CC BY
79
2004
Известия ТИНРО
Том 136
УДК 577.1
М.Б.Гуляков; Т.Н.Пивненко, Н.Н.Ковалев, Ю.М.Позднякова,
Л.М.Эпштейн (Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, г. Санкт-Петербург; ТИНРО-центр, г. Владивосток)
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ БАД ИЗ МОРСКИХ ГИДРОБИОНТОВ НА ФИЗИЧЕСКУЮ РАБОТОСПОСОБНОСТЬ
Проведено сравнительное исследование влияния БАД из молок гидробион-тов на физическую работоспособность животных и человека. Для исследования были взяты БАД, полученные различными способами и из разных видов гидроби-онтов, а также исходные сублимированные ткани. Показана наибольшая эффективность всех испытуемых образцов из молок лососей в опытах по вынужденному плаванию крыс. Приведен фракционный состав олигонуклеотидов для различных БАД. Показано влияние низкомолекулярной ДНК на физическую работоспособность человека по гарвардскому степ-тесту у близнецов, принимавших БАД и плацебо.
Guljakov M.B., Pivnenko T.N., Kovalev N.N., Pozdnjakova Ju.M., Ep-shtein L.M. Comparative research of BASF from marine hydrobionts influence on physical efficiency // Izv. TINRO. — 2004. — Vol. 136. — P. 315-320.
The influence of BASF extracted from milts of hydrobionts on capacity for work of men and animals is studied comparatively. The BASF were used obtained by various methods from different species, including frozen-dried tissues. The samples extracted from salmon milts were the most efficient in experiments on compelled swimming of rats. The influence of a low molecular weight DNA on human physical capacity for work was shown by Harvard step-test for the twins had taken the BASF and placebo. The fraction contents of oligonucleotides are presented for certain BASF.
Актуальной задачей нутрициологии является увеличение физической работоспособности человека путем рационализации питания. Для решения проблемы рационализации питания широкое распространение получили биологически активные добавки к пище (БАД).
Одним из известных полисистемных парафармацевтиков (БАД, влияющих на функциональную активность) является низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб (Пат. № 915446). Ранее было показано, что эта добавка повышает сопротивляемость организма, снижает уровень содержания холестерина в крови, улучшает реологические свойства крови, усиливает репродуктивные функции, является мягким иммунокорректором (Касьяненко и др., 1997, 1999; Беседнова и др., 1999). Также было определено стимулирующее влияние этого препарата на физическую работоспособность (Касьяненко и др., 1997). Препарат низкомолекулярной ДНК из молок лососевых имеет сложный химический состав, включающий в себя 70-80 % ДНК с молекулярной массой 300 кДа (в отличие от нативной ДНК с молекулярной массой, превышающей 106 кДа), в среднем 8 %
белков и 2 % липидов (Беседнова, Эпштейн, 2002). До сих пор неизвестны механизмы биологической активности ДНК лососей.
В ТИНРО-центре разработана технология БАД " Нуклеатин" из гонад гидроби-онтов: лососей, сельди, минтая, гребешка, — представляющей собой комплекс биологически активных веществ и содержащей олигонуклеотиды и нуклеиновые кислоты с молекулярной массой 6-500 кДа (в сумме до 30 %), свободные аминокислоты, сумма которых составляет в среднем 31 %, а также до 20 % низкомолекулярных белков и пептидов. Для выделения конечных продуктов и получения растворимой формы ДНК использовали метод ферментативного гидролиза препаратами, содержащими протеолитические и нуклеолитические ферменты (Позднякова, 2003).
Целью настоящей работы явилось сравнительное исследование влияния БАД (низкомолекулярной ДНК и Нуклеатина) из морских гидробионтов на физическую работоспособность крыс и определение влияния наиболее эффективного из исследованных препаратов на физическую работоспособность человека.
Метод получения ДНК. ДНК получали из мороженых гонад гидробионтов Ш-ГУ стадии зрелости. Метод выделения ДНК основан на солевой экстракции с последующим осаждением конечного вещества из раствора этиловым спиртом и удалением влаги сушкой на воздухе при комнатной температуре (Касьяненко и др., 1997).
Метод получения Нуклеатина. Измельченные гонады смешивали с водой в соотношении 1: 2; доводили рН экстракта до 8,0; добавляли ферментный препарат — 1-2 % от массы сырья. В качестве источника ферментов использовали гепатопанкреатин, выделенный из гепатопанкреаса камчатского краба (Пив-ненко и др., 1997). Протеолитическая активность препарата составляла 300 Е/г, нуклеазная — 16300 Е/г. Гидролиз вели при температуре 37 °С 2-5 ч. Инакти-вировали ферментный препарат при температуре 80 °С 20 мин, отделяли нерастворимые компоненты и высушивали конечный продукт.
Определение биологической активности препаратов по методу вынужденного плавания крыс. Эксперименты проведены на 220 самцах белых крыс линии Сперг-Доули массой 200-230 г. На подготовительном этапе эксперимента животные были разделены на 11 групп по 20 крыс в каждой и в течение 21 сут получали стандартный пищевой корм с соответствующими добавками. В стандартный ежедневный пищевой рацион каждого животного добавлялось: 1-й группе (контроль) — стандартный корм; 2-й группе — 4 мг низкомолекулярной (н/м) ДНК горбуши; 3-й группе — 4 мг н/м ДНК минтая; 4-й группе — 4 мг н/ м ДНК сельди; 5-й группе — 7 мг сублимированных молок горбуши; 6-й группе — 12 мг сублимированных молок гребешка; 7-й группе — 12 мг сублимированных молок минтая; 8-й группе — 4 мг Нуклеатина из молок горбуши; 9-й группе — 4 мг ферментативного гидролизата молок горбуши после экстракции ДНК; 10-й группе — 8 мг Нуклеатина из гонад гребешка; 11-й группе — 8 мг Нуклеатина из молок минтая.
Исследуемые добавки механически перемешивали с размельченным стандартным гранулированным кормом. Суточная норма потребления составляла 15 г на каждое животное. Постоянно контролировалась полнота поедания корма. Через 21 сут содержания животных на указанных рационах переходили к основному этапу эксперимента.
На основном этапе эксперимента производилось определение физической работоспособности по методу вынужденного плавания. Численным показателем служила относительная длительность плавания, выраженная в процентах по отношению к средней длительности плавания контрольной группы.
Испытания проводились в открытом бассейне, состоящем из 10 отсеков размером 600х400х800 мм каждый, при температуре воды 16 °С. За окончание плавания принимался момент, после которого крыса в течение 5 с не появлялась над поверхностью воды и не осуществляла активных попыток к всплытию или поискового поведения под водой.
Статистическая обработка результатов эксперимента включала в себя определение средних значений величин и стандартной ошибки средней. Достоверность различий между средними величинами оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента.
Исследования на людях проводилось по близнецовому методу. Известно, что каждый человек имеет уникальный набор генов, поэтому при воздействии на организм лекарственных или иных веществ реакция на них строго индивидуальна и для получения репрезентативных данных и выделения определенных закономерностей воздействия необходимо обследование большой группы испытуемых. Учитывая этот факт, для решения поставленной задачи был применен близнецовый метод, поскольку монозиготные близнецы имеют одинаковый набор генов, что значительно уменьшает необходимый объем выборки и повышает эффективность исследований.
Исследования проведены на 21 паре близнецов. В се обследованные близнецы относились к группе практически здоровых лиц. Средний возраст составлял 24 года. Было обследовано 10 пар близнецов женского и 11 пар мужского пола. По тесту зиготности все пары относились к монозиготным, т.е. генетически идентичным близнецам.
Уровень физической работоспособности определялся по Г арвардскому степ-тесту, основанному на методическом приеме изучения физической работоспособности, позволяющем выполнять нагрузки с мощностью, равной 40-60 % от максимального потребления кислорода (Бойков, 1984). О физической работоспособности судили по индексу Р.с. = t " 100/(f + f2 + f3) ' 2, где t — время восхождения, с; f — частота пульса за 30 с на 2-, 3- и 4-й минутах восстановления. Выполнение степ-теста в исследованных нами группах близнецов проводилось на ступеньке 40 см в течение 5 мин (30 циклов подъем—спуск в минутах).
Тестирование осуществляли до приема препарата и через 2 нед после ежедневного одноразового приема низкомолекулярной ДНК из молок горбуши в дозе 800 мг. Препарат принимали по методу " двойного слепого контроля", когда один из пары близнецов получал в капсуле препарат ДНК, а второй — в такой же капсуле плацебо.
Результаты экспериментов на крысах представлены в табл. 1.
Таблица 1
Влияние на физическую работоспособность крыс БАД из морских гидробионтов
Table 1
Influence on rat's physical efficiency of the BAFS from sea hydrobiontes
Наименование добавки Доза, мг/сут Время плавания, с Уровень физической работоспособности, % Достоверность различий с контролем
Контроль 0 438 ± 32 100,0
Н/м ДНК горбуши 4 578 ± 44 132,0 99
Н/м ДНК минтая 4 442 ± 38 101,0 -
Н/м ДНК сельди 4 436 ± 37 99,5 -
Сублимированные молоки
горбуши 7 514 ± 32 15,0 95
Сублимированные молоки
гребешка 12 456 ± 28 104,0 -
Сублимированные молоки
минтая 12 427 ± 37 97,0 -
Нуклеатин из молок
горбуши 4 502 ± 33 115,0 95
Ферментативный гидролизат
из молок горбуши после
экстракции ДНК 4 440 ± 28 100,5 -
Нуклеатин из гонад гребешка 8 444 ± 41 101,0 -
Нуклеатин из молок минтая 8 459 ± 38 105,0 -
Сравнение всех полученных данных показывает, что наиболее выраженным влиянием на физическую работоспособность обладает низкомолекулярная ДНК из молок горбуши (повышение уровня работоспособности на 32 %). Аналогичные препараты из молок сельди и минтая не оказывали влияния на физическую работоспособность.
Усиление работоспособности наблюдалось при применении сублимированных молок горбуши (15 %), Нуклеатина из молок горбуши (15 %), но не для аналогичных препаратов из гребешка или минтая.
Таким образом, полученные результаты показали, что действующее звено влияния на физическую работоспособность среди исследованных добавок включает в свой состав ДНК, содержащуюся в молоках горбуши.
Различия в биологической активности препаратов, выделенных из разных источников, могут зависеть от химического состава ткани молок. Известно, что у ряда рыб в хроматине зрелых сперматозоидов гистоны полностью замещаются на низкомолекулярные, высокоосновные, примитивные по первичной структуре протамины (лосось, сельдь), в то время как у некоторых видов даже в зрелых молоках содержатся гистоны (тресковые) (Заленский и др., 1980). Кроме того, на активность препаратов может влиять и молекулярная масса нуклеиновых кислот, входящих в состав молок. Проведенные ранее исследования (Позднякова и др., 2003) показали, что низкомолекулярная ДНК и Нуклеатин, выделенные из молок горбуши, минтая, сельди и гребешка, содержат в своем составе несколько фракций нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов и существенно различаются по составу (табл. 2).
Наиболее вероятно, что биологическая активность ДНК как фактор, усиливающий физическую работоспособность, зависит от видовых особенностей гидробионтов.
Вторая часть работы была посвящена исследованию влияния низкомолекулярной ДНК из молок горбуши на физиологические функции человека. Результаты экспериментов приведены в табл. 3.
Приведенные в табл. 3 данные показывают, что низкомолекулярная ДНК из молок горбуши значимо повышает физическую работоспособность человека (средняя разница коэффициентов работоспособности по Гарвардскому степ-тесту до и после приема препарата составила 6,47 по сравнению с 0,41 для контроля), причем плацебо не имеет такого эффекта. Известно, что физическая работоспособность является интегральным показателем и представляет собой сложноорганизованный акт, в реализации которого в той или иной степени задействованы все функциональные системы организма, и в первую очередь на оптимальный уровень физической работоспособности оказывает влияние протекание процессов в центральной нервной системе. Это позволяет предположить наличие стимулирующего эффекта на психофизиологические показатели и умственную работоспособность человека. В дальнейшем предполагается провести сравнительное исследование действия препаратов низкомолекулярной ДНК и Нуклеатина на психофизиологические функции человека и дать точные рекомендации для использования препаратов в фармакологии.
Таблица 2 Состав и молекулярная масса фракций в препаратах низкомолекулярной ДНК и Нуклеатина из различных источников
Table 2
Structure and molecular weight of fractions in preparations low molecular weight DNA and Nucleatin from various sources
„ Кол-во и молекулярная Препарат . „ С, _r г_масса фракций, кДа
Н/м ДНК горбуши 300
Н/м ДНК минтая 550; 650
Н/м ДНК сельди 17; 312
Н/ м ДНК гребешка 300; 500
Нуклеатин горбуши 6; 41; 68; 300
Нуклеатин минтая 15; 500; 550
Нуклеатин сельди 6; 10; 16
Нуклеатин гребешка 12; 242; 500
Таблица 3
Показатели физической работоспособности по степ-тесту у близнецов, принимавших низкомолекулярную ДНК из молок горбуши и плацебо
Table 3
Parameters of physical efficiency under the step-test at the twins accepting low molecular weight DNA from salmon milt and placebo
Препарат ДНК Контроль (плацебо)
Индекс работоспособности Индекс работоспособности
До приема После приема Разница До приема После приема Разница
71,7 77,9 6,2 72,1 73,0 0,9
68,5 77,1 8,6 67,0 65,7 -1,3
73,3 82,3 9,0 75,0 75,6 0,6
75,6 84,4 8,8 73,2 72,9 -0,3
69,3 73,5 4,2 70,4 72,1 1,7
67,6 77,0 9,4 66,1 66,4 0,3
72,7 74,8 2,1 69,8 69,2 -0,6
72,3 75,6 3,3 70,7 72,8 2,1
69,1 78,3 9,2 71,4 71,2 -0,2
70,0 77,9 7,9 68,7 70,0 1,3
72,3 79,3 7,0 74,3 74,6 0,3
77,9 81,9 4,0 76,2 76,4 0,2
78,9 81,5 2,6 79,2 79,3 0,1
71,9 77,7 5,8 70,8 71,1 0,3
67,4 74,3 6,9 66,2 68,1 1,9
70,7 75,0 4,3 72,2 70,8 -1,4
74,6 83,5 8,9 73,9 74,2 0,3
73,4 80,1 6,7 75,1 75,8 0,7
76,0 81,2 5,2 70,7 71,3 0,6
69,0 77,1 8,1 72,4 71,8 -0,6
76,3 84,0 7,7 75,3 77,1 1,8
Средняя разница 6,47 Средняя разница 0,41
Таким образом, прием БАД из молок лососей оказывает активирующее и стимулирующее действие на различные системы организма, что в итоге создает оптимальные условия для значительного увеличения физической работоспособности человека. Достоверно установлена эффективность действия БАД низкомолекулярной ДНК (300 кДа) и Нуклеатина (6-68 и 300 кДа) из молок горбуши. Можно предположить, что влияние БАД из молок гидробионтов на физическую работоспособность человека и животных зависит от молекулярной массы ДНК, входящей в ее состав, а также от видового происхождения препарата.
Литература
Беседнова H.H., Эпштейн Л.М. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) из молок рыб. Перспективы клинического применения. — Владивосток: ТИНРО-центр, 2002. — 38 с.
Беседнова H.H., Касьяненко Ю.И., Гажа А.К. Иммунотропные свойства де-зоксирибонуклеиновой кислоты из молок лососевых рыб // Антибиотики и химиотерапия. — 1999. — Т. 44, № 10. — С. 13-15.
Бойков Ю.Г. Фармакологическая коррекция утомления. — М.: Медицина, 1984. — 216 с.
Заленский А.О., Буххольц П., Ибрагимов Р.Х. Сравнительное исследование протаминов лососевых рыб // Цитология. — 1980. — Т. 22, № 6. — С. 727-729.
Касьяненко Ю.И., Ковалева Ю.В., Эпштейн Л.М., Артюков А.А. Получение и свойства производных ДНК из молок лососевых // Изв. ТИНРО. — 1997. — Т. 120. — С. 37-43.
Касьяненко Ю.И., Эпштейн Л.М., Гажа А.К. и др. Биологически активная пищевая добавка — дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) из молок лососевых // Изв. ТИНРО. — 1999. — Т. 125. — С. 139-146.
Пат. № 915446. Способ получения ДНК из молок рыб / Гаймула М.А., Кална В.Х., Микстайс У.Я., Эпштейн Л.М. — Заявлено 10.10.80; Опубл. 01.07.81.
Пивненко Т.Н., Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Получение и характеристика белковых гидролизатов с использованием ферментных препаратов различной специфичности // Изв. ТИНРО. — 1997. — Т. 120. — С. 23-31.
Позднякова Ю.М. Технология биологически активных добавок к пище на основе ферментативного гидролиза гонад гидробионтов: Автореф. дис. ... канд. техн. наук. — Владивосток: ТИНРО-центр, 2003. — 24 с.
Позднякова Ю.М., Пивненко Т.Н., Касьяненко Ю.И. Влияние эндогенных ферментов на состав олигонуклеотидов при их выделении из гонад гидробионтов // Прикл. биохимия и микробиол. — 2003. — № 5. — С. 524-529.
Поступила в редакцию 4.03.04 г.
