CC BY
231
Библиографический список
1. Правдин Л.Ф. Сосна обыкновенная / Л.Ф. Правдин. - М.: Наука, 1964. 192 с.
2. Ткаченко А.Н. Репродуктивная способность клонов сосны на лесосеменной плантации Брянской области / А.Н. Тка-
ченко // Лесное хозяйство — 2001. — № 1. — С. 38-39.
3. Ананьев М.Е. Влияние класса роста деревьев сосны на качество семян / М.Е. Ананьев, Е.Г. Парамонов / / Вестник АГАУ. — 2009. — № 7 (57). — С. 19-23.
+ + +
УДК 579.246.2 И.Б. Бороздина
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ PS. AERUGINOSA С ПОВЕРХНОСТИ ФИЛЛОПЛАНА
Ключевые слова: питательная среда, свекловичный отвар, культивирование, Pseudomonas aeruginosa.
Введение
Синегнойная палочка является одной из главных этиологических факторов (более чем 70% случаев) гнойно-септических заболеваний. Питательная среда имеет большое значение для выделения и идентификации Ps. аeruginosa.
Задачи, стоящие перед микробиологией, тесно связаны с бактериологической диагностикой Ps. аeruginosa. Поэтому правильный подбор состава питательной среды обеспечивает возможность выделения микроорганизмов, их идентификацию, получение чистых культур и изучение их биологических свойств.
В последнее время для повышения биосинтетической активности микроорганизмов всё чаще используются дешевые полноценные и сбалансированные среды растительного происхождения, на основе которых разрабатываются совершенные технологии в целях повышения продуктивности бактериальных культур [1]. Поэтому в настоящее время актуальными остаются работы по созданию эффективных новых, а также модификации питательных сред в бактериологической практике.
Цель — сравнить морфофизиологиче-ские, тинкториальные, культуральные, биохимические свойства чистых культур Ps. аeruginosa при культивировании на стандартных питательных средах промышленного производства и на экспериментальной питательной среде, приготовленной на основе свекловичного отвара.
Объект исследования — чистые культуры Ps. аeruginosa, выделенные с поверхности филлоплана.
Задачи:
1) дать оценку качественных и количественных показателей роста Ps. аeruginosa на стандартных средах и экспериментальной питательной среде;
2) изучить основные морфологические, культуральные, физико-химические, тинк-ториальные свойства Ps. аeruginosa при культивировании на искусственных питательных средах.
Материалы и методы
Экспериментальные исследования проводили на базе бактериологической лаборатории ГУБИБ № 4 г. Армавира.
Псевдомонады не прихотливы к факторам роста.
Базовым углеводородным субстратом является глюкоза.
Чистые культуры Ps. aeruginosa высевали на следующие питательные среды промышленного производства: МПА, МПБ, Эндо; селективные питательные среды — ацетамидный агар, ЦПХ-агар и экспериментальную питательную среду, приготовленную на основе свекловичного отвара (СПС).
Было проделано 30 опытов.
Приготовление экспериментальной питательной среды (СПС) происходит в 2 этапа:
1-й этап. Приготовление свекловичного отвара.
За основу берут свекловичный! отвар, приготовленный следующим способом (г/л): 200 г очищенной и промытой свек-
лы нарезают ломтиками, заливают 1 л водопроводной воды и варят 30 мин. Отвар фильтруют через ватно-марлевый фильтр и доводят до первоначального объёма. Полученный отвар кипятят и устанавливают рН среды 7,2.
2-й этап. К полученному свекловичному отвару добавляют (согласно прописи сред) пептон ферментативный и агар микробиологический. Полученные питательные среды доводят до кипения, устанавливают рН 7,2, разливают в мерные флаконы, охлаждают до 50°С и стерилизуют при 1 атм. 20 мин.
Образуется среда, соответствующая по плотности 1,5%-ному агаровому гелю.
Готовая среда годна к применению в течение месяца со дня приготовления при условии хранения её при \ = 2-5°С.
Для приготовления свекловичного отвара необходимо брать среднеспелые высокоурожайные сорта свёклы с тёмным цветом мякоти (например, Багровый шар, Бордо и др.), которые подвергаются длительному хранению и содержат большой набор питательных веществ, необходимых для Ps. aeruginosa.
3-й этап. Производили посев чистой культуры Ps. aeruginosa на среду СПС, культивирование микроорганизмов — в термостате при температуре 37°С.
Через 24 ч после посева Ps. aeruginosa наблюдалось появление сине-зелёных колоний с чёткими краями и характерным запахом жасмина, через 48 ч — диффундирование пигмента в питательную среду и окрашивание её в сине-зелёный цвет.
Исследование Ps. aeruginosa показало, что культуральные и морфо-физиоло-гические свойства данного микроорганизма не меняются.
Питательная среда обеспечивает типичный рост Ps. aeruginosa, стабильность сохранения её биологических свойств и может быть использована при культивировании данного микроорганизма.
Данная питательная среда позволяет также выделять некоторых представителей родов Klebsiella spp., Staphylococcus spp., Escherichia spp., Candida spp.
Физико-химические показатели экспериментальной среды. Исследуемые плотные питательные среды представляли собой непрозрачный студень, без осадка, от светло-коричневого до тёмно-бордового цвета.
Прозрачность и цветность питательных сред определяли визуально в проходящем свете.
Оптимальным подходом к получению питательных основ из свекольного отвара являются накопление аминного азота, физико-химические свойства питательной среды и биологические свойства Ps. aeruginosa.
Главный критерий качества питательной среды — концентрация аминного азота,
Состав питательной среды СПС:
Компоненты, входящие в состав среды m, г
1. Свекловичный отвар до 1 л
2. Пептон ферментативный 200,0
3. Агар микробиологический 20,0
составляющая 100-120 мг/%, что соответствует показателям стандартизированных сред.
Качество приготовленных сред оценивали с помощью физико-химических методов контроля в соответствии с «Методическими указаниями по применению физико-химических методов контроля питательных сред» (1977 г.) и МУК 4.2.2316-08 по следующим показателям: внешний вид, рН, аминный азот, сухой остаток, температура застудневания, прозрачность студня, продолжительность плавления, стерильность [2].
После автоклавирования экспериментальные среды осветляли активированным углём, фильтровали и определяли концентрацию аминного азота по методу Зерен-сена в модификации Гаврилова, а также М — среднее значение показателя аминного азота и m — стандартное отклонение.
Качественное определение белка проводили визуально с использованием три-хлоруксусной кислоты (CCl3COOH) для его осаждения.
Данные отражены в таблице 1, откуда следует, что экспериментальная питательная среда характеризуется достаточным содержанием аминного азота по сравнению со стандартными средами (МПА, МПБ, Эндо) и селективными средами (ацетамидный агар, ЦПХ-агар).
В свекловичном отваре содержание белка незначительное, а в средах МПА, МПБ, Эндо, приготовленных на основе животного сырья, — выше.
Важным диагностическим признаком Ps. aeruginosa является её способность утилизировать источники углеводов в качестве источника питания и энергии. Базовым углеводородным субстратом является глюкоза, содержащаяся в свекловичном отваре в концентрации 15,1 г/л.
Основными биополимерами свекловичного отвара являются легкоусвояемые углеводы — моносахариды (глюкоза, фрук-
тоза, галактоза, арабиноза), дисахариды (сахароза, мальтоза), трисахариды (рафи-ноза), полисахариды (крахмал, целлюлоза, гемицеллюлоза) и незначительная доля белков. В состав свекловичного отвара входят витамины группы В, РР, С, Е, а также микроэлементы: Са, Mg, Fe, №, К, Р.
Биологическая ценность питательной среды, приготовленной на основе свекольного отвара, состоит в наличии углеводов, аминокислот, биологически активных веществ, витаминов, микроэлементов. Существенным плюсом предлагаемого сырья являются его доступность и удобство применения.
Кроме изучения биологических свойств микроорганизма на экспериментальной питательной среде, проводили изучение этих свойств на средах МПА, МПБ, Эндо, а также использовали селективные среды — ацетамидный агар, ЦПХ-агар [3].
Оптимальная температура роста Ps. аeruginosa — 37°0, рН среды — 7,27,4, но также хорошо растёт при 42оС.
При выращивании в МПБ в течение суток Ps. аeruginosa образует равномерное помутнение с сероватой плёнкой на поверхности и осадком на дне.
На МПА через сутки образуются довольно крупные (3-5 мм) полупрозрачные колонии сероватого цвета с перламутровым оттенком. Цвет колоний более тёмный, чем периферия. Края ровные, чёткие.
На скошенном агаре культура Ps. аeruginosa даёт тонкий блестящий налёт. Она имеет специфический запах жасмина.
Характерным свойством её является появление уже к концу первых суток сине-зелёного окрашивания культуры с последующим проникновением пигмента (пиоцианина) в питательную среду.
Таблица 1
Концентрация аминного азота и качественное содержание белка в составе экспериментальных питательных сред на основе свекловичного отвара
(М±m)
Наименование Концентрация Качественное содержание
питательной среды аминного азота, мг/% белка в питательных средах
Экспериментальная среда 129,1 ±10,2 +
МПА 95,8± 12,5 ++
МПБ 85,7± 10,2 ++
Эндо 107,6±5,3 ++
ЦПХ-агар 113,4±6,8 +
Ацетамидный агар 112,7±5,6 +
Синегнойная палочка обладает слабой сахаролитической активностью: она обычно расщепляет только глюкозу с образованием кислоты без газа. Более выражена протеолитическая активность: разжижает желатин и свёрнутую кровяную сыворотку. Гидролизует казеин. Свёртывает лакмусовое молоко, а затем расщепляет сгусток. Восстанавливает нитраты в нитриты и далее до азота. Не образует индола и H2S. Даёт отрицательную реакцию Фо-геса — Проскауэра. Проба на оксидазу положительная.
На среде Эндо Ps. аeruginosa образует мелкие розовые колонии, дающие специфический запах жасмина.
Выделенные культуры на плотных питательных средах (МПА, Эндо) были представлены 5 морфологическими типами колоний:
1) плоские колонии неправильной формы;
2) крупные выпуклые блестящие колонии;
3) слизистые;
4) карликовые, или точечные;
5) складчатые колонии.
Для диагностики Ps. аeruginosa использовали 2 селективные среды:
• ацетамидный агар, где включение ацетамида как составной части среды обусловлено тем, что в отличие от других видов рода Pseudomonas, синегнойная палочка обладает способностью использовать это соединение в качестве единственного источника азота и углерода.
Ацетамидные агар содержит неорганические соли, калий гидрофосфат, калий дигидрофосфат, магний сульфат и ацета-мид в качестве единственного источника углерода и азота. Эти соединения неохо-димы для дифференциальной диагностики Ps. аeruginosa. Растущие на среде микроорганизмы дезаминирут ацетамид (проявляя ациламидазную активность) [4].
В результате дезаминирования ацета-мида образуется аммиак, сдвигающий рН в щелочную сторону (рН = 8,5). Среда меняет цвет с жёлто-оранжевого на лилово-красный.
• ЦПХ-агар — это тип среды, в состав которой входят химические вещества, обладающие антимикробным действием в отношении бактерий — возможных ассо-циантов синегнойной палочки, а в качестве селективного агента добавляли цетилтри-метиламмоний бромид (цетримид — агар), который подавляет рост на среде сопут-
ствующих бактерий, а Ps. аeruginosa даёт обильный рост.
Способность расти на ацетамидном агаре при t = 42оС и отсутствие роста при t = 5оС позволили отнести выделенную культуру к Ps. аeruginosa.
Просматривая результаты посева 12 опытных образцов через 24 ч, было отмечено наличие беспигментных колоний, выросших как на контрольных, так и на экспериментальных средах.
Культуры, подозрительные на колонии синегнойной палочки, исследовали на способность образовывать цитохромоксида-зу, используя индикаторные бумаги (СИБ). Беспигментные колонии, дающие положительный цитохромоксидазный тест, отбирали и суспензировали в 0,5 мл физиологического раствора, а затем отсевали на следующие питательные среды:
• среду Кинг Б, используемую для усиления способности синегнойной палочки продуцировать сине-зелёный пигмент пиоцианин или другой пигмент — пиорубин, дающий красное окрашивание;
• среду Хью-Лейфсона с глюкозой — для определения способности псевдомонад окислять глюкозу до глюконовой кислоты в аэробных условиях. Посев производили методом укола в столбик питательной среды;
• ацетамидный агар, являющийся дифференциальной средой для Ps. aeruginosa;
• косяки с экспериментальными питательными агарами — для определения способности культур к росту при 42 и 5оС.
Засеянные культуры ставили в термостат при 42оС и в холодильный шкаф при 5оС.
На 3-й день, просматривая результаты посевов второго дня, установили, что на среде Кинг Б вокруг выросших колоний можно видеть сине-зелёное окрашивание за счёт продуцирования пигмента пиоциа-нина.
На среде Хью-Лейфсона с глюкозой отмечалось порозовение среды.
Рост культур на ацетамидном агаре, способность расти при t = 42оС и отсутствие роста при 5оС позволило отнести выделенную культуру к виду Ps. aeruginosa.
Считаю, что беспигментные колонии были получены в результате пересева чистой культуры Ps. aeruginosa на экспериментальные питательные среды.
Таблица 2
Сравнительная характеристика роста Pseudomonas aeruginosa на экспериментальных и контрольных средах (М±m)
Питательные среды КОЕ х 106/г Характер роста Морфология колоний Морфология клеток Цитохро-моксидаза
Экспериментальная среда 129,0±0,2 Хороший Зеленоватые слизистые колонии 0,2±0,05 мм Гр (-) палочка, 1,5-3,0±0,4 мкм, расположенная одиночно, парами, короткими цепочками +
Эндо 116,0± 0,5 Хороший Мелкие розовые колонии +
МПБ 172,0±0,1 Обильный Равномерное помутнение с сероватой плёнкой на поверхности и осадком на дне +
Ацетамидный агар 156,0±0,3 Обильный Зеленовато-синие слизистые колонии 0,2±0,05 мм +
ЦПХ-агар 154,0±0,6 Обильный Зеленоватые слизистые колонии 0,2±0,05 мм +
МПА 148,0± 0,2 Хороший Сероватые полупрозрачные крупные колонии 3-5 мм +
Для исследования ростовых качеств Ps. aeruginosa использовали метод посева (после 106-кратного разведения) на экспериментальные и контрольные питательные среды.
При культивировании бактерии учитывали морфологию колоний (размер, пиг-ментообразование, цвет, структуру).
Для изучения морфофизиологических, культуральных, тинкториальных свойств выделенного микроорганизма из полученных колоний делали мазки, окрашивали их по Синёву и Граму и микроскопировали [5].
Данные представлены в таблице 2.
Характерной особенностью Ps. aeru-ginosa является положительный тест на образование цитохромоксидазы, флуоресцирующих пигментов, проникающих в субстраты, и специфического запаха жасмина.
Ps. aeruginosa является каталазополо-жительной, даёт отрицательную реакцию на индол, не реагирует с метиленовым красным и не образует ацетилметилкар-бинола.
Культуры синегнойной палочки образуют пигменты различного цвета (сине-зелёного, зеленовато-жёлтого, фиолетового, красного и др.).
Цвет колоний зависит от рН среды, например, сине-зелёный в нейтральной или щелочной, красный — в кислой среде.
На всех типах питательных сред биологические свойства Ps. aeruginosa однотипны.
Исследования по учёту выросших колоний показали, что на всех экспериментальных средах (по сравнению с
контрольными) отмечался хороший рост Ps. aeruginosa.
Ростовые качества бактерии на экспериментальной питательной среде и на стандартизированных средах промышленного производства практически однотипны.
Выводы
1. Впервые разработаны рецептура и методики приготовления питательной среды, предназначенной для культивирования синегнойной палочки, в качестве базовой основы которой явился свекловичный отвар.
2. Полученная питательная среда на основе свекловичного отвара по ростовым качествам не уступает стандартизированным питательным средам промышленного производства.
3. Исследование Ps. aeruginosa показало, что морфо-физиологические, культу-ральные, тинкториальные и биохимические свойства данного микроорганизма не меняются.
4. Полученная питательная среда обеспечивает типичный рост Ps. aeruginosa, стабильность сохранения их основных биологических свойств и может быть использована при культивировании данного микроорганизма.
Библиографический список
1. Возняковская Ю.М. Эпифитная микрофлора растений и урожай / Ю.М. Возняковская. — М.: Колос, 1969. — С. 173.
2. Методы контроля бактериологических питательных сред: метод. указания // МУК 4.2.2316-08. — М., 2008.
3. Нетрусов А.М. Практикум по мик- ляк, М.Э. Сухаревич, В.И. Сухаревич. — робиологии / А.М. Нетрусов, Л.М. Его- СПб.: НИЦФ, 2003. — С. 148.
рова. — М.: ACADEMIA, 2005. — С. 574. 5. Хоулт Дж. Определитель бактерий
4. Поляк М.С. Питательные среды для Берджи / Дж. Хоулт, Н. Криг, П. Снит. —
медицинской микробиологии / М.С. По- М.: Мир, 1997.
+ + +
УДК 595.79:591.5(571.1) А.Т. Демидова
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОТОПИЧЕСКОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И ОТНОСИТЕЛЬНОГО ОБИЛИЯ ШМЕЛЕЙ (HYMENOPTERA, АРЮАЕ,
ВОМВи LATR.) ЗОНАЛЬНЫХ, АЗОНАЛЬНЫХ И АНТРОПОГЕННЫХ ЭКОСИСТЕМ СРЕДНЕОБСКОЙ НИЗМЕННОСТИ
Ключевые слова: шмели, Среднеоб-ская низменность, биотопическое распределение, обилие, тайга, Западная Сибирь, разнообразие.
Введение
Шмели характеризуются очень тесными связями с растительностью и зависят не только от отдельных видов растений, представляющих их кормовую базу, но и от типа растительных ассоциаций, создающих специфическую топическую, микроклиматическую и ценотическую среду. Многие шмели обладают широкой экологической пластичностью и встречаются в различных биотопах зональных, азональных и антропогенных экосистем. Приуроченность шмелей к определенным биотопам в различных регионах изучалась многими учеными [1-3]. В наших исследованиях особое внимание уделяется биотопическому распределению шмелей Сред-необской низменности.
Материал и методика работы
Исследования биотопического распределения шмелей проводили в летние периоды с 2006 по 2010 гг. в различных биотопах, расположенных в Среднеоб-ской низменности (Ханты-Мансийский автономный округ, Томская область).
Общий объем изученного материала составил свыше 5400 особей шмелей рода Bombus Latr.
При изучении шмелей использовались общие методики энтомологических исследований: В.В. Попов [4], К.К. Фасулати
[5], Ю.А. Песенко [6] и др. Идентификация видов велась с использованием основных определителей: А. L0ken [7, 8], А.Н. Купянская [9], Д.В. Панфилов [10]. Название видов шмелей даны по П. Виль-ямсу [11, 12]. Учеты проводились маршрутным методом: индивидуальный отлов стандартным энтомологическим сачком на площади 500 м2 в течение 30 мин. Относительное обилие видов определялось по доле особей в сборах и пятибалльной логарифмической шкале Ю.А. Песенко [13]. Для оценки видовой устойчивости и разнообразия сообщества рассчитаны индексы разнообразия Шеннона-Уивера (Н') и выравненности (Е). Кроме них использовали индекс доминирования Симпсона ф5т). В качестве меры сходства фаун использовался коэффициент общности Че-кановского-Съеренсена (1-1С5) [14].
Результаты и их обсуждения
Для решения поставленной задачи нами было выявлено четырнадцать наиболее типичных биотопов для рассматриваемого региона. Эти биотопы были объединены в сходные группы по ландшафтным характеристикам.
В зональных экосистемах средней и северной тайги Западной Сибири в пределах Среднеобской низменности были обследованы по два биотопа: смешанные и темнохвойные леса в средней тайге, свет-лохвойные и смешанные леса — в северной.
В азональных природных комплексах шесть биотопов: четыре топических ком-
