CC BY
68
УДК 579.246.2 И.Б. Бороздина
ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS В ВОДНОЙ ЭКОСИСТЕМЕ РЕКИ КУБАНИ
Ключевые слова: Pseudomonas, река Кубань, водная экосистема, пробы воды.
Введение
Водная толща реки Кубани заселена большим количеством микроорганизмов.
Определение общей численности Pseudomonas в естественных водах является актуальным на современном этапе исследований, так как распределение и видовой состав бактерий этого рода играют важную роль в санитарно-микробиологичес-ком аспекте.
Распределение представителей рода Pseudomonas в реке Кубани связана с определением их доли в микробном сообществе, а также роли в экосистеме реки в целом.
Изучение видового состава необходимо для экологического мониторинга качества воды в реке Кубани, так как отдельные виды Pseudomonas относятся к потенциально патогенным бактериям, и поэтому некоторые учёные предлагают использовать Pseudomonas aeruginosa в качестве дополнительного индикатора качества воды [1]. Поэтому идентификация различных представителей рода Pseudomonas и изучение их биологических свойств является актуальной проблемой современности.
Бактерии рода Pseudomonas — большая гетерогенная группа микроорганизмов, широко населяющих биосферу и принимающие активное участие в процессах минерализации органических соединений, очищении окружающей среды от загрязнения. Они являют собой пример истинного космополитизма, в основе которого лежит их высокая биохимическая лабильность, обеспечивающая им приспособляемость к разнообразным условиям среды [2].
Цель исследования: выделить, идентифицировать и изучить морфологические, культуральные, тинкториальные и биохимические свойства видов рода Pseudomonas в реке Кубани, а также их распределение в воде и придонных слоях воды.
Задачи:
• выявить, идентифицировать представителей рода Pseudomonas в воде реки Кубани на глубине 10 и 50 см;
• исследовать количественный состав Pseudomonas, выделенных в кубанской воде в весенне-летний период;
• изучить закономерности распределения бактерий рода Pseudomonas в воде на глубине 10 и 50 см.
Материалы и методы
Исследование проводили в весенне-летний период 2010 г. с поверхности реки Кубани вблизи населённого пункта Старая Станица и лесной зоны г. Армавира. Изучение микрофлоры речной воды проводили на базе бактериологической лаборатории СЭС г. Армавира.
Отбор проб проводили с использованием помостов в местах, где глубина реки не менее 0,5 м.
Поверхностные пробы отбирали стерильным батометром в ёмкости (1-2 л), специально предназначенные для этих целей, плотно закрывающиеся резиновыми пробками с интервалами 3-5 минут [3].
Глубинные пробы отбирали специальным батометром, предназначенным для этих целей.
Поверхностные пробы отбирали с глубины 10 см от поверхности воды, а придонные пробы — 50 см от дна.
Пробы воды отбирали 1 раз в месяц в 3-кратной повторяемости каждого образца. За весь период исследования было проанализировано около 30 проб кубанской воды.
Отобранную пробу воды маркировали и в сопроводительных документах указывали места отбора проб, дату, время забора и другую информацию (температуру воды, погодные условия).
Доставку проб воды осуществляли в контейнерах — холодильниках при температуре 4оС.
Вне лаборатории проводили первичную обработку проб воды (фильтрование).
В лаборатории воду отстаивали 2 ч. После этого надосадочную жидкость сливали, осадок разливали в пробирки ёмкостью по 20 мл и центрифугировали в течение 5 мин. при 1500 об/мин. [4].
Надосадочную жидкость сливали, а полученный осадок использовали для идентификации бактерий рода Pseudomonas.
Экспериментальная часть
Для определения бактериального состава пробы воды высевали на плотные питательные среды: 5%-ный кровяной агар, МПА с 2%-ным глицерином, ГРМ-агар [5].
На данных средах изучали 2 группы микроорганизмов: гетеротрофов и представителей рода Pseudomonas. Затем проводили отбор типичных колоний Pseudomonas.
Санитарно-бактериологические анализы воды выполняли с использованием метода десятикратных серийных разведений.
Колонии бактерий пересевали на первично-дифференцирующие среды (Кларка, Хью-Лейфсена, ацетамидный агар, Кинг-Б) и использовали системы индикаторные бумажные (СИБы).
Все засеянные питательные среды инкубировали в течение 24 ч при температуре 37оС.
Для определения максимальных и минимальных температур роста колоний посевы инкубировали в термостате при оптимальной t = 37оС, а также в холодильнике при t = 5оС в течение 18-24 ч и рН среды 7,2-7,4.
Среду Кинг Б использовали для усиления способности псевдомонад продуцировать сине — зелёный пигмент пиоцианин, ярко-красный — пиорубин и бурый — пио-вердин.
Среду Хью-Лейфсена с глюкозой применяли для определения способности псевдомонад окислять глюкозу до глюко-новой кислоты в аэробных условиях. Посев производили в два столбика агара, один из которых заливали 1 мл стерильного вазелинового масла. Посевы инкубировали в термостате в течение 24 ч при t = 37оС.
Ацетамидный агар использовали для дифференциальной диагностики Ps. aeruginosa, поскольку она обладает способностью использовать ацетамид в качестве единственного источника азота и углерода.
Морфологические и тинкториальные свойства клеток (формы, размеры, их
подвижность) изучали с помощью окраски мазков по Граму и Синёву, также микро-скопировали нативные препараты.
Окраску жгутиков производили по методу Лёффлера в модификации Пешкова.
Гемолитическую активность определяли при просмотре через 24 ч колоний, выросших на 5%-ном кровяном агаре.
Наличие зон просветления вокруг колонии указывает на наличие в культуре гемолиза.
Для изучения продукции каталазы на предметное стекло наносили каплю 3%-ного раствора перекиси водорода и петлёй вносили исследуемую суточную культуру. Образование пузырьков газа подтверждало положительную каталазную активность.
Гидролиз крахмала определяли путём обработки агаровой пластинки раствором Люголя. Для этого на поверхность среды наливали 3-5 мл раствора Люголя. Среда, содержащая крахмал, окрашивалась в синий цвет, а зона гидролиза оставалась бесцветной.
С помощью индикаторных бумаг СИБ определяли способность колоний образовывать цитохромоксидазу. Исследуемую культуру наносили на смоченную физиологическим раствором индикаторную бумагу. При положительной реакции на месте нанесения культуры появлялось синее окрашивание бумаги в течение 30 с.
Остальные биохимические тесты (леци-тиназа, манит и др.) определяли с помощью СИБ.
Характерной особенностью большинства представителей рода Pseudomonas является положительный тест на образование цитохромоксидазы, а также образование различных пигментов (сине-зелёного, зеленовато-жёлтого, флуоресцирующего фиолетового, красного и др.).
В зависимости от условий роста и состава питательной среды пигменты образуются в различных количественных соотношениях, и поэтому окраска культураль-ной среды может изменяться. Иногда какой — либо из пигментов может утрачиваться совсем. Все виды, входящие в этот род, являются каталазоположительными, дают отрицательные реакции на индол, не реагируют с метиловым красным и не образуют ацетилметилкарбинола.
Морфологию колоний, размер, пиг-ментообразование, цвет, структуру, определяли при культивировании на плотных питательных средах.
На МПА Ps. fluorescens отмечается диссоциация на 3 колониальных типа:
1) желтовато-серые, слабо выпуклые, маслянистой консистенции;
2) слизистые, выпуклые, розоватые, крупные;
3) розоватые, более плотные, мелкие.
Колонии Ps. putida на МПА образуют круглые, гладкие, с блестящей поверхностью, желтоватые, прозрачные колонии.
Ps. alcaligenes при росте на кровяном агаре образует колонии с тонкими, неровными, «ползущими» краями.
Колонии Ps. putida на МПА образует круглые, гладкие, с блестящей поверхностью, желтоватые прозрачные колонии.
Ps. aeruginosa на МПА образует зеленоватые слизистые колонии.
При росте на МПА Ps. diminuta образует колонии белого цвета.
Ps. pseudoalcaligenes характеризуется способностью окислять сахара и расти при 42оС, образуя на кровяном агаре колонии серовато-белого цвета.
Ps. maltophilia на МПА образует слизистые, выпуклые к центру, желтовато-серые, более жёлтые в центре колонии.
Идентификацию микроорганизмов проводили на основании морфофизиологиче-ских, культуральных, тинкториальных,
биохимических свойств в соответствии с Определителем бактерий Берджи [6].
Статистическая обработка данных проводилась в пакете программ Microsoft Office Excel 2003 (Корпорация Microsoft, 2003).
Обсуждение результатов
Биоразнообразие бактерий рода Pseudomonas, высеянных из воды реки Кубани на глубине 10 и 50 см, представлена следующими видами: Ps. acidovorans, Ps. alcaligenes, Ps. fluorescens, Ps. putida, Ps. aeruginosa, Ps. cepacia, Ps. diminuta, Ps. maltophilia, Ps.pseudoalcaligenes, Ps. putida, Ps. putrefaciens, Ps. stutzeri, Ps. testosteroni, Ps. mendocina, Ps. caryo-phylli.
Условно-патогенные виды Ps. aeruginosa, Ps. cepacia, и Ps. caryophylli выделили из воды вблизи населённого пункта Старая Станица, так как там имеется влияние хозяйственно-бытовых сточных вод и других антропогенных факторов.
Наибольшее количество представителей рода Pseudomonas наблюдалось в пробах, взятых на глубине 10 см, что составляло 54,6% от количества гетеротрофов в летний период в районе населённого пункта Старая Станица.
Esherichia coli
Enterobacter agglomerans Aeromonas spp
Proteus spp
Pseudomonas spp
Alcaligenes faecalis
Рис. 1. Качественный состав микрофлоры воды реки Кубани на глубине 10 см
Таблица 1
Численность бактерий рода Pseudomonas, выделенных из воды реки Кубани
в весенне-летний период 2010 г., %
Место отбора проб Глубина 10 см 50 см
весенний период летний период весенний период летний период
Район Старой Станицы 33,9 54,6 15,6 23,2
Район Лесхоза 21,5 34,3 11,3 17,7
В поверхностных слоях преобладают в основном сапрофитные и условно-патогенные формы микроорганизмов: Ps. acidovorans, Ps. alcaligenes, Ps. fluores-cens, Ps. putida, Ps. cepacia, Ps. diminuta, Ps. maltophilia, Ps.pseudoalcaligenes, Ps. putida, Ps. aeruginosa, Ps. putrefaciens, Ps. stutzeri, Ps. testosteroni, Ps. caryophyll, Ps. mendocina.
В летнее время с повышением температуры воды и увеличением содержания взвешенного вещества в реке Кубани количество сапрофитной и условно-патогенной флоры возрастает как в районе населённого пункта, так и в районе армавирского лесхоза (54,6 и 34,3%; 23,2 и 17,7%) в зависимости от глубины взятия проб.
Мозаичность распространения микроорганизмов в воде на различной глубине связана с неоднородностью рельефа и влиянием течений.
Выводы
В ходе экспериментальной работы идентифицировано 15 видов рода Pseudomonas в пробах воды из реки Кубани на глубине 10 и 50 см: Ps. acidovorans, Ps. alcaligenes, Ps. fluorescens, Ps. putida, Ps. cepacia, Ps. diminuta, Ps. maltophilia, Ps. pseudoalcaligenes, Ps. putida, Ps. pu-trefaciens, Ps. stutzeri, Ps. aeruginosa, Ps. testosteroni, Ps. caryophylli, Ps. mendocina.
В микрофлоре воды на глубине 10 и 50 см доминировали условно-патогенные бактерии родов Pseudomonas и Aeromo-nas.
Весной численность Pseudomonas на глубине 10 см в районе Старой Станицы составила 33,9%, 50 см — 15,6% . В летнее время численность бактерий данного рода в районе населённого пункта на глу-
бине 10 см составляла 54,6%, 50 см — 23,2%.
В водах реки Кубани, протекающей в районе армавирского лесхоза, численность Pseudomonas в весенний период на глубине 10 см составляла 21,5%, 50 см — 11,3%. Численность этих микроорганизмов в летний период составляла на глубине 10 см — 34,3%, 50 см — 17,7%.
Виды Ps. fluorescens, Ps. putida, Ps. stutzeri, Ps. mendocina выделяются повсеместно.
Виды Ps. aeruginosa, Ps. cepacia, Ps. caryophylli выделяются в основном в водах вблизи населённых пунктов там, где имеется влияние хозяйственно-бытовых сточных вод, а также связано с неоднородностью рельефа и влиянием течений и составляют менее 1% в районе населённого пункта и отсутствуют в водах реки, протекающей на территории лесхоза.
Библиографический список
1. Кузнецов С.И. Микробиологическое изучение внутренних водоёмов / С.И. Кузнецов, В.И. Романенко. — М.: Наука, 1963.
2. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas / Е.Л. Рубан. - М.: Наука, 1986.
3. МУК 4.2. 1884-04. Санитарно-микро-биологический, санитарно-паразитологи-ческий анализ воды поверхностных водных объектов. — М., 2004.
4. ГОСТ 18963-73. Методы санитарно-биологического анализа воды. — М.: Стандартинформ, 2006.
5. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов. — М.: ACADEMIA, 2005.
6. Хоулт Дж. Определитель бактерий / Дж. Берджи Хоулт, Н., Криг П. Снит. — М., 1997.
+ + +
