков ОСК выделенной из глиобластомы человека линии U87 с профилями белков тканеспецифичных НСК и ММСК человека, которые, как мы полагали, являются контролем нормы вида (человека), нам удалось идентифицировать в изученных лизатах клеток 1664 белка, из которых 1052 белка (63,2%) идентичны для НСК и ОСК и 607 белков (36,47%) подобны в ММСК и ОСК. Остальные белки в ОСК глиобластомы U87 являются онкоспецифичными или связаны с процессами канцерогенеза. Мы предположили, что матрица подобия белков в ОСК — это и есть «здоровый» и «видоспецифичный» белковый клеточный субстрат, который остался сохранным в ОСК, и именно эти белки могут стать основой для разработки персонифицированного таргетного управления эффекторными функциями ОСК, не отвечающих на обычные сигналы межклеточной регуляции тканеспецифичных стволовых клеток и клеток иммунной системы. Соответственно, мы выделили и проаннотировали белки ОСК, которые не пострадали в результате неопластической трансформации клетки в процессе канцерогенеза и, используя современные базы информационных данных, распределили их на мембранные, секретируемые и ядерные. Эти данные позволили нам диагностировать в ОСК выделенной из глиобластомы линии U87 десять путей сигнальной трансдукции, не пострадавших в результате неопластической трансформации. Анализируя возможность информационного воздействия на эти
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
Дискуссионные и общетеоретические работы
89
пути в ОСК, мы попытались спрогнозировать ответ ОСК на регуляторный стимул. Лизосомальный путь и путь мембранного транспорта не передают сигнал в ядро, поэтому мы исключили их из дальнейшего рассмотрения. Пути инфицирования ВИЧ и холерным вибрионом характерны для клеток иммунной системы и кишечного эпителия соответственно, а также не связаны со злокачественным перерождением клеток, поэтому тоже были исключены нами из дальнейшего анализа. Гемостазисный путь характерен для тромбоцитов и процесса свертывания крови, поэтому также был исключен из дальнейшего рассмотрения. Наибольший интерес представляет сигнальный путь интегринов, так как высокий уровень экспрессии интегринов характерен для стволовых клеток, а изменение их продукции может быть связано с дедифференцировкой и изменением фенотипа клеток. Этот путь большей частью совпадает с путем фокальной адгезии, поэтому далее мы стали рассматривать их как один сигнальный путь.
Сигнальный путь интегрина/фокальной адгезии начинается с передачи сигнала в клетку ростовыми факторами (EGF, FIGF, HGF, IGF1, PDGFA, PDGFB, PGF, PDGFC, PDGFD, VEGFA, VEGFB, VEGFC) и белками внеклеточного матрикса (ламининами LAMA1, LAMA2, LAMA3, LAMA4, LAMA5, LAMC3, LAMB4, LAMB1, LAMB2, LAMB2, LAMC1, LAMC2; коллагенами COL1A1, COL1A2, COL2A1, COL3A1, COL4A1, COL4A2, COL4A4, COL4A5, COL4A6, COL5A1, COL5A1, COL5A2, COL6A1, COL6A2, COL6A3, COL11A1, COL11A2; фибронектином FN1, хондроадгерином CHAD, олигомерным матриксным протеином COMP, тенасци-нами TNC, TNN, TNR, TNXB, интегрин-связывающим сиалопротеином IBSP, реелином RELN, секретируе-мым фосфопротеином 1 SPP1, тромбоспинодинами THBS1, THBS2, THBS3, THBS4, витронектином VTN и фактором фон Виллебранда VWF). На внешней стороне плазматической мембраны передача сигнала происходит за счет интегринов ITGA11, ITGA6, ITGA1, ITGA2, ITG2AB, ITGA3, ITGA4, ITGA5, ITGA7, ITGA9, ITGAV, ITGA10, ITGA8, ITGB1, ITGB3, ITGB4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, ITGB8; кавеолинов CAV1, CAV2, CAV3 и тирозин-киназных рецепторов (EGFR, ERBB2, FLT1, FLT4, IGF1R, KDR, MET, PDGFRA, PDGFRB). Соответственно, мы получили целый набор белковых мишеней на мембране клетки, позволяющих таргетно и эффективно воздействовать на пути сигнальной трансдукции интегринов и фокальной адгезии и регулировать репродуктивные и пролиферативные функции ОСК путем активации или ингибирования экспрессии доступных для регуляторного воздействия генов в ОСК. Этот подход качественно отличается от существующего конвенционального подхода в таргетной персонифицированной терапии опухолей. Все современные геномные, полнотран-скриптомные и протеомные подходы к поиску целей в опухолевой клетке пытаются найти онкоспецифические или канцерозависимые белки-мишени на её мембране, в путях сигнальной трансдукции или ядре опухолевой клетки и использовать их в качестве целей для современной таргетной терапии опухолей. Как видите, мы пошли другим путем: целью нашего воздействия на мишени в ОСК было не её уничтожение, а регуляция и управление её пролиферативным и репродуктивным потенциалом. Нам представлялось целесообразным для целей регуляции и управления ОСК не пытаться её уничтожить путем
обнаружения специфичных белков, а выяснить, что же осталось ещё «сохранным и видоспецифичным» в протеоме мутировавшей ОСК, и можно ли «достучаться» до генома ОСК, не отвечающей на стандартные внешние воздействия. Данная постановка целей исследования была определена нами, исходя из собственных научных представлений о том, как должна проводиться современная противоопухолевая терапия новообразований. В соответствии с современной парадигмой противоопухолевой терапии, все без исключения применяемые медицинские противоопухолевые стратегии и технологии направлены на полное уничтожение всех опухолевых клеток и (или) ОСК любым путем до полного выздоровления пациента, и поэтому не могут быть эффективны по определению. Неэффективность существующей парадигмы доказывает отсутствие по настоящее время реальных технологий терапевтической помощи онкологическим больным [28, 29]. Мы полагаем, что все ОК и ОСК опухоли убить нельзя даже теоретически. ОСК это форма адаптации и выживания генетически измененной «мутантной» соматической стволовой клетки. ОСК подобна споре у растений, которая при неблагоприятных условиях позволит им выжить. Мы полагаем, что настало время сменить существующую парадигму противоопухолевого лечения. Альтернативой парадигме существующего тотального уничтожения опухолевых клеток и ОСК до полного излечения может быть методология хро-низации онкологического заболевания и проведения противоопухолевой терапии, направленной на допустимое уменьшение количества ОК, регуляцию ОК и контроль их количества в организме пациента (от 107 до 103) и, при необходимости, управление их эффекторными функциями [30]. Главной целью противоопухолевой терапии мы предложили считать не выздоровление пациента, а перевод острого фатального злокачественного онкологического процесса в хроническое и не смертельное заболевание. Как утверждает А.И. Арчаков (2000), в норме у каждого здорового человека есть 5х105 опухолевых клеток и, как мы знаем, человек от этого количества не умирает [7]. Увеличение их количества до 109 манифестирует предраком, и только превышение количества опухолевых клеток более 109клинически манифестирует раком или другой злокачественной опухолью. Известно, что каждый метод противоопухолевой терапии имеет определенные ограничения количественного уничтожения опухолевых клеток в организме: «хирургия» позволяет уменьшить их количество до уровня 109, химио- и лучевая терапия позволяют снизить уровень опухолевых клеток с 109 до 107, иммунотерапия обеспечивает цитотоксической эффект с 107 до 105. Доказано и сегодня не вызывает сомнения, что регуляция количества опухолевых клеток ниже уровня 5х105 осуществляется тканеспецифичными стволовыми и прогенеторными клетками [30]. Поэтому комплексная протеом-ос-нованная терапия опухолей должна включать в себя все существующие виды цитостатической, цитотоксической и цитостатической противоопухолевой терапии (хирургию, химиотерапию, радиотерапию и иммунотерапию), обеспечивающие снижение уровня опухолевых клеток с 109 до 5х105, и завершаться циторегуляторной терапией собственными тканеспецифичными регуляторными стволовыми клетками, способными оказать управляющее воздействие на
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
90
Дискуссионные и общетеоретические работы
эффекторные (репродуктивные и пролиферативные) функции ОСК.
Заключение
Мы полагаем, что комплекс современной противоопухолевой протеом-основанной терапии (рис.) должен состоять из трех обязательных этапов лечения: 1) конвенциональной циторедуктивной, цитостатической и цитотоксической терапии;
2) адоптивной и цитотоксической иммуннотерапии;
3) циторегуляторной терапии ОСК. Первый этап терапии представляет собой конвенциональное лечение в виде хирургического удаления опухолей, химио-(1—2 линии) и лучевой терапии (не более 20 грей). Второй обязательный этап лечения онкологического больного должен состоять из адоптивной иммунотерапии (индивидуальные противоопухолевые вакцины, цитотоксические лимфоциты, иммунопрепараты и антитела), которая до настоящего времени рассматривается онкологами пока только
как экспериментальная. Третий этап противоопухолевой терапии должен заключаться в коррекции репродуктивных, пролиферативных и метастатических функций ОСК опухоли путем таргетного воздействия на белки-мишени ВКПСТ, способные ответить на целенаправленное регуляторное воздействие. Теоретическое и методологическое обоснование третьего этапа лечения было представлено нами ранее и опубликовано в открытой печати в рамках концепции циторегуляторной терапии злокачественных новообразований [30]. Инструментом для получения собственных стволовых клеток с заданными свойствами, способных оказывать персонифицированное таргетное регуляторное воздействие на ОСК, может быть их протеомное картирование и профилирование белков с целью выявления сигнальных путей, не пострадавших в результате канцерогенеза и определение генов, доступных регуляторному воздействию, а также анализ динамики изменения их протеомов [31].
Вариант статьи с подробным представлением результатов исследования в виде таблиц и рисунков опубликован на сайте журнала www.celltranspl.ru
ЛИТЕРАТУРА:
1. Pearson M.L., Soil D. The Human Genome Project: a paradigm for information management in the life sciences. FASEB 1991; 5(1): 35-9.
2. Watson J.D., Cook-Deegan R.M. Origins of the human genome project. FASEB 1991; 5(1): 8-11.
3. Collins F.S., Green E.D., Guttmacher A.E. et al. A vision for the future of genomics research. Nature 2003; 422(6934): 835-47.
4. Янковский Н.К., Боринская С.А. Геном человека: научные и практические достижения и перспективы: Аналитический обзор. Вестник РФФИ 2003; 2: 46-63
5. Аствацатурян М. Одна из болезней цивилизации — язва желудка. The New Times, 19.03.2007
6. Проект «Протеом человека». http://www.proteome.ru/
7. Арчаков А.И. Биоинформатика, геномика и протеомика — науки о жизни XXI столетия. Вопросы медицинской химии 2000; 1: 4-7.
8. Conrotto P., Souchelnytskyi S. Proteomic approaches in biological and medical sciences: principles and applications. Exp. Oncol. 2008; 30(3): 171-80.
9. Федорова А. На смену геному идет протеом. Наука и жизнь 2010; http://www.nkj.ru/news/19007/
10. Проект «Протеом человека». http://www.proteome.ru/ about_project/consortium
11. Pittenger M.F. Mesenchymal stem cells from adult bone marrow. Methods Mol. Biol. 2008; 449: 27-44.
12. Nakano M., Goris R.C., Atobe Y. et al. Mediolateral and rostrocaudal topographic organization of the sympathetic preganglionic cell pool in the spinal cord of Xenopus laevis. J. Comp. Neurol. 2009; 513(3): 292-314.
13. Чехонин В.П., Викторов И.В., Савченко Е.А. и др. Мультипотентные стволовые и прогениторные клетки обонятельного эпителия. Клеточные технологии в биологии и медицине 2006; 4: 185-93.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
Дискуссионные и общетеоретические работы
91
14. Чехонин В.П., Савченко Е.А., Андреева Н.А. и др. Культивирование специализированных глиальных клеток [Olfactory Ensheathing Cells) обонятельного эпителия человека. Тезисы докладов Британско-российского совещания в сотрудничестве с Европейской Комиссией «Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации. Международные перспективы сотрудничества»; 15 марта 2007; Москва.
15. Bajinskis A., Lindegren H., Johansson L. et al. Low-dose/dose-rate y radiation depresses neural differentiation and alters protein expression profiles in neuroblastoma SH-SY5Y cells and C17.2 neural stem cells. Radiat Res. 2011; 175(2): 185—92.
16. De la Fuente A., Mateos J., Lesende-Rodriguez I. et al. Proteome analysis during chondrocyte differentiation in a new chondrogenesis model using human umbilical cord stroma mesenchymal stem cells. Mol. Cell Proteomics. 2012; 11(2): M111.010496.
17. Salasznyk R.M., Westcott A.M., Klees R.F. et al. Comparing the protein expression profiles of human mesenchymal stem cells and human osteoblasts using gene ontologies. Stem Cells Dev. 2005; 14(4): 354-66.
18. Wang D., Gao L. Proteomic analysis of neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Proteomics 2005; 5(17): 4414-26.
19. Formolo C.A., Williams R., Gordish-Dressman H. et al. Secretome signature of invasive glioblastoma multiforme. J. Proteome Res. 2011; 10(7): 3149-59.
20. Kim H.S., Choi D.Y., Yun S.J. et al. Proteomic analysis of microvesicles derived from human mesenchymal stem cells. J. Proteome Res. 2012; 11(2): 839-49.
21. Chambery A., Vissers J.P., Langridge J.I. et al. Qualitative and quantitative proteomic profiling of crypto (-/-) embryonic stem cells by means of accurate mass LC-MS analysis. J. Proteome Res. 2009; 8(2): 1047-58.
22. Prahalad A.K., Hock J.M. Proteomic characteristics of ex vivo-enriched adult human bone marrow mononuclear cells in continuous perfusion cultures. J. Proteome Res. 2009; 8(4): 2079-89.
23. Bleeker F.E., Molenaar R.J., Leenstra S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J. Neurooncol. 2012; 108(1): 11-27.
24. Шевченко В.Е. О протеомном исследовании клеточных линий нейрональных прогениторных клеток, мезенхимных стволовых клеток и раковых стволовых (глиомасферы) клеток линии глио-
бластомы человека U87. Лаборатория Онкопротеомики НИИ Канцерогенеза, ФГБУ Российский онкологический научный центр им.
Н. Н. Блохина РАМН; 2012; Отчет 05/12. http://www.neurovita.ru/ Otchet0512.html.
25. Коваленко И.Б. О биоинформационном исследовании протеомов клеточных линий нейрональных стволовых и про-гениторных клеток, мезенхимных стволовых клеток и раковых стволовых (глиомасферы) клеток линии глиобластомы человека U87. Кафедра биофизики биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова; 2012 Отчет №09/2012. http://www.neurovita. ru/Otchet0912.html.
26. Чехонин В.П. О биоинформационном исследовании про-теомов клеточных линий нейрональных стволовых и прогенитор-ных клеток, мезенхимных стволовых клеток и раковых стволовых (глиомасферы) клеток линии глиобластомы человека U87. Отдел фундаментальных нейробиологических исследований ФГБУ «Научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П.Сербского Минздрава РФ; 2012; Отчет 03/12. http://www.neurovita.ru/ Otchet0312.html.
27. Bleeker F.E., Molenaar R.J., Leenstra S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J. Neurooncol. 2012; 108(1): 11-27.
28. Брюховецкий А.С., Чехонин В.П., Менткевич Г.Л. Стволовые клетки в нейроонкологии: здоровые и раковые стволовые клетки, их возможная роль и место в канцерогенезе и современных высокотехнологичных сценариях лечения опухолей мозга. Материалы научно-практической конференции «Высокие технологии в терапии и реабилитации заболеваний нервной системы». Москва, 2008. С. 43-4.
29. Брюховецкий А.С., Чехонин В.П., Семенова А.В. и др. Противоопухолевое средство на основе иммунолипосомальной биологической конструкции, способ его получения и векторной доставки в центральную нервную систему при опухолевом процессе. Патент РФ № 2336901; 27 октября 2008.
30. Брюховецкий А.С. Клеточные технологии в нейроонкологии: циторегуляторная медицина в терапии глиальных опухолей головного мозга.М.: Изд. группа РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина, 2011.
31. Терентьев А.А., Молдогазиева Н.Т., Шайтан К.В. Динамическая протеомика в моделировании живой клетки. Белок-бел-ковые взаимодействия. Успехи биологической химии 2009; 49: 429-80.
Поступила 18.05.2013
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
