CC BY
58
2011
Известия ТИНРО
Том 164
УДК 597-1.05(282.256.341)
Ю.М. Позднякова1, Т.Н. Пивненко1, М.А. Захарова2, В.Ж. Цыренов2, С.В. Гомбоева2, В.В. Давидович3*
1 Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр,
690091, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4;
2 Восточно-Сибирский государственный технологический университет,
670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40B, строение 1;
3 Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный
университет, г. Владивосток, ул. Светланская, 25
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СОДЕРЖАНИЯ ДНК И ФЕРМЕНТНОГО СОСТАВА В ГОНАДАХ РЫБ БАЙКАЛЬСКОГО РЕГИОНА
В молоках 6 видов рыб Байкальского региона определены содержание ДНК, активность протеолитических и нуклеолитических ферментов. Активность кислых дезоксирибонуклеаз значительно выше щелочных Ca-, Mg-зависимых. Средние значения активности нуклеолитических ферментов молок пресноводных рыб в 1,2-2,0 раза выше, чем морских. Протеолитические ферменты исследуемого материала характеризуются большей активностью в щелочной зоне рН. В молоках омуля обнаружено наибольшее содержание ДНК из всех исследуемых видов рыб, из них выделена низкомолекулярная ДНК, молекулярная масса которой составляет 380 кДа.
Ключевые слова: ДНК, дезоксирибонуклеазы, протеолитические ферменты, гонады.
Pozdnyakova Yu.M., Pivnenko T.N., Zakharova M.A., Tsyrenov V.Z., Gomboeva S.V., Davidovich V.V. Comparative analysis of DNA content and enzyme composition in gonads of fish from Baikal Region // Izv. TINRO. — 2011. — Vol. 164. — P. 432-437.
Content of DNA and activity of proteolytic and nucleolytic enzymes are determined in milt from 6 fish species-dwellers of Baikal region. The acidic deoxyribonu-cleases activity is higher than the alkaline deoxyribonucleases one. The average value of nucleolytic activity in milt from fresh-water fish is in 1.2-2.0 times larger then the activity of the same enzymes from marine fish. Proteolytic enzymes of investigated samples have higher activity in alkaline pH zone. Content of DNA is the highest in
* Позднякова Юлия Михайловна, кандидат технических наук, научный сотрудник, e-mail: pozdnyakova.julia@yandex.ru; Пивненко Татьяна Николаевна, доктор биологических наук, профессор, заведующая сектором, e-mail: pivnenko@tinro.ru; Захарова Марина Александровна, аспирант, zakharmarina@mail.ru; Цыренов Владимир Жигжитович, доктор биологических наук, профессор, e-mail: office@esstu.ru; Гомбоева Саяна Владимировна, кандидат биологических наук, доцент, e-mail: sv2@rambler.ru; Давидович Валентина Владимировна, кандидат технических наук, старший преподаватель, e-mail: davidvalentina@yandex.ru.
the milt from omul Coregonus migratorius. The low-molecular DNA with molecular mass 380 kDa is extracted from the omul milt.
Keys word: DNA, deoxyribonuclease, proteolytic enzyme, gonad.
Введение
В настоящее время достоверно показана биологическая активность нуклеиновых кислот различного происхождения при их применении в качестве лекарственных препаратов и БАД к пище. Имеющиеся на коммерческом рынке препараты "Деринат" (Пат. № 2005724), ДНКаС, ДНКаВит (Пат. № 915446) получают из молок осетровых и лососевых видов рыб.
ДНК из этих источников может быть выделена в высокомолекулярной и низкомолекулярной формах. Применение высокомолекулярной ДНК в качестве БАД ограничено ее слабой растворимостью в воде и низкой биодоступностью. Низкомолекулярная ДНК (молекулярная масса 2-5 ' 105 Да) из молок лососей обеспечивает следующие эффекты: повышение физической и умственной работоспособности, им-муномоделирующее, противовирусное, кардиопротекторное и противоопухолевое действие (Беседнова, Эпштейн, 2002). Препарат, полученный из молок рыб семейства лососевых методом солевой экстракции с последующим осаждением этиловым спиртом (СЭЗ № 77.99.13.003.Т.002322.10.08), представляет собой комплекс ДНК и протаминов. Содержание ДНК в нем составляет 65-80 % с молекулярной массой около 300 кДа, белка — 5-8 %, что характеризует чистоту препарата. При выделении ДНК большое влияние на степень ее полимерности оказывают эндогенные ферменты (протеазы и нуклеазы), содержащиеся в молоках (Позднякова и др., 2001).
Исследования нуклеолитических ферментов пресноводных видов рыб в основном посвящены изучению ДНКаз пищеварительных органов и печени 2003; Yasuda et al., 2004; Wu et а1, 2008). Например, ДНКаза I, расщепляющая нативную ДНК по двуударному механизму, активируемая ионами Ca2+ и Mg2+, была выделена из печени карпа и карася, а кислые дезоксирибонуклеазы — из печени и молок некоторых видов пресноводных и морских рыб (Амелина, 2005, 2006).
Сведений о протеолитических и нуклеолитических ферментах молок пресноводных рыб в литературе не обнаружено.
Ранее было определено содержание ДНК в гонадах следующих видов рыб и беспозвоночных: кеты, горбуши, сельди, трески, минтая, лемонемы, наваги, мак-руруса, акулы-катрана, гребешка и осьминога (Позднякова и др., 2001). По данному показателю наиболее перспективными для получения БАД были признаны все исследуемые объекты (кроме макруруса, акулы-катрана и осьминога). В гонадах этих видов гидробионтов также была определена активность эндогенных ферментов. Было установлено, что молекулярная масса продуктов ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот и биологическая активность препаратов на их основе зависят от активности эндогенных протеолитических и нуклеолити-ческих ферментов (Позднякова и др., 2003).
Молоки промысловых пресноводных видов рыб также могут служить источником нуклеиновых кислот. Однако до настоящего времени нет сведений о содержании в них ДНК и ферментов, участвующих в ее деградации.
Цель настоящей работы — проведение сравнительного анализа содержания и свойств ДНК в зависимости от активности протеолитических и нуклеолитичес-ких ферментов в гонадах пресноводных видов рыб Байкальского региона, предлагаемых в качестве сырьевого источника для БАД и фармпреператов.
Материалы и методы
В работе использовали гонады следующих 6 пресноводных видов рыб 3-4-й стадии зрелости: лососевые — ленок (Brachymystax lenok), лососеобразные — омуль (Coregonus migratorius), карповые — лещ (Abramis brama) и язь (Leuciscus idus), окунеобразные — окунь (Perca fluviatilis), тресковые — налим (Lota lota).
В качестве субстрата для определения протеолитической активности использовали казеин по Гаммерстену ("Биолар", Латвия), нуклеолитической активности — ДНК молок лососевых ("ICN", США), маркеры для проведения электрофореза — набор олигонуклеотидов риС/Msp I и pBR 322/Alu I ("Сибэн-зим", Россия).
Количественное содержание ДНК в сырье определяли по методу Дише, модифицированному Карклиня (Карклиня и др., 1989), в препарате — по разнице поглощения азотистых оснований (при 270-290 нм), полученных в результате гидролиза ДНК 0,5 %-ной хлорной кислотой (Карклиня и др., 1989). Удельную активность протеолитических ферментов определяли по модифицированному методу Е.Д. Каверзневой (1971) в щелочной среде по скорости гидролиза казеина, а в кислой — гемоглобина. Активность кислой и щелочной Са-, Mg-зависи-мой ДНКаз оценивали по количеству кислоторастворимых олигонуклеотидов, образующихся в процессе гидролиза нативной ДНК (Гафуров, 1999).
Низкомолекулярную ДНК получали по методу, разработанному в ТИНРО-центре (Касьяненко, Пивненко, 1999).
Молекулярную массу нуклеиновых кислот определяли методом электрофореза в 20 %-ном полиакриламидном геле. При приготовлении геля использовали буфер 0,05 М трис-борат (рН 8,3) с 1 мМ этилиндиаминтетрауксусной кислоты. Результаты электрофореза оценивали на денситометре Ultroscan XL (LKB, Швеция). Молекулярную массу нуклеиновых кислот определяли по калибровочным графикам, построенным в координатах зависимости коэффициента Rf от молекулярной массы стандартных маркерных молекул pBR 322/Alu ("Сибэнзим", Россия): 501, 489, 401, 331, 242, 190, 147, 111 кДа.
Результаты и их обсуждение
Ранее было обнаружено (Позднякова и др., 2001), что в молоках морских рыб (кеты, горбуши, сельди, минтая, наваги, трески, макруруса, лемонемы) содержание ДНК варьирует от 2,4 (макрурус) до 7,8 % (кета) на 3-4-й стадии зрелости объектов.
Как показали исследования, содержание ДНК в молоках пресноводных рыб тех же стадий зрелости существенно ниже, чем в молоках морских (см. таблицу).
В икре пресноводных рыб
Содержание ДНК в гонадах пресноводных рыб, % содержание ДНК оказалось зна-Content of DNA in gonads from fresh-water fishes, % чительно меньшим по сравнению
с молоками для всех видов, кроме леща. Наибольшее количество ДНК содержится в молоках омуля и окуня. Именно эти объекты могут быть рекомендованы для выделения ДНК.
Так как молекулярная мас-
Вид рыб Икра Молоки
Окунь 0,50 ± 0,02 3,70 ± 0,18
Язь 0,10 ± 0,01 2,10 ± 0,10
Омуль - 3,70 ± 0,26
Налим 0,100 ± 0,001 1,20 ± 0,07
Лещ 0,80 ± 0,02 0,90 ± 0,05
Ленок 0,20 ± 0,01 1,20 ± 0,08
Примечание. "-" — не определяли. са препаратов ДНК и их биоло-
гическое действие зависит от активности протеолитических и нуклеолитических ферментов, важной задачей является определение этих показателей в исходном сырье.
На рис. 1 представлены результаты определения активности дезоксирибо-нуклеаз в кислой и щелочной зонах рН.
Как и у морских видов рыб (Позднякова и др., 2001), в исследуемых объектах более высокая активность дезоксирибонуклеаз наблюдалась в кислой области рН. Предполагается, что кислые дезоксирибонуклеазы участвуют в созревании сперматозоидов (Нечаевский, Иванов, 1999).
Активность щелочных Са-, Mg-зависимых дезоксирибонуклеаз пресноводных рыб, так же как у морских, значительно ниже, чем активность кислых ДНКаз.
окунь омуль язь налим лещ горбуша сельдь минтай
щелочные ДНКазы рН 7,8 Шкислые ДНКазы рН 5,0
Рис. 1. Активность дезоксирибонуклеаз в молоках морских и пресноводных видов рыб
Fig. 1. Activity of deoxyribonucleases in milt from fresh-water and marine fish species
Наиболее активные щелочные ДНКазы обнаружены в молоках язя. Активность этих ферментов в молоках исследуемых пресноводных видов рыб в среднем в 1,2-2,0 раза выше, чем в морских объектах (рис. 1), что позволяет ожидать более глубокого процесса деструкции ДНК при ее выделении.
В процессе выделения ДНК из молок рыб на первых этапах (гомогенизация и экстракция) рН среды находится в пределах 7, что близко к рН-оптимумам действия щелочных дезоксирибонуклеаз (7,8), поэтому можно предположить, что наибольший вклад в деградацию ДНК будут вносить именно эти ферменты.
Для протеолитических ферментов (рис. 2) установлено преобладание активности в щелочной области рН (за исключением молок ленка). Особенно большое различие по значениям активности щелочных и кислых протеаз отмечено в молоках омуля и леща. Щелочные протеолитические ферменты в молоках пресноводных объектов существенно активнее, чем в молоках морских.
Ищелочные
протеазы pH 8,0
■ кислые протеазы pH 5,0
Рис. 2. Активность протеаз в молоках пресноводных и морских видов рыб Fig. 2. Activity of proteases in milt from fresh-water and marine fish species
Таким образом, результаты исследования показали, что нуклеолитические и протеолитические ферменты молок пресноводных рыб Байкальского региона обладают высокой активностью. Это позволило предположить, что из данного вида сырья ДНК может быть получена в виде низкополимерного производного. Для проверки этого предположения из молок омуля (как объекта с наибольшим содержанием нуклеиновых кислот) методом солевой экстракции и спиртового осаждения была выделена ДНК и определена ее молекулярная масса с помощью электрофореза в 20 %-ном полиакриламидном геле (рис. 3). Молекулярная масса ДНК молок омуля составила 380 кДа, что больше, чем ДНК сельди и горбуши, но значительно меньше, чем ДНК минтая. Это в целом согласуется с величинами активности эндогенных ферментов и гипотезой о взаимосвязи степени полимерности низкомолекулярной ДНК и влиянии исследуемых ферментов.
горбуша минтай
302
Мол. масса, кДа сельдь
Li,
"l---1-
17 312 Мол. масса, кДа
Рис. 3. Электрофореграммы препаратов ДНК из молок различных видов рыб
Fig. 3. Electrophoregrams of DNA preparations from milt of different fish species
Заключение
Проведенные исследования позволили получить сравнительные данные по содержанию ДНК в гонадах рыб Байкальского региона и некоторых видов морских рыб.
Максимальная концентрация ДНК обнаружена в молоках, она составляет от 0,96 (лещ) до 3,75 % (омуль). Перспективными объектами для выделения ДНК являются омуль и окунь.
Определена активность протеолитических и нуклеолитических ферментов в гонадах рыб Байкальского региона. Ферменты, катализирующие процессы гидролиза ДНК в молоках пресноводных видов рыб, как и в морских объектах, наиболее активны в кислой зоне рН, однако значения ферментативной активности в исследуемых пресноводных объектах оказались примерно в 1,2-2,0 раза выше, чем в морских.
Активность протеолитических ферментов молок рыб Байкальского региона максимальна в щелочной зоне рН. Щелочные протеазы значительно активнее в молоках пресноводных объектов, чем морских.
436
Мол. МЭССЭ, кДа ссп
Полученная из молок омуля низкомолекулярная ДНК по молекулярной массе наиболее близка к аналогичной ДНК из молок горбуши и сельди. Для подтверждения биологической активности вновь полученного продукта необходимо проведение медико-биологических испытаний.
Список литературы
Амелина В.С. Возрастные особенности спектра лизосомальных нуклеаз в различных органах ряпушки Coregonus albula L. // Онтогенез. — 2005. — Т. 36, № 5. — С. 369-370.
Амелина В.С. Кислые нуклеазы и их роль в приспособительных реакциях водных организмов : дис. ... канд. биол. наук. — Петрозаводск, 2006. — 175 с.
Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) из молок рыб — перспективы клинического применения (в помощь практическому врачу) : мето-дич. пособие. — Владивосток : ТИНРО-центр, 2002. — 38 с.
Гафуров Ю.М. Дезоксирибонуклеазы. Методы исследования и свойства : монография. — Владивосток : Дальнаука, 1999. — 230 с.
Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз // Прикл. биохимия и микробиология. — 1971. — Т. 7, № 2. — С. 225-228.
Карклиня В.А., Бирска И.А., Лимаренко Ю.А. Количественное определение нуклеиновых кислот в молоках лососевых различными методами // Химия природ. соединений. — 1989. — Т. 1. — С. 122-126.
Касьяненко Ю.И., Пивненко Т.Н. Сравнительные физико-химические характеристики низкомолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из морских гид-робионтов // Изв. ТИНРО. — 1999. — Т. 125. — С. 152-164.
Нечаевский Ю.В., Иванов В.А. ДНК-аза II в сперматозоидах вьюнов (Misgurnus fossilis L.) // Биохимия. — 1999. — Т. 64, № 5. — С. 587-593.
Пат. № 2005724 РФ Способ получения натриевой соли ДНК из молок рыб / И.Х. Урманов, О.И. Серпинский, С.И. Татьков и др. — Заявлено 21.09.95; Опубл. 10.02.97.
Пат. № 915446 СССР Способ получения ДНК из молок рыб / М.А. Гаймула, В.Х. Кална, У.Я. Микстайс, Л.М. Эпштейн. — Заявлено 10.10.80; Опубл. 01.07.81.
Позднякова Ю.М., Пивненко Т.Н., Касьяненко Ю.И. Влияние эндогенных ферментов на состав олигонуклеотидов при их выделении из гонад гидробионтов // Прикл. биохимия и микробиология. — 2003. — Т. 39, № 5. —С. 524-529.
Позднякова Ю.М., Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Касьяненко Ю.И. Исследование активности эндогенных и экзогенных ферментов при получении препаратов из молок различных видов рыб и моллюсков // Изв. ТИНРО. — 2001. — Т. 129. — С. 197-202.
СЭЗ № 77.99.13.003.Т.002322.10.08 от 13.10.2008 "ДНКаС. Биологически активная добавка к пище".
Mogi K., Takeshita H., Yasuda N. et al. Carp hepatopancreatic DNase I: biochemical, molecular, and immunological properties // J. Biochem. — 2003. — Mar. 133.
Wu C., Wang L., Liu C. et al. Mechanism of Cd2+ on DNA cleavage and Ca2+ on DNA repair in liver of silver crucian carp // Fish. Phisiol. Biochem. — 2008. — Mar., vol. 34(1). — P. 43-51.
Yasuda T., Takeshita H., Iida R. et al. A single amino acid substitution can shit the optimum рН of DNase I for enzyme activity biochemical and molecular analysis of piscine DNase I family // Biochim. Biophys. Acta. — 2004. — Jun, № 11. — Р. 1672.
Поступила в редакцию 16.12.10 г.
