CC BY
23
www.sibac.mto
Естественные и математические науки в современном мире __________________________________№ 11-12 (35), 2015 г
4.6. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ СОЕДИНЕНИЙ ЦИНКА НА АКТИВНОСТЬ КУЛЬТУРЫ SACHAROMYCES CEREVISIAE
Ларин Сергей Леонидович
аспирант кафедры общей и биоорганической химии, Курского государственного медицинского университета
РФ, г. Курск E-mail: [email protected]
Будко Елена Вячеславовна
д-р фарм. наук, зав. кафедрой общей и биоорганической химии, профессор Курского государственного медицинского университета
РФ, г. Курск E-mail: [email protected]
Хабаров Анатолий Алексеевич
д-р фарм. наук, профессор кафедры общей и биоорганической химии, Курского государственного медицинского университета
РФ, г. Курск E-mail: [email protected]
160
Естественные и математические науки в современном мире № 11-12 (35), 2015 г____________________
COMPARATIVE STUDY OF THE EFFECTS OF CERTAIN ZINC COMPOUNDS ON THE ACTIVITY OF SACHAROMYCES CEREVISIAE CULTURE
Sergei Larin
postgraduate of the department of general and bioorganic chemistry,
Kursk State Medical University, Russia, Kursk
Elena Budko
doctor ofpharmaceutical sciences, head of the department of general and bioorganic chemistry, Kursk state medical university,
Russia, Kursk
Anatoliy Khabarov
doctor ofpharmaceutical sciences, professor of the department of general and bioorganic chemistry, Kursk state medical university,
Russia, Kursk
СибАК
www.sibac.info
АННОТАЦИЯ
В работе проведено сравнительное изучение воздействия некоторых соединений Zn2+ на активность культуры S.Cerevisiae. Активность хлебопекарных дрожжей определялась по ускоренному методу определения подъемной силы. Выявлен сопоставимый токсический эффект малорастворимого Zn(OH)2 и раствора ZnSO4 при количествах Zn 10-100 мг/г. Незначительное ингибирование ферментативной активности дрожжей выявлено для ZnO, особенно для его микронизированной формы.
ABSTRACT
This paper represents a comparative study of the effects of certain Zn compounds on the S.Cerevisiae culture. The activity of the yeast was determined by an accelerated method of determining the lifting force. Identified a comparable toxic effect of poorly soluble Zn (OH)2 and ZnSO4 solution in the quantities of Zn 10-100 mg/g. A slight inhibition of enzyme activity found for ZnO, especially for its micronized form.
Ключевые слова: цинк; сульфат; цинка оксид; малорастворимые соединения; токсичность; дрожжи; ферменты.
Keywords: zinc sulfate; zinc oxide; poorly soluble compound; toxicity; yeast; enzymes.
161
Естественные и математические науки в современном мире ___________________________№ 11-12 (35), 2015 г.
Введение. Известно, что ионы цинка являются кофактором целого ряда ферментов и, как следствие, оказывают существенное влияние на нормальное протекание биохимических процессов в живом организме: белковый обмен, дифференцирование клеток и др. [1]. Поэтому Zn2+ в витальных дозах в большинстве случаев оказывает на ферментные системы активирующее действие [6]. Однако
не исключается и индукция процессов и, как следствие, гибель клеток. Уровень токсичности соединений зависит, в том числе от размера частиц и их ионизации, эффективности абсорбции. Традиционно для введения цинка в организм используются растворимые соединения. Ранее нами было показано, что культивация дрожжей хлебопекарных может быть проведена в питательной среде, с добавлением соли цинка, причем только сульфат сохраняет и повышает активность дрожжей. Это может быть связано как с концентрацией аниона в растворе, так и с его вовлечением в метаболические процессы дрожжевых клеток. Значительный интерес для дальнейших исследований представляет поиск соединений нетоксичных для дрожжевых клеток и являющихся источником максимального количества цинка, при этом имеются данные о проявлении биологической активности и малорастворимыми соединениями [3; 5; 7]. От выбора объекта исследования зависит получаемый эффект, а на его интенсивность влияют характеристики частиц. В эксперименте на крысах при однократном внутрижелудочном введении острая токсичность нанодиспергированного цинка оксида оказалась значительно ниже, чем у традиционной солевой формы цинка сульфата [3]. Однако отмечено токсическое воздействие наночастиц оксида цинка на клетки, при этом выявлена полная ионизация оксида в живом организме.
Культура S. Cerevisiae позволяет моделировать многие клеточные процессы, связанные с работой ферментов. Простейший комплекс превращений под действием зимазного комплекса ферментов широко распространен практически у всех живых организмов. Эффективность процесса спиртового брожения определяется целым рядом ферментов: а-глюкозидазой, мальтопермеазой, фруктоизомеразой, Р-фруктофура-нозидазой, карбоксилазой и др. Большинство из них не содержат Zn2+ в своей структуре, поэтому действие соединений цинка в отношении данных ферментативных систем может проявляться в ингибировании активности культуры хлебопекарных дрожжей. Ранее нами проводилось исследование активности дрожжей в питательной среде, с добавлением растворимых солей цинка, при этом, для эквимолярных количествах солей выявлено токсическое воздействие ацетата и хлорида и отсутствие угнетения активности дрожжей при
WWW.
162
Естественные и математические науки в современном мире № 11-12 (35), 2015 г___________________
использовании сульфата цинка. Значительный интерес для дальнейших исследований представляет поиск соединений нетоксичных для дрожжевых клеток и являющихся источником максимального количества цинка [2].
Целью данной работы являлось сравнительное изучение воздействия растворимого и некоторых малорастворимых разноразмерных соединений цинка на активность культуры хлебопекарных дрожжей
S. Cerevisiae.
Материалы и методы. В эксперименте использованы промышленные образцы соединений цинка ZnSO4 (ХЧ, ГОСТ 4174-77, Реахим, СПб), ZnO (ХЧ, ГОСТ 10262-73, Реахим, СПб) и образцы полученные в лабораторных условиях: ZnO микронизованный,
Zn(OH)2. Микронизацию окиси цинка (ХЧ, ГОСТ 10262-73, Реахим, СПб) проводили с использованием мельницы шаровой вибрационной МЛ-1 во временном режиме 15 минут [4]. Zn(OH)2 получали сливанием растворов ZnCl2 (ХЧ, ГОСТ 4529-78, Реахим, СПб) и KOH (ХЧ, ГОСТ 24363-80, Реахим, СПб) с последующей фильтрацией и сушкой при 25 оС.
Активность дрожжей определяли по ускоренному методу определения подъемной силы. От средней пробы дрожжей хлебопекарных прессованных высокоактивных «Премиум» (ОАО «Комбинат пищевых продуктов», СПб, Россия, ТУ 9182-008-00353595-2004) отбирали равные навески и к ним примешивали массы одного из соединений цинка в количествах эквивалентных по содержанию элемента в моле соединения. Серию разведений готовили с помощью чередования операций деления массы смеси на две равные части и восстановления исходной массы добавлением новой порции дрожжей. Данная методика позволила исключить ошибки взвешивания малых масс и позволила получить тритурации с содержанием цинка до 1 мг на 1 г дрожжевой смеси.
Из одинаковых по массе и разных по содержанию цинка дрожжевых смесей готовили суспензию в 2,5 % растворе NaCl (ХЧ, ГОСТ 4233-77, Реахим, СПб), которую соединяли с мукой пшеничной (ГОСТ Р 52189) и замешивали тесто с приданием ему формы шарика, шарик помещался в стакан с водой температуры 35 оС и термо-статировался. Для каждой серии опытов проводилась «холостая» проба. Количество параллельных опытов 5-6. Результаты переводили в относительные единицы и проводили анализ с использованием программного обеспечения MS Excel 14 и OriginPro 8.5.1.
Результаты и обсуждение. При выборе растворимой соли цинка мы остановились на сульфате, так как полученные ранее результаты
СибАК
www.sibac.info
163
www.sibac.mto
Естественные и математические науки в современном мире __________________________________№ 11-12 (35), 2015 г.
показали безусловную токсичность хлорида и ацетата. Для дальнейших исследований мы выбрали соединения с максимальной долей цинка при отсутствии сложных противоионов - оксид и гидроксид. Полученные в результате эксперимента зависимости степени изменения подъемной силы (%) от доли введенного цинка представлены на рисунке 1.
Рисунок 1. Зависимость степени изменения подъемной силы дрожжей (%) от массы Zn2+ для Zn(OH)2 (1), ZnSO4 (2), ZnO (3), ZnO микронизованный (4)
При подъемной силе контрольной пробы 100 % большинство полученных проб показало увеличение времени подъема в 1,25-1,5 раза. Из рис. 1 очевидно, что все исследуемые соединения в стартовых количествах ингибируют процесс ферментации. Наибольшим угнетающим эффектом в отношении дрожжевой системы обладают цинка гидроксид (кривая 1) и цинка сульфат (кривая 2). Стоит отметить, что на стартовых количествах угнетающее воздействие у цинка сульфата ниже, чем у гидроксида цинка. В исходных массовых уровнях цинка оксид наноразмерный (кривая 4) проявлял меньшее воздействие на клетки дрожжей, чем цинка оксид технический (кривая 3) в среднем на 12-15 %. Снижение масс соединений до милли-
164
Естественные и математические науки в современном мире № 11-12 (35), 2015 г___________________
и микрограммовых количеств цинка на грамм дрожжевой смеси во всех исследуемых пробах сопровождается ослабеванием угнетающего эффекта. Подъемная сила дрожжей в сериях с цинка сульфатом и гидроксидом устанавливается на исходном уровне холостой пробы. При этом нами отмечено некоторое повышение активности дрожжей в смесях с микронизированным цинка оксидом, и стабильное ингибирование ферментов зимазного комплекса ZnO техническим.
Исходя из строения дрожжевой клетки, в ходе эксперимента наблюдается ингибирование экзогенных ферментов зимазного комплекса. Отсутствие активности адаптивных ферментов можно объяснить их ингибированием в результате проникновения ионов внутрь дрожжевых клеток. Известно, что перемещение ионов между наружной средой и цитоплазмой клетки происходит через специфический транспортный механизм. Вид кривой изменения подъемной силы для сульфата предполагает ограничение проникновения элемента в клетку из растворов с достаточно высокими концентрациями соли, что можно расценить как насыщение транспорта или конечную скорость ионизации. Кроме того, относительно небольшая ингибирующая активность сульфата цинка, по нашему мнению, связана с участием аниона в нормальных метаболических процессах. Исходя из графической зависимости, следует отметить, что ослабление воздействия цинка гидроксида подобно по скорости аналогичным значениям для растворимого соединения. При этом все полученные графики сближаются с линией 100 % при одинаковом молярном содержании цинка в изучаемых соединениях.
Согласно современным представлениям, селективность ионного канала определяется радиусом транспортируемого иона и его способностью взаимодействовать с оптимальным числом фиксированных полярных групп канала. Для стерического соответствия важна характеристика окружения иона как в качественном, так и в количественном отношении. Ионы в водном растворе всегда находятся в гидратированном состоянии, причем ионы [Zn(OH)6]2+ считаются источником токсичности. Цинка гидроксид способен к частичной диссоциации, а также к гидратации за счет подобия ионов. Следовательно, вполне вероятен перенос цинка из гидроксида в клетку через ионные каналы, при этом его высокая активность при стартовых количествах (кривая 1) предполагает большую, чем у сульфата готовность проходить через ионные каналы.
Работы ряда авторов дают неоднозначную информацию о биологических свойствах цинка оксида. Цинка оксид обладает определенной растворимостью (4,2*10-6 г/мл [5]) и, следовательно, его
СибАК
www.sibac.info
165
Естественные и математические науки в современном мире ___________________________№ 11-12 (35), 2015 г.
частицы диссоциированы и солюбилизированы. Доказаны отсутствие инертности и дозозависимая токсичность его измельченных порошков, причем повышение степени дисперсности часто связывают с повышением биологической активности. Использованный нами цинка оксид технический имел частицы неправильной геометрической формы. При проведении микронизации на шаровой вибрационной мельнице МЛ-1 были получены частицы также неправильной формы. Микронизованный ZnO (кривая 4) показал минимальное токсическое воздействие на ферментативную активность относительно всех исследованных соединений, причем только для этой формы выявлена активация дрожжей на 10-15 %. Проявление незначительной токсичности цинка оксидом в отношении культуры клеток позволяет предположить низкую скорость процессов диссоцииации и гидратации или различия в механизме абсорбции. Возможно также, что оксид цинка активизирует другие физиологические процессы, опосредованно активизирующие реакцию ферментации.
Выводы. Растворимые и малорастворимые соединения цинка при воздействии на клетки дрожжей вызывают сопоставимые эффекты. В высоких дозах эквимолярные количества малорастворимого Zn(OH)2 и растворимого ZnSO4 значительно ингибируют процесс сбраживания, причем в стартовых дозах гидроксид оказал на культуру вдвое более сильный токсический эффект. По нашему мнению, это может быть показателем способности частиц гидроксида цинка к преодолению клеточной мембраны в результате диссоциации и гидратации. Соединение с наименьшей дисперсностью -микронизованный на шаровой мельнице цинка оксид - не только обладает минимальным токсическим эффектом в сравнении с другими изучаемыми соединениями, но в количествах на уровне миллиграмма оказывает стимулирующее воздействие на культуру S. Cerevisiae.
Средняя активность культуры клеток является показателем стресса, токсических эффектов, направленности метаболизма и общей жизнеспособности. Токсические эффекты частиц в культуре ткани могут быть связаны с двумя различными действиями: (I) химической токсичности, например, образование ионов, участвующих в ферментативных реакциях как ингибиторы; или (II) в результате нарушения поверхности, вызванного размерами и/или формой частиц. Процесс сбраживания дрожжевой клеткой теста основывается на действии зимазного комплекса ферментов, которые не содержат в своем составе ионов Zn2+. На наш взгляд это обусловило ингибирование активности экзоферментов дрожжевой культуры, т. е. эффект можно отнести к чисто химическому воздействию
WWW.
166
Естественные и математические науки в современном мире № 11-12 (35), 2015 г________________________
растворенных ионов цинка. Дальнейшие сравнительные исследования влияния растворимости, размера и формы частиц химических соединений на их биологическую активность может быть легко проведено на культуре клеток in vitro.
Список литературы:
1 Будко Е.В., Хабаров А.А. Цинк и питание. Германия: LAP Lambert Academic Publishing, 2014. - 72 с.
2 Будко Е.В., Хабаров А.А., Конопля А.И., Горбачева Л.А., Ельцова Н.О. Обогащение дрожжей солями цинка // Научные ведомости. БелГУ. Серия Медицина, Фармация. - 2012. - № 10. - С. 90-94.
3 Распопов Р.В. Бузулуков Ю.П., Марченков Н.С., Соловьев В.Ю., Демин В.Ф., Калистратова В.С., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Биодоступность наночастиц оксида цинка. Изучение методом радиоактивных индикаторов // Вопросы питания. - 2010. - № 6. - С. 14-16.
4 Хабаров А.А., Будко Е.В., Жилякова Е.Т., Новиков О.О., Новикова М.Ю., Попов Н.Н., Ванхин О.А. Изучение изменения технологических характеристик порошка цинка оксида в процессе его твердофазной механохимической обработки // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина, Фармация. - 2012. - № 22. - С. 116-120.
5 Brunner T.J., Wick P., Spohn P. In vitro cytotoxicity of oxide nanoparticles: comparison to asbestos, silica, and the effect of particle solubility. // Environ. Sci. Technol. - 2006. - № 40. - PP. 4374-4381.
6 Maret W. Zinc biochemistry: from a single zinc enzyme to a key element of life. // Advances in nutrition. - 2013. - № 4. - P. 82-91.
7 Saravanan V.S., Kalaiarasan P., Madhaiyan M., Thangaraju M. Solubilization of insoluble zinc compounds by Glyconobacter diazotrophicus and the trimental action of zinc ion (Zn2+) and zinc chelates on root knot nematode Meloidogyne incognita. // Letters in applied microbiology. - 2007. - № 44. -P. 235-241.
СибАК
www.sibac.info
167
