CC BY
55
УДК 611.013.68.08:616-006.484-092.4
j, 2 j, 3 2 2 2
И.С. Брюховецкий ; , A.C. Брюховецкий ; , П.В. Мищенко , Е.В. Толок , Р.Ю. Хотимченко МИГРАЦИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА К КЛЕТКАМ ГЛИОБЛАСТОМЫ ЛИНИИ U87 IN VITRO
1 Дальневосточный федеральный университет, Школа биомедицины (690950, г. Владивосток, ул. Суханова, 8 ФГБУН Институт биологии моря имени A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН, Владивосток 3Клиника восстановительной и интервенционной неврологии «Нейровита», Москва
Контактная информация
Брюховецкий Игорь Степанович, с.н.с. лаборатории молекулярной и клеточной нейробиологии Школы биомедицины ДВФУ; н.с. лаборатории фармакологии ФГБУН Институт биологии моря имени A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН, кандидат медицинских наук адрес: 690091, г. Владивосток, улица Суханова д. 8; тел. +7(914)723-05-03. e-mail: bruhovetskv@mail.ru
Статья поступила 08.10.2014, принята к печати 24.11.2014.
Резюме
Феномен миграции стволовых клеток в опухолевый очаг открывает перспективы создания новых терапевтических технологий в онкологии. ГСК, обладающие большим репаративным потенциалом, могут быть использованы для оптимизации схем лечения опухолей мозга.
Цель работы состояла в получении экспериментальных данных, свидетельствующих о способности ГСК к направленной миграции к клеткам глиомы.
В работе использовали клетки глиобластомы человека линии U87, культуры ГСК и фибробластов человека. Клетки кокультивировали в течение пяти дней. В ходе эксперимента наблюдали формирование клеточного вала из гемопоэтических стволовых клеток по периметру культуральной вставки, содержащей клетки глиомы. Такую картину не наблюдали в среде с фибробластами. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ГСК обладают собственным потенциалом направленной миграции к клеткам глиомы U87.
Ключевые слова: глиальные опухоли, глиобластома, гемопоэтические стволовые клетки, клеточная миграция.
I.S. Bryukhovetskiy1'2 A.S. Bryukhovetskiy1'3, P.V. Mischenko2, E. V. Tolok2, R.Yu. Khotimchenko MIGRATION OF HUMAN HEMATOPOIETIC STEM CELLS TO THE GLIOBLASTOMA IN VITRO
1School of Biomedicine, Far Eastern Federal University, Vladivostok
2A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Vladivostok
3Clinic of Restorative and Interventional Neurology «NeuroVita», Moscow
Abstract
Phenomenon directed migration of stem cells in the tumor tissue bodes well for the creation of new therapeutic technologies. HSCs are the least involved in the carcinogenesis of malignant gliomas have a great reparative potential and can be used to optimize treatment regimens malignant glial brain tumors.
Aim of the experimental substantiation HSCs ability to directional migration of glioblastoma cells. In this study we used human glioblastoma line U87, the culture of HSCs, and human fibroblasts. Cells were cultured five days. Experiments revealed the formation of cellular HSCs shaft perimeter culture inserts containing culture glioma. This picture is not observed in the wells with the cultures of fibroblasts.
These results indicate that HSCs have high potential directional migration of glioma cells U87; it allows us to consider them as promising lines for development of new anticancer biomedical technology and sheds light on previously unknown aspects of carcinogenesis glial tumors.
Key words glial brain tumors, Glioblastoma multiforme, hematopoietic stem cells, neural stem cells, tumor cells, cell migration.
Введение
СК - магистральный тренд в развитии современных биотехнологий и новая клиническая реальность мировой трансляционной и регенеративной медицины.
Трансплантация СК коренным образом изменила базовые терапевтические подходы к лечению сосудистых и нейродегенеративных заболеваний, модифицировала основные протоколы лечения травм центральной нервной системы [18] и терапии ряда фатальных онкогематологических заболеваний [13]. Она стала новой теоретической и методологической платформой для создания новаторских биомедицинских технологий [1; 7; 8; 12].
Несмотря на значительные успехи, на пути широкого внедрения клеточных технологий в повседневную клиническую практику перед регенеративной медициной стоит целый ряд нерешенных этических, юридических, религиозных задач и технологических ограничений. Наиболее сложным и важным аспектом проблемы применения СК в клинике является потенциальная возможность неопластической трансформации клеточного трансплантата и развитие злокачественного онкологического заболевания из трансплантированных СК [19]. Опасность неопластической трансплантации СК после их введения в организм вынудила ведущие клиники мира практически отказаться от использования эмбрионального и фетального клеточного
материала, культивирования СК, использования клеток с индуцированной iPSCs и сосредоточиться только на использовании аутологичных СК [7]. Вынужденные меры возымели определенный успех для клиники, однако они не значительно уменьшили степень сопутствующего риска для пациентов, поскольку механизмы неопластической трансформации СК в опухолевые СК и специфика взаимодействия СК с опухолью до настоящего времени остаются еще не достаточно ясными и понятными.
Феномен таргетной (целенаправленной) миграции СК в опухолевый очаг, описанный научной группой Карен Эбоди [11], пролил свет на ряд очень важных аспектов этой проблемы. Рост опухоли в мозге или в любом другом органе приводит к повреждению тканей и запуску экспрессии генов семейства HIF, которые регулируют продукцию цитокинов, привлекающих СК [6; 22].
Идентифицировано более 80 лигандов, управляющих процессом миграции СК через соответствующие рецепторы [2; 3; 6]. Наиболее изучено взаимодействие фактора стромальных клеток SDF-1а с рецептором CXCR4 [15], фактора стволовых клеток SCF с рецептором c-Kit, фактора роста гепатитов HGF с рецептором c-Met, фактора роста эндотелия сосудов VEGF с VEGFR, белка хемоатрак-танта моноцитов MCP-1 с CCR2, ядерного белка амфотерина HMGB1 с RAGE и урокиназы плазми-ногена с uPAR [4; 6; 9; 19; 20].
Согласно данным литературы [5], основным источником цитокинов, привлекающих СК в опухоль, являются дегенерирующие ткани клеточного микроокружения опухоли, соответственно, сам феномен миграции СК в область неопластического повреждения длительное время исследователями рассматривался только как саногенетический процесс [19; 22]. Однако не решен важнейший вопрос фундаментальной биологии опухолей: может ли сама опухолевая ткань привлекать СК без участия окружающих тканей. И второе, какие клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза лежат в основе данного межклеточного взаимодействия?
Цель настоящей работы состояла в получении экспериментальных данных и неопровержимых доказательствах способности ГСК человека к направленной миграции к клеткам глиобластомы линии U87 in vitro.
Материалы и методы
Гемопоэтические стволовые клетки
Культура ГСК была представлена ЗАО «Клиника восстановительной и интервенционной неврологии и терапии «Нейровита» (Москва).
Согласно сопроводительной документации, с целью увеличения количества стволовых клеток в периферической крови донор получал 8 инъекций Г-КСФ с интервалом 12 ч в течение 4 дней. В первые три дня доза Г-КСФ составляла 2,5 мкг/кг массы тела, а в последний день удваивалась. Сбор стволовых клеток из периферической крови проводили с помощью аппарата COBe® Spectra Apheresis System. Выделение клеток CD34+/CD45+ фенотипа осуществляли методом иммуномагнитной сепарации на разделительной колонке autoMACS™Pro.
Сбор материала осуществлялся для лечения нейроонкологических больных. Использование материала в исследовательских целях проводилось с согласия пациента.
После размораживания клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS, fGf,
EGF и антибиотик-антимикотик (производитель -Gibco®). Перед внесением в смешанную культуру TCK были обработаны флуоресцирующим красителем CellTracker™ Red CMTPX (производитель -Molecular Probes®).
Культура клеток
глиобластомы человека линии U S7
Глиобластома человека линии UB7 MG была предоставлена «Национальным институтом регенеративной медицины» (Москва). Данная линия получена от 44-летнего пациента и входит в Американскую коллекцию клеточных культур «ATCC»» под номером НТВ-14 [14].
^eTKH размораживали в течение 1ö мин при +37 °C, отмывали от ДМШ средой DMEM, содержащей 1ö% FBS, антибиотик-антимикотик «1ööX» (все производства компании Gibco®). ^eTKH осаждали центрифугированием, добавляли свежую среду и ресуспендировали.
Далее, клетки культивировали до образования монослоя, затем, снимали с помощью ферментативной диссоциации (ö,ö5 %-ный trypsin-EDTA, 1 : 4 при +37 °C, 1ö мин) и центрифугировали (12ög, б мин). Cyпeрнатант сливали, добавляли свежую среду и ресуспендировали.
C целью визуализации клетки обрабатывали флуоресцентным маркером Vybrant® CFDA SE Cell Tracer (производитель - компания Molecular Probes®).
Фибробласты
В работе использовали первичную культуру фибробластов человека (предоставлена компанией Life Technology). ^етои размораживали согласно стандартному протоколу и культивировали в полной среде DMEM/F12, HEPES, содержащей 1ö% FBS, 2 мМ L-глутамина, ö,B % глюкозы, ö,2 ЕД/мл инсулина и антибиотик-антимикотик (все производства компании Gibco®). Перед внесением в культуру фибробласты обработаны флуоресцирующим красителем CellTracker™ Red CMTPX (производитель - компания Molecular Probes®).
Дизайн эксперимента
Для создания сочетанных культур использовали культуральные вставки (Millipore) 0 12 мм с размером пор ö,4 мкм. В каждую лунку 12-луночного культурального планшета помещали вставку, которую иммобилизовали каплей стерильного парафина. Внутрь культуральной вставки вносили равное количество (ö,5*1ö6) клеток линии глиомы UB7 и фибробластов (рис. 1).
Планшет с культуральными вставками инкубировали в течение 24 ч, затем на дно лунки планшета высаживали по ö,25*1ö6 TCK. Через 3 ч инкубации клетки, не прикрепившиеся к дну лунки, отбирали. Подсчет клеток в области проекции мембраны культуральной вставки осуществляли в полностью автоматизированном режиме с использованием системы Cell-IQ (CM-Technologies) первого по пятый дни эксперимента.
В работе использовали систему визуализации живых клеток LSM 5 Karl Zeis Pascal и конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Carl Zeiss LSM. Для работы с изображениями применялись программы 3D for LSM Version 1.4.2, ImageJ (CfflÂ). Cтатиcтичecкая обработка полученных данных проведена с применением экстенсивных коэффициентов и коэффициентов относительной интенсивности.
Рис. 1. Схема лунки культурального планшета. Зеленый - клетки глиомы, внесенные в культу-ральную вставку; красный - гемопоэтические стволовые клетки, внесенные в культуру.
Рис. 5. Общая схема эксперимента, основная идея - формирование клеточного вала по периметру полупроницаемой культуральной вставки.
Рис. 6. Динамика числа ГСК в области культуральной вставки сов ходе эксперимента.
Рис. 7. Изменение числа ГСК в области культуральной
Экспериментальная часть работы была одобрена Комиссией по биомедицинской этике Школы биомедицины ДВФУ.
Результаты
При окрашивании реагентом Vybrant® CFDA SE Cell Tracer клетки глиомы U87 приобретали устойчивую флуоресценцию (рис. 2; см. обложку) и визуализировались в виде образований или слегка вытянутой формы. ГСК и фибробласты окрашенные CellTracker™ Red CMTPX, также активно флуоресцировали в смешанной культуре (рис. 3).
Спустя двое суток наблюдений клетки гли-областомы сформировали монослой. В свою очередь, в сочетанной культуре с ГСК отмечалась отчетливая тенденция к формированию клеточного вала, располагавшихся по периметру культуральной вставки, содержащей культуру глиомы U87 (рис. 4; 5). Достигая максимума к третьему дню эксперимента, данный феномен отсутствовал в со-четанных культурах с фибробластами, что демонстрирует способность глиобластомы человека активно привлекать СК.
Можно предположить, что направленная миграция ГСК к клеткам глиобластомы обусловлена продукцией цитокинов и хемоатрактантов, первичным источником которых являются именно опухолевые клетки.
Доказано, что глиомы продуцируют тенас-цин, фибронектин, ламинин, различные типы коллагена и ряд других биологически активных молекул, привлекающих стволовые клетки [16; 20; 21].
Подсчет количества ГСК, окрашенных флуоресцентным маркером CellTracker™ Red
вки на 5 день эксперимента.
СМТРХ, показал достоверное (р<0,05) увеличение количества ГСК в области мембраны во всех соче-танных культурах, содержащих клетки глиомы, начиная со второго дня эксперимента. Значимых изменений числа ГСК в области культуральной вставки в кокультуре с фибробластами не наблюдали (рис. 6). Увеличение числа ГСК в проекции культуральной вставки было достоверным во всех лунках содержащих клетки глиобластомы (рис. 7).
Обсуждение
На сегодняшний день существует две теории интерпретирующие процессы канцерогенеза - в виде вероятностной и иерархической моделей. Согласно первой, все клетки опухоли обладают одинаковым онкогенным потенциалом [23]. Вторая же гласит, что среди всех этих клеток лишь небольшое подмножество, «боковая популяция», способная порождать новые опухоли [20]. Очевидно, кроме первичной пролиферации под онкогенным потенциалом следует понимать способность привлекать здоровые СК и вовлекать их в процессы канцерогенеза.
Например, мультиформная глиобластома, как явствует из названия, гетерогенна как никакая другая опухоль, и содержит клетки самых разных типов. Поскольку большинство клеток опухоли характеризует конкретный профиль генетических нарушений, логично предположить, что клетка, из которой они произошли, обладала способностью порождать клетки разных типов, то есть СК.
Как следует из эксперимента, клетки глиобластомы способны сами привлекать СК. Очевидно, этот механизм и запускает неопластический рост, а возникающее в процессе опухолевой инвазии по-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ МИГРАЦИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ... 35
вреждение окружающих тканей сопровождается очаг. Следует предположить, что дальнейшая судь-нарушением их метаболизма и гипоксией, что ведет ба СК в этом случае всецело будет зависеть от глу-к продукции цитокинов усиливающих процессы бины изменений генома вызванных мутационными направленной миграции опухолевых клеток. процессами. Сопоставление протеомного профиля В естественных условиях, в мозге, основным НСК и опухолевой СК глиобластомы линии U 87 источником СК становятся герминативные центры позволяет сделать вывод о глубоких изменениях в - субвентрикулярная зона и зубчатая извилина. При экспрессии генов, вызванных процессами канцеро-появлении в паренхиме мозге опухоли в термина- генеза [5]. тивных зонах резко усиливаются пролиферативные процессы, а через 14 дней выявляется резкое сни- Заключение жение общего количества клеток [24; 26]. Очевидно, этот процесс только отчасти но- ГСК человека, в отличие от НСК, менее под-сит регуляторный характер, и скорее всего, объяс- вержены мутационным изменениям и могут рас-няет преобладание опухолей во второй половине сматриваться в качестве перспективной клеточной жизни, когда количество СК в субвентрикулярной линии для лечения нейроонкологических заболева-зоне резко сокращается [22]. В этих условиях, рек- ний и травм мозга. рутируя нейральные стволовые клетки (НСК) опу- Таким образом, клетки глиобластомы чело-холь их аккумулирует, стимулирует экспрессию века линии U87 обладают способностью привле-онкогенов, тем самым используя их репликативный кать СК, что позволяет отнести феномен направ-и миграционный потенциал [4; 25]. ленной миграции к фундаментальным механизмам Нашей исследовательской группой выполнен канцерогенеза. глубокий анализ литературы по вопросам миграции Работа выполнена при финансовой под-СК к очагу злокачественных опухолей [4; 6]. Не держке Министерства образования и науки Рос-вызывает сомнений, что СК, введенная в организм сийской Федерации (проект № 14.575.21.0038) с опухолью, неизбежно найдёт неопластический Литература 1. Алексеева И.С., Кулаков А.А., Голъдштейн Д.В. и др. Результаты клинико-экспериментального исследования по использованию комбинированного клеточного трансплантата на основе мультипо-тентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани для восстановления дефектов костной ткани //Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - T. 11, № 4. - C. 67-9. 2. Барышников А.Ю. Взаимодействие опухоли и иммунной системы организма // Практическая онкология. - 2003. - Т. 4, № 3. - С. 127-30. 3. Боценовский В.А., Барышников А.Ю. Молекулы клеточной адгезии // Успехи современной биологии. - 1994. - Т. 114, № 6. - С. 741. 4. Брюховецкий И.С., Брюховецкий А.С., Кумейко В.В. и др. Стволовые клетки в канцерогенезе мультиформ-ной глиобластомы // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2013. - Т. 8, № 2. - С. 13-9. 5. Брюховецкий А.С., Шевченко В.Е., Чехонин В.П. и др. Сравнительное протеомное картирование опухолевых стволовых клеток, выделенных из глиобластомы линии U 87, нейрональных стволовых и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека: от каталогизации клеточных белков к инновационной парадигме протеом-основанной клеточной терапии опухолей // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2013. - Т. 8, № 2. - C. 85-92. 6. Брюховецкий И.С., Брюховецкий А.С., Мищенко П.В. и др. Роль системных механизмов миграции и хоуминга стволовых клеток в развитии злокачественных опухолей центральной нервной системы и разработке новых методов противоопухолевой терапии // Российский биотерапевтический журнал. -2013. -Т. 12, № 4. - C. 3-12. 7. Брюховецкий А. С. Клеточные технологии в нейроонкологии: циторегуляторная терапия глиальных опухолей головного мозга. - М.: Издательская группа РОНЦ, 2011. - 652 с. 8. Киселевский М.В., Ситдикова С.М., Тенчурин Т.Х., Хомченко A.M. Современные подходы и перспективы создания биоимплантантов трахеи // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - T. 13, № 3. - C. 127-31.
№ 4/том 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
9. Уласов И.В., Каверина Н.В., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. Антиглиомная аденовирусная вироте-рапия: механизм, регуляция и клинические перспективы // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 2. - С. 11-8.
10. Уласов И.В., Каверина Н.В., Барышников А.Ю. Роль сурвивина в диагностике и терапии опухолей головного мозга // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 3. - С. 71-6.
11. Aboody K.S., Brown A., Rainov N.G. et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: Evidence from intracranial gliomas // PNAS. - 2000. - 97(23). - P. 12846-51.
12. Barth R.F., Kaur B. Rat brain tumor models in experimental neuro-oncology: the C6, 9L, T9, RG2, F98, BT4C, RT-2 and CNS-1 gliomas // J. Neurooncol. - 2009. - 94(3). - P. 299-312.
13. Bordignon C. Progress Stem-cell therapies for blood diseases // Nature. - 2006. - 441(7097). - P. 1100-2.
14. Cheng W.Y., Chiao M.T., Liang Y.J. et al. Luteolin inhibits migration of human glioblastoma U-87 MG and T98G cells through downregulation of Cdc42 expression and PI3K/AKT activity // Mol. Biol. Rep. - 2013. - 40(9). - P. 5315-26.
15. Greenbaum A., Hsu Y.M., Day R.B. et al. CXCL12 in early mesenchymal progenitors is required for hematopoietic stem-cell maintenance // Nature. - 2013. - 495(7440) -. P. 227-30.
16. He J., Liu Y., Lubman D.M. Targeting glioblastoma stem cells: cell surface markers // Curr. Med. Chem. -2012. - 19(35). - P. 6050-5.
17. Kelaini S., Cochrane A., Margariti A. Direct reprogramming of adult cells: avoiding the pluripotent state // Stem Cells Cloning. - 2014. - 7. - P. 19-29.
18. Lindvall O, Kokaia Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders // Nature. - 2006. - 441(7097). - P. 1094-6.
19. Lok C. Stem-cell research: Never say die // Nature. - 2012. - 481(7380). - P. 130-3.
20. Ozawa K., Sato K., Oh I. et al. Cell and gene therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) // J. Autoimmun. - 2008. - 30(3). - P. 121-7.
21. Piccirillo S.G., Binda E., Fiocco R., Shah K. Brain cancer stem cells // J. Mol. Med. (Berl.). - 2009. -87(11). - P. 1087-95.
22. Silva-Vargas V., Crouch E.E., Doetsch F. Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging // Curr. Opin. Neurobiol. - 2013. - 23(6). - P. 935-42.
23. Sonnenschein C., Soto AM. Theories of carcinogenesis: an emerging perspective // Semin Cancer Biol. -2008. - 18(5). - P. 372-7.
24. Walzlein J.H., Synowitz M., Engels B. et al. The antitumorigenic response of neural precursors depends on subventricular proliferation and age // Stem Cells. - 2008. - 26(11). - P. 2945-54.
25. Zhao D., Najbauer J., Annala J.A. et al. Human neural stem cell tropism to metastatic breast cancer // Stem cells. - 2012. - 30. - P. 314-25.
26. Zhao D., Najbauer J., Garcia E. et al. Neural stem cell tropism to glioma: critical role of tumor hypoxia // Mol Cancer Res. - 2008. - 6(12). - P. 1819-29.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ГСК
Г-КСФ
СК
- гемопоэтические стволовые клетки (HSCs - Hematopoietic stem cells)
- гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
- стволовые клетки
НСК HIF
- нейральные стволовые клетки
- hypoxia-inducible factor
iPSCs
- плюрипотентность
