CC BY
4Вестник АПК
Ветеринария -; № 2(26), 2017 " "
УДК 619:616.98:578.828.11(571.12)
Ю. В. Глазунов, Я. А. Кабицкая, И. В. Плотников Glazunov Yu. V., Kabitskaya Ya. A., Plotnikov I. V.
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ ПРИЖИЗНЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ И ЭПИЗООТИЧЕСКАЯ СИТУАЦИЯ ПО ЛЕЙКОЗУ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ТЮМЕНСКОЙ ОБЛАСТИ
COMPARATIVE ASSESSMENT OF METHODS OF LIVING DIAGNOSTICS AND EPISOTICAL SITUATION ON BOVINE LEUKOSIS IN TYUMEN REGION
Проведен анализ эффективности серологических и молекулярно-генетических методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота, который показал, то лишь 73,96 % проб серопозитивных животных подтверждаются ПЦР-методом. Установлена результативность применения региональной программы борьбы с лейкозом. Так, с 1986 года количество вирусоносителей уменьшилось на 90,4 % и значительно снизился коэффициент напряженности эпизоотического процесса.
Ключевые слова: лейкоз крупного рогатого скота, ПЦР-диагностика, серологическая диагностика, напряженность эпизоотического процесса.
The analysis of the effectiveness of serological and molecular genetic methods for the diagnosis of bovine leukosis was carried out,it showed that only 73.96 % of samples of seropositive animals were confirmed by the PCR method. The effectiveness of the application of the regional program against leukosis has been established. So, since 1986 the number of virus carriers has decreased by 90.4 % and the coefficient of tension of the epizootic process has significantly decreased.
Key words: bovine leukosis, PCR diagnosis, serological diagnosis, tension of epizootic process.
Глазунов Юрий Валерьевич -
кандидат биологических наук, доцент кафедры инфекционных и инвазионных болезней животных ФГБОУ ВО «Государственный аграрный университет Северного Зауралья» г. Тюмень
Тел.: 8(3452)2-90-16
E-mail: ibvm.veterinarya@yandex.ru
Кабицкая Яна Александровна -
аспирант, заведующая лабораторией ДНК-технологий
Агробиотехнологического центра
ФГБОУ ВО «Государственный аграрный университет
Северного Зауралья»
г. Тюмень
Тел.: 8(3452)2-90-160
E-mail: ibvm.veterinarya@yandex.ru
Плотников Иван Валерьевич -
аспирант кафедры анатомии и физиологии ФГБОУ ВО «Государственный аграрный университет Северного Зауралья» г. Тюмень
Тел.: 8(3452)2-90-160
E-mail: ibvm.veterinarya@yandex.ru
Glazunov Yuri Valerievich -
Ph.D of Biological Sciences, Associate Professor of infectious and invasive diseases of animals Department
FSBEI HE «The Agrarian State University
of Northern Zauralye»
Tyumen
Tel.: 8(3452)2-90-160
E-mail: ibvm.veterinarya@yandex.ru
Kabitskaya Yana Aleksandrovna -
Postgraduate student, Head of the Laboratory
of DNA technologies of the Agro-biotechnological center
FSBEI HE «The Agrarian State University
of Northern Zauralye»
Tyumen
Tel.: 8(3452)2-90-160
E-mail: ibvm.veterinarya@yandex.ru
Plotnikov Ivan Valerievich -
Postgraduate student of Anatomy and Physiology Department
FSBEI HE «The Agrarian State University
of Northern Zauralye»
Tyumen
Tel.: 8(3452)2-90-160
E-mail: ibvm.veterinarya@yandex.ru
Лейкоз крупного рогатого скота - злокачественное лимфопролифера-тивное заболевание, вызываемое вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), относящимся к семейству Retroviridae, роду йеНагеЬгоукив. Возбудитель лейкоза чрезвычайно широко распространен во всем мире. Социальная опасность ВЛКРС не доказана, но известно, что ВЛКРС и вирус Т-клеточного лейкоза человека входят в один и тот же род по суще-
ствующей классификации вирусов [1, 2, 3]. Определено, что в процессе патогенеза лейкоза вирус приводит к трансформации клеток, что представляет собой реальный риск развития онкологических болезней человека [4]. К настоящему времени случаев инфицирования человека ВЛКРС не выявлено, однако вероятность рекомбинации между ВЛКРС и вирусом Т-клеточного лейкоза человека не исключена. К тому же в последние годы некоторые исследовате-
64
,,„ „„„„, щ ^ Ставрооодья
ли установили наличие фрагментов генома провируса у людей, в частности в клетках молочной железы [5].
Кроме потенциальной социальной опасности, лейкоз крупного рогатого скота наносит колоссальный экономический ущерб, складывающийся из снижения продуктивности животных, преждевременной их выбраковки в возрасте старше полугода и как следствие снижения рыночной стоимости животных. Особенно актуально это для хозяйств, являющихся племенными репродукторами и племенными заводами, где выбраковка ценных животных существенно отражается на эффективности. Кроме того, на фоне лейкоза развивается иммунодепрессия, которая влечет за собой развитие других заболеваний и снижает эффективность иммунопрофилактики.
Несмотря на успехи в лейкозологии, учитывая социальную значимость лейкоза, отсутствие средств специфической профилактики и невозможность лечения больных и инфицированных животных, проблема лейкоза находится под неусыпным контролем ветеринарных специалистов, серьезно стоит вопрос лейкоза и в Тюменской области [6, 7]. Все это определяет приоритетность и фундаментальность прикладных исследований данной патологии.
На сегодняшний день согласно «Методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота», утвержденным 23 августа 2000 года, диагноз на лейкоз устанавливается в реакции иммунной диффузии (РИД) и иммуноферментного анализа (ИФА), что не позволяет выявить вирусоносительство у молодняка моложе полугода. Эта ситуация осложняет экономическую и селекционно-племенную стороны вопроса. Ветеринарии необходим высокочувствительный метод идентификации заболевания в латентной стадии и стадии вирусоносителей, вне зависимости от возраста животного и его физиологического состояния. Развитие молекулярной генетики в мире и в нашей стране в частности позволяет диагностировать лейкоз крупного рогатого скота с применением геномных технологий уже с 10-дневного возраста животных, используя метод ПЦР-анализа [8].
Полимеразная цепная реакция является альтернативным способом определения лейкоза животных в скрытых стадиях заболевания, а также независимо от физиологического состояния (до и после отела). Идентификация вируса на генном уровне позволяет с высокой степенью достоверности определить распространение больных и вирусоносителей в стаде [9]. Только с помощью ПЦР-анализа можно идентифицировать провирусную ДНК лейкоза животных, так как он является высокочувствительным и специфическим методом прямой диагностики возбудителя. Следует обратить внимание, что в публикациях некоторых авто-
ров отмечены несовпадения результатов РИД и ПЦР-диагностики по выявлению данного заболевания. В 10 % случаев у серопозитивных и РИД-положительных животных при использовании метода ПЦР диагноз не был подтвержден. Поэтому считается целесообразным проводить комплексные исследования в диагностике лейкоза. Отличия в полученных результатах исследователи объясняют малым количеством ДНК у больных особей в стадии алимфатического или персистирующего лимфоцитоза, низким уровнем чувствительности ПЦР, региональной вариабельностью провирусной ДНК в образцах, а также генотипической неоднородностью вируса [10].
Лейкоз крупного рогатого скота был в Тюменской области установлен в 1968 году. Перенимая знания ученых из соседней Свердловской области, имеющих колоссальный опыт по оздоровлению региона, в Тюменской области также предпринимаются серьезные меры для ликвидации лейкоза крупного рогатого скота [11]. Так, в 2002 году Управлением ветеринарии Тюменской области с учетом региональных особенностей была разработана и реализована Областная научно-техническая программа «Неотложные меры профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в племенных хозяйствах, сельхозпредприятиях Тюменской области на 2002-2010 гг.». Сегодня эта работа ведется согласно «Комплексному плану по профилактике и ликвидации лейкоза крупного рогатого скота в Тюменской области до 2019 года».
В связи с этим перед нами была поставлена цель - проанализировать результативность серологических и молекулярно-генетических методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота, установить эпизоотическую ситуацию и эффективность мер, принимаемых для оздоровления от лейкоза в Тюменской области.
Эпизоотическая обстановка по лейкозу крупного рогатого скота в Тюменской области с 1983 по 2015 год изучена на основе данных отчетности, сформированной по результатам лабораторных исследований, предоставленной ветеринарной лабораторией и хозяйствующими субъектами. Методами постановки диагноза явились гематологический, РИД и ИФА.
Также в работе использованы методы эпизоотологического анализа качественных и количественных показателей эпизоотического процесса при лейкозе. Для объективной оценки результатов эпизоотологического мониторинга необходимо учесть ряд обобщающих показателей, одним из которых является коэффициент напряженности эпизоотического процесса (Кнэп), введенный в практику М. И. Гулюкиным и др. [12, 13].
Коэффициент напряженности эпизоотического процесса вычисляли по формуле
К^ИМ З х П):100,
в
естник АПК
Ставрополья
: № 2(26), 2017
Ветеринария
где
Этап
Предварительная денатурация ДНК
Синтез ПЦР-продуктов (40 циклов):
плавление
отжиг праймеров
синтез ДНК
окончательная достройка цепей
Температура, °С
95
Время, минут
95 60 72
72
0,5 0,5 1
5
65
Ко - коэффициент очаговости (гол.);
З - заболеваемость (%);
П - превалентность (%).
Материалом для молекулярно-генетического исследования послужила цельная кровь виру-соносителей животных черно-пестрой породы разных возрастных групп. Сбор материала осуществлялся в 2016 году на племенных предприятиях и ЛПХ Тюменской области. ДНК-анализ выполнялся в «Лаборатории ДНК-технологий» Агробиотехнологического центра ГАУ Северного Зауралья.
Выделение тотальной ДНК проводилось фе-нольным и солевым методами с лизированием протеиназой К. Для ПЦР-анализа использовали тест-системы «Лейкоз» (ООО «Интерлабсер-вис», г. Москва). Амплицикацию проводили по следующей схеме:
Учет результатов проводили по наличию специфического фрагмента размером 294 п.н. провирусной ДНК лейкоза крупного рогатого скота в соответствии с контролями.
Визуализация ПЦР-продукта осуществлялась методом горизонтального электрофореза в 2 % растворе агарозы с добавлением бромистого этидия на оборудовании «Bio-Rad» (Англия). Детекция результатов проводилась системой гель-документирования (Berthold-Technologies, Германия).
Для сравнения эффективности диагностических приемов при лейкозе крупного рогатого скота нами были применены молекулярно-генетические методы исследования проб крови серопозитивных животных. Результаты исследований представлены в таблице 1.
На основании полученных данных можно отметить, что из 96 проб крови серопозитивных животных подтверждены ПЦР-диагностикой лишь 73,96 %. Такие отличия в результатах можно объяснить генетической вариабельностью вируса, а также низким уровнем вирусной нагрузки. Таким образом, для выявления носи-тельства и больных лейкозом животных необходимо применение комплексных методов диагностики заболевания.
Учитывая сложную эпизоотическую ситуацию по лейкозу крупного рогатого скота как на всей территории страны, так и в Тюменской области, руководством региона с представления ветеринарной службы были разработаны мероприятия, направленные на снижение и ликвидацию заболеваемости лейкозом в Тюменской области.
Результаты реализации «Областной научно-технической программы «Неотложные меры профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в племенных хозяйствах, сельхозпредприятиях Тюменской области на 2002-2010 гг.» и «Комплексного плана по профилактике и ликвидации лейкоза крупного рогатого скота в Тюменской области до 2019 года» отражены в ретроспективном анализе результатов лабораторных исследований на лейкоз крупного рогатого скота в Тюменской области за 1983-2015 гг. и представлены на рисунке.
Анализ данных вирусологических исследований крупного рогатого скота свидетельствует, что эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Тюменской области имеет четкую тенденцию к снижению. Так, количество животных-вирусоносителей за период наблюдений уменьшился с 37,5 до 3,6 %, то есть на 90,4 %. Гематологические исследования также показали значительную тенденцию к снижению. Так, с момента изучения эпизоотического процесса лейкоза в регионе показатель гематологически больных животных составлял 0,3 %, затем показатель увеличивался и в 1995 году отмечали самый высокий уровень больных животных - 3,5 %, затем наблюдалось планомерное снижение числа больных животных, и в 2015 году этот показатель снизился до 1,6 %, то есть на 54,3 %.
Показатели интенсивности эпизоотического процесса при лейкозе крупного рогатого скота на территории Тюменской области во временной динамике представлены в таблице 2.
Таблица 1 - Результаты исследований животных на наличие провируса лейкоза крупного рогатого скота
Тюменской области в 2016 году
5
Результаты исследований
№ п/п Всего исследовано проб ПЦР-положительные РИД-положительные
количество % количество %
1 44 41 93,2 44 100
2 50 28 56 50 100
3 2 2 100 2 100
Итого 96 71 73,96 96 100
66
,,„ „„„„, щ ^ Ставрооодья
40 35 30 25 20 15 10 5 0
- % больных животных
о % инфицированных животных
Рисунок - Динамика показателей РИД+ и гематологически больных животных за период
с 1983 по 2015 г. в Тюменской области
Таблица 2 - Показатели интенсивности эпизоотического процесса при лейкозе крупного рогатого скота
в Тюменской области
Год исследования Инфицированность, % Превалент-ность, % Заболеваемость, % Очаговость, гол. Коэффициент НЭП*
1989 37,52 6,98 0,38 132,06 3,52
1990 34,68 18,15 0,56 482,41 49,03
1991 30,07 17,52 0,51 463,62 41,42
1992 28,49 12,77 0,37 266,07 12,57
1993 25,32 10,83 0,58 163,46 10,27
1994 28,50 11,65 1,64 190,42 36,38
1995 26,39 11,43 2,33 185,25 49,34
1996 29,60 14,42 1,80 256,28 66,52
1997 24,00 11,11 1,97 189,06 41,38
1998 17,93 7,75 1,63 105,83 13,37
1999 18,89 9,31 1,63 143,64 21,80
2000 32,62 17,25 1,12 522,81 101,00
2001 32,92 12,96 0,93 193,52 23,32
2002 33,06 14,53 1,20 229,29 39,98
2003 24,89 12,63 0,97 213,29 23,13
2004 17,68 8,92 0,80 147,02 10,49
2005 14,50 8,20 0,65 150,23 8,01
2006 9,73 6,01 0,54 125,24 4,06
2007 10,42 7,32 0,47 186,92 6,43
2008 4,72 3,72 0,43 111,34 1,78
2009 8,71 6,30 0,42 207,19 5,48
2010 5,18 3,74 0,39 119,59 1,74
2011 4,64 3,38 0,35 108,77 1,29
2012 4,44 3,27 0,39 104,36 1,33
2013 4,37 3,49 0,46 124,53 2,00
2014 3,76 3,14 0,46 136,83 1,98
2015 3,60 3,06 0,42 141,14 1,81
* НЭП - напряженность эпизоотического процесса.
Мониторинг эффективности противоэпи-зоотических мероприятий и ретроспективный анализ результатов лабораторных исследований показал, что на территории Тюменской области в период с 1989 (с момента введения серологической диагностики лейкоза) по 2015 год произошло существенное снижение уровня ин-фицированности вирусом лейкоза крупного ро-
гатого скота среди восприимчивого поголовья. Тенденцию к снижению имел также показатель заболеваемости, который в начале исследования составил 0,38 %, а максимальные показатели заболеваемости зафиксированы в период с 1994 по 2003 год, когда его регистрировали на уровне 0,93-2,33 %. С 2008 года этот показатель не поднимается выше 0,46 %. Показатель пре-
в
естник АПК
Ставрополья
;№ 2(26), 2017
Ветеринария
B7
валентности, который также позволяет оценить эпизоотический процесс, в течение периода наблюдения также имел стабильную тенденцию к снижению. Так, максимальный уровень прева-лентности отмечен в 1990, 1991 и 2000 годах -18,15; 17,52 и 17,25 % соответственно. С 2003 года превалентность по лейкозу крупного рогатого скота имеет четкую тенденцию к снижению, которая по итогам 2015 года составляет 3,06 %. Коэффициент напряженности эпизоотического процесса (НЭП), напрямую зависящий от предыдущих показателей, четко отражает эффективность предпринятых ветеринарными службами мер. Максимальный показатель НЭП фиксировали в 2000 году (101,0), также высокая напряженность эпизоотического процесса наблюдалась в 1990 (49,03), 1995 (49,34) и 1996 (66,52) годах. Начиная с 2005 года напряженность эпизоотического процесса фиксируется ниже 10, а в 2015 году она составила 1,81.
Представленные показатели позволяют сделать вывод, что предпринятые меры обладают высокой эффективностью в отношении лейкоза крупного рогатого скота.
Реализация в Тюменской области «Областной научно-технической программы «Неотложные меры профилактики и борьбы с лей-
козом крупного рогатого скота в племенных хозяйствах, сельхозпредприятиях Тюменской области на 2002-2010 гг.» и «Комплексного плана по профилактике и ликвидации лейкоза крупного рогатого скота в Тюменской области до 2019 года» позволила изменить развивающийся эпизоотический процесс в регионе. Эффективность реализованных программ во многом зависит от применения современных молекулярно-генетических методов диагностики для обнаружения вируса лейкоза и тем самым проведения ранней диагностики виру-соносительства у молодняка крупного рогатого скота. Так, при исследовании проб крови от серопозитивных животных методом ПЦР было идентифицировано лишь 73,96 %. Высокая чувствительность метода позволяет наиболее точно определять инфицированных животных и рационально, с меньшими экономическими потерями проводить оздоровительные мероприятия, снижая уровень заболеваемости и напряженность эпизоотической ситуации. Благодаря проделанной комплексной работе предотвращен экономический ущерб, складывающийся из преждевременной выбраковки высокопродуктивных животных и затрат на выращивание ремонтного молодняка.
Литература
1. Донник И. М., Татарчук А. Т., Краснопе-ров В. А. Уральская система оздоровительных противолейкозных мероприятий. Екатеринбург, 1996.
2. Мелкина П. С., Агольцов В. А., Дружаева Н. А. Эпизоотологическая обстановка по лейкозу крупного рогатого скота и эффективность противолейкозных мероприятий в Саратовской области // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н. Э. Баумана. 2012. Т. 209. С. 216-220.
3. Спиряхин А. О лейкозе крупного рогатого скота // Наука & практика Технологии& инновации. URL: httpV/биомедиа.рф/ nauka-i-praktika/tehnologii-i-innovacii/712-esche-raz-o-leykoze-krupnogo-rogatogo-skota.html (дата обращения: 06.03.2017).
4. Трансформация клеток под действием вируса лейкоза крупного рогатого скота - реальный риск развития онкологических болезней человека / Н. З. Хазипов, Р. Р. Вафин, А. Ю. Шаева, Л. И. Зайнул-лин // Современные проблемы науки и образования. 2013. № 6. URL: www.science-education.ru/113-11792 (дата обращения: 06.03.2017).
5. Bovine Leukemia Virus Gene Segment Detected in Human Breast Tissue / G. Mesa, J. C. Ulloa, A. M. Uribe, M. F. Gutierrez // Open Journal of Medical Microbiology. 2013. Vol. 3. Р. 84-90.
6. Глазунов Ю. В., Глазунова Л. А. Лейкоз крупного рогатого скота в Тюменской об-
References
1. Donnik I. M., Tatarchuk A. T., Krasnoperov V. A. The Ural system of improving anti-bovine leukosis measures. Ekaterinburg, 1996.
2. Melkina P. S., Agoltsov V. A., Druzhayeva N. A. Epizootological situation in bovine leukosis and the effectiveness of anti- bovine leukosis in Saratov region // Scientific works of Kazan Veterinary Medicine Academy named after N. E. Bauman. 2012. Vol. 209. P. 216-220.
3. Spiryakhin A. About bovine leukosis // Science and Practice technology and innovation. Available at: http://6MOMeflwa.p^/nauka-i-praktika/tehnologii-i-innovacii/712-esche-raz-o-leykoze-krupnogo-rogatogo-skota. html (date of access: 06.03.2017).
4. Transformation of cells under the influence of the virus of bovine leukosis - a real risk of development of human oncological diseases / N. Z. Khazipov, R. R. Vafin, A. Yu. Shayeva, L. I. Zainullin // Modern problems of science and education. 2013. № 6. Available at: www.science-education.ru/113-11792 (date of access: 06.03.2017).
5. Bovine Leukemia Virus Gene Segment Detected in Human Breast Tissue / G. Mesa, J. C. Ulloa, A. M. Uribe, M. F. Gutierrez // Open Journal of Medical Microbiology. 2013. Vol. 3. P. 84-90.
6. Glazunov Yu. V., Glazunova L. A. Bovine leukosis in Tyumen region // Modern problems of science and education. 2015. № 3. P. 611.
7. Glazunov Yu. V., Glazunova L. A. A retrospective analysis of the epizootic
68
,,„ „„„„, Jj Ставрополья
ласти // Современные проблемы науки и образования. 2015. № 3. С. 611.
7. Глазунов Ю. В., Глазунова Л. А. Ретроспективный анализ эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в Северном Зауралье // Ветеринария и кормление. 2014. № 3. С. 14-15.
8. Бойко Е. Г. Перспективы использования геномного анализа при разведении и селекции крупного рогатого скота // Аграрный вестник Урала. 2009. № 10 (64). С. 33-34.
9. Кабицкая Я. А. К вопросу диагностики лейкоза крупного рогатого скота на предприятиях Тюменской области // Перспективы развития современных сельскохозяйственных наук : сб. науч. тр. по итогам междунар. науч.-практ. конф. Воронеж, 2016. С. 14-17.
10. Возможности и ограничения использования полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике вируса лейкоза крупного рогатого скота / С. В. Чичинина, В. В. Храм-цов, П. Н. Смирнов [и др.] // Вестник Российской сельскохозяйственной науки. 2006. № 6. С. 71-73.
11. Опыт борьбы с лейкозом КРС в Уральском регионе / И. М. Донник, А. Т. Татарчук, Б. М. Коритняк, С. С. Миронов // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. 2009. № 1 (8). С. 57-60.
12. Разработка эффективных мероприятий против лейкоза крупного рогатого скота / М. И. Гулюкин, Л. А. Иванова, Н. В. Зама-раева [и др.] // Ветеринария. 2002. № 12. С. 3-8.
13. Лейкоз крупного рогатого скота - болезнь управляемая / М. И. Гулюкин [и др.] // Ветеринария. 2013. № 9. С. 9-14.
situation of bovine leukosis in the Northern Trans-Urals // Veterinary Medicine and Feeding. 2014. № 3. P. 14-15.
8. Boyko Ye. G. Perspectives of the use of genomic analysis in breeding and breeding of cattle // Agrarian Herald of the Urals. 2009. № 10 (64). P. 33-34.
9. Kabitskaya Ya. A. On the diagnosis of bovine leukosis at the enterprises of Tyumen region // Prospects for the development of modern agricultural sciences : a collection of scientific papers on the results of an international scientific-practical conference. Voronezh, 2016. P. 14-17.
10. Opportunities and limitations of the use of polymerase chain reaction (PCR) in the diagnosis of bovine leukosis virus / S. V. Chichinina, V. V. Khramtsov, P. N. Smirnov [et al.] // Bulletin of Russian Agricultural Science. 2006. № 6. P. 71-73.
11. Experience in control of bovine leukosis in the Urals region // I. M. Donnik, A. T. Tatarchuk, B. M. Koritnyak, S. S. Mironov // Bulletin of Ulyanovsk State Agricultural Academy. 2009. № 1 (8). P. 57-60.
12. Development of effective measures against bovine leukosis / M. I. Gulyukin, L. A. Ivanova, N. V. Zamaraeva [et al.] // Veterinary Medicine. 2002. № 12. P. 3-8.
13. Bovine leukosis - controlled disease / M. Gulyukin [et al.] // Veterinary Medicine. 2013. № 9. P. 9-14.
