CC BY
63University Press. - 2001. - P. 319-348.
9. Лободин, К.А. Репродуктивное здоровье высокопродуктивных молочных коров красно - степной породы и биотехнологические методы его коррекции. / К.А. Лободин // Автореф. дис. док. вет. наук Санкт - Петербург. -2011. - 45 с.
10. Edens, E.W. Potential for organic selenium to replace selenite in poultry diets / E.W. Edens // Zootech. Intern. 1997.
- Vol. 20. - P. 28-31.
11. Surai, P.F. Is organic selenium better for animals than inorganic sources? / P.F. Surai, J.E. Dvorska // Feed Mix. - 2001.
- Vol. 9. - P. 8-10.
12. Kohrle, J. Selenium Biology: facts and medical perspectives / J. Kohrle, R. Brigelius-Flohe, A. Block, R. Gartner et al. // Biol. Chem. - 2000. - Vol. 381. - P. 849-864.
13. Johannigman, J.A. Prone positioning and inhaled nitric oxide: synergistic therapies for acute respiratory distress syndrome / J.A. Johannigman, K.Jr. Davis, S.L. Miller et al. // J. Trauma. - 2001. - Vol. 50(4).- P. 589-596
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Вангели Сергей Валерьевич
кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник лаборатории биофизики ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко
METHODS OF DIAGNOSIS BOVINE LEUKEMIA
Vangeli S.V. Senior researcher of All-Russian Institute of Experimental Veterinary Science Ja. R. Kovalenko.
АННОТАЦИЯ
Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, которая протекает бессимптомно или проявляется лимфоцитозом и злокачественными новообразованиями в кроветворных и других органах и тканях. Болезнь широко распространено во многих странах мира. Методы прижизненной диагностики лейкоза крупного рогатого скота имеют решающее значение как для выяснения степени его распространенности, так и для проведения противолейкозных мероприятий. Поэтому анализ применяемых методов лабораторной диагностики, играет важное значение для постановки точного и своевременного диагноза, больных лейкозом крупного рогатого скота животных.
ABSTRACT
The cattle leukemia is a chronic infectious disease of tumor nature, which is asymptomatic or manifested by lymphocytosis and malignant tumors in hematopoietic and other organs and tissues. The disease is widely distributed in many countries of the world. Methods of intravital diagnostics of bovine leucosis is crucial as to clarify the extent of its prevalence, and to conduct anti-leukemic activities.Therefore, the analysis methods of laboratory diagnosis, is important for the production of accurate and timely diagnosis, patients with leukemia cattle.
Ключевые слова: вирус лейкоза крупного рогатого скота, смешанные инфекции, серологические методы диагностика ВЛ КРС, пути передачи ВЛ КРС, ПЦР.
Key words: BLV, mixed infections, serological methods for diagnosis of BLV, transmission of BLV, transmission of BLV, ELISA, PCR.
Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, которая протекает бессимптомно или проявляется лимфоцитозом и злокачественными образованиями в кроветворных и других органах и тканях. Болезнь широко распространено во многих странах мира. Наиболее часто встречается в США, в странах Центральной Европы, Дании, Швеции, странах Ближнего Востока, Африке и Австралии. В нашей стране с 1997 г. Лейкоз КРС прочно занимает первое место в структуре инфекционной патологии. По официальным данным в РФ зарегистрировано 2113 неблагополучных пунктов. Уровень инфицированности составляет от 5 до 40%, а уровень больных лейкозом животных 2-5% [3].
Лейкоз крупного рогатого скота является социально и экономически значимой проблемой, наносящей экономический ущерб животноводству, который выражаетсяне только финансовыми потерями в случаях заболевания, падежа, вынужденного убоя животных и введения ограничений в реализации племенного молодняка, молока, мо-
лочных продуктов, но и другими прямыми и косвенными потерями, связанными с ежегодными затратами на приобретение оборудования и реактивов для проведения гематологических и серологических исследований [3,9].
Эпизоотический процесс лейкоза является сложным непрерывным процессом передачи ВЛКРС от зараженных к восприимчивым здоровым животным. Имеются два пути передачи вируса: вертикальный (внутриутробный) и горизонтальный (контактный). Горизонтальный путь не исключает передачу вируса через быков-производителей, как возможных источников передачи лейкозной инфекции при вольной случке коров и телок. ВЛКРС может передаваться трансплацентарно с инфицированными лимфоцитами матери, благодаря способности лимфоцитов мигрировать в межклеточном пространстве и таким образом преодолевать плацентарный барьер. По некоторым данным, до 20 % телят, зараженных вирусом ВЛКРС от матерей, могут рождаться инфицированными. Вирус лейкоза присутствует в молозиве и молоке инфицированных
коров. Выпаивание такого молока или молозива телятам и овцам индуцирует у них инфекцию [5,11,12].
Распространению инфекции способствует несвоевременная диагностика болезни, несоблюдение ветеринарных требований при закупках скота для племенных и производственных целей, совместное содержание здоровых животных и животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота. ВЛКРС передается только с лимфоцитом, вне которого он не может существовать. Передачи таких лимфоцитов несущих в себе в вирусмо-жет проходить несколькими путями: при осуществлении ветеринарно-зоотехнические мероприятия с животными, выполняемые с нарушением правил асептики, в частности - искусственное осеменение коров и телок, отбор проб крови для диагностических исследований, массовые вакцинации, ректальное исследование, хирургические обработки копыт, использование общих родильных отделений для инфицированных инеинфицированных ВЛКРС, через доильные аппараты, особенно в случаях доения коров со скрытыми и, тем более, клиническими маститами, использование быков-производителей инфицированных вирусом лейкоза [9].
Для эффективной борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в странах ЕС всех животных старше 2-х лет тестируют серологическими методами и всех серопозитивных выбраковывают. Следующее исследование проводят не ранее 3-х месяцев после последнего выбракованного животного. Благополучным по лейкозу считается только то хозяйство, в котором ни один клинический или серологический случай не был отмечен в течение 2-х лет, животные в возрасте 24 месяцев исследуются с интервалом в 4-12 месяцев на подтверждение благополучия. После выявления больных животных, применяется метод поголовной выбраковки всех животных не-благополучных ферм с приобретением здорового молодняка за счет средств, компенсируемых государством.
Такой метод был неприемлем для наших крупных животноводческих хозяйств, тем более, при крайней ограниченности наличия безлейкозного молодняка. Исходя из этого, сотрудниками ВИЭВ был разрабо-тан метод по принципу изолированного выращивания не-телей из числа потомства от больных и инфицированных коров для поэтапной их замены, т.е. полного искоренения лейкоза и создания нового безлейкозного поголовья скота.
Выращивание здоровых телок в неблаго-получных по лейкозу хозяйствах имеет решающее значение. Вместе с тем, потомство от больных и инфицированных коров может являться первичным источником появления и распространения лейкозной инфекции.
Методы прижизненной диагностики лейкоза крупного рогатого скота имеют решающее значение как для выяснения степени его распространенности, так и для проведения противолейкозных мероприятий.
Поэтому целью работы был анализ применяемых методов лабораторной диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
Лейкоз крупного рогатого скота характеризуется некоторыми особенностями. Возбудитель персистирует в организме пожизненно в виде провируса, интегрированного
в геном лимфоцитов хозяина, при этом свободные зрелые вирионы или их антигены, как правило, отсутствуют. Постоянным признаком инфекции служит продукция специфических антител. Поэтому для диагностики широко применяют непрямые серологические методы исследования, такие как реакцию диффузионной преципитации (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА). РИД позволяет обнаружить в сыворотке крови антитела к вирусу лейкоза в самом начале заражения (инфицирования) животных ВЛ-КРС. Серологическому исследованию на лейкоз подвергают животных в возрасте 6 месяцев и старше. Пробы крови для исследований берут не ранее чем через 30 суток после введения животным вакцин и сывороток, а у стельных животных - за 30 дней до отела или через 30 дней после него. Эта реакция является основной при проведении мероприятий по профилактике лейкоза.
Исследование в РИД позволяет выявить зараженных животных уже в первой стадия развития болезни - пред-лейкозной или инкубационной. В этот период животное чувствует себя нормально, на вид здоровое, коровы дают молоко, приносят потомство. В этот период нет гематологических изменений крови. При постановке реакции РИД ошибки быть не может, реакция строго специфическая. Однако, при высокой специфичности, реакция обладает довольно низкой чувствительностью и иногда может давать перекрёстную реакцию при смешанных инфекциях [1,4]. Не всегда удается выявить всех зараженных животных, невозможно исследовать молодняк до 6-месячного возраста. Нельзя исследовать кровь от новотельных и глубокостельных коров по реакции РИД, у таких животных реакция будет неспецифической. При проведении плановых исследований крупного рогатого скота на лейкоз ветеринарные врачи должны учитывать физиологическое состояние поголовья.
РИД - положительные животные (вирусоносители) опасны для других животных,они являются источниками возбудителя болезни и заражают здоровых животных. Для оздоровления стад от лейкоза целесообразно совместно с РИД и ИФА использовать методы, выявляющие непосредственно вирус или провирус у инфицированных животных. Высокая чувствительность ИФА в отличие от РИД позволяет быстро и массово исследовать сыворотки крови [2,6].
Поэтому, именно ИФА широко используют в Национальных программах по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота во многих странах Западной Европы и Америки, многие из которых уже успешно завершены. В настоящее время согласно стандартам МЭБ узаконенными методами диагностики лейкоза крупного рогатого скота являются РИД и ИФА.
Метод не прямого иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на применении антивидового конъюгата с использованием ферментов-маркеров, обладает значительно большей чувствительностью, по сравнению с РИД, позволяет автоматизировать процесс, то есть уйти от субъективной оценки результатов реакции [6,10]. Кроме того, с помощью ИФА можно обнаружить антитела к ВЛКРС в молоке и моче [5,10].
Однако ИФА и РИД не способны дифференцировать
материнские антитела у молодых животных от активных антител, продуцирующихся при вирусной инфекции.
В последние годы ряд исследователей для диагностики лейкоза крупного рогатого скота предлагают полимераз-ную цепную реакцию (ПЦР). Молекулярно-генетический метод позволяет выявить практически всех инфицированных ВЛ КРС животных. Этот метод позволяет определить непосредственно вирус или провирусу инфицированных животных. [5,7,8,11].
Несмотря на надежность данных методов, ни один из существующих методов не лишен недостатков. Так, довольно часто устанавливали несоответствие результатов ПЦР и РИД. ПЦР-позитивных животных выявляли среди РИД-отрицательных животных, а ПЦР-негативных - среди РИД-положительных. Несмотря на очень высокую чувствительность ПЦР, бывают такие периоды, когда уровень провирусной ДНК минимален. В таких случаях РИД оказывается более информативной. Поэтому методом ПЦР имеет смысл контролировать РИД и ИФА-негативных особей. С помощью ПЦР выявляют непосредственно про-вирус, то есть результат анализа не зависит от возраста и состояния животного, поэтому ПЦР можно использовать для разделения телят на инфицированных и здоровых в возрасте от 15 дней до 5 месяцев (в этом возрасте применять РИД не имеет смысла).
Система РИД+ИФА+ПЦР при лейкозе КРС, позволяет одномоментно выявлять максимальное количество инфицированных животных на самых ранних стадиях заболевания. Это существенно сокращает сроки оздоровительных противолейкозных мероприятий. Кроме того, ПЦР применима для обследования молодняка, начиная с 15-дневного возраста.
Являясь самым чувствительным на сегодняшний день методом обнаружения инфекционных агентов, ПЦР не требует иммунологического ответа на проникновение возбудителя в организм хозяина, что дает возможность следить за ранними стадиями развития инфекции. ПЦР позволят выявить фрагменты провирусной ДНК, встроенные в геном инфицированного животного, или вирусную РНК, тем самым представляя собой прямой метод диагно-стики,в отличие от непрямых РИД и ИФА.
Выводы: применение ПЦР на ряду с серологическими методами диагностики лейкоза крупного рогатого скота (РИД и ИФА), в комплексе с противолейкозными мероприятиями, обеспечивает более раннее и полное выявление зараженных животных и сокращает сроки оздоровления стада.
ПЦР позволят выявить фрагменты провирусной ДНК, встроенные в геном инфицированного животного или вирусную РНК, тем самым представляя собой прямой метод диагностики в отличие от непрямых РИД и ИФА.
Дальнейшее выявление зараженных животных старше 6-месячного возраста проводить методом РИД и ИФА, а вновь поступающий молодняк, начиная с 15-дневного возраста - ПЦР. Все зараженные животные немедленно удаляются.
Критерием благополучия оздоровливаемого стада (в хозяйстве, на отделении, ферме, дворе) является получение двух подряд с интервалом в 3 месяца отрицательных
результатов в РИД всего поголовья старше 6-месячного возраста.
Литература
1. Вангели С.В. Сравнительная морфологическая характеристика клеточных линий ЛЭК-ВИЭВ-90 и FLK-BLV, хронически инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота // Ветеринария и кормление. - 2015.- № 1. -С. 19-22.
2. Верховский О.А. Лабораторная диагностика инфекционных болезней крупного рогатого скота с использованием иммуноферментного анализа (лейкоз, ящур, бруцеллез) // Ветеринария Кубани.- 2007. - № 2.
3. Гулюкин М.И. Аналитический обзор эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в Российской Федерации (1996-2010) / М.И. Гулюкин, Г.А. Симонян, И.И. Барабанов [и др.] // Рос. акад. с.-х. наук, Всерос. научно-исслед. инст-т эксперим. ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ). - Москва: [б.и.]. - 2011. - 46 с.: табл. на рус. яз. - Российская Федерация.
4. Надточей Г.А., Вангели С.В. Смешанные инфекции РНК-содержащих вирусов, в перевиваемых культурах клеток ЛЭК-ВИЭВ-90 и FLK-BLV Материалы международной научно-проктической конференции.// Научные перспективы XXI века.г.Екатеринбург - 2015. № 4 (11) С. 163-167.
5. Джапаралиев Н.Т., Прохватилова Л.Б., Ломакин А.И., Аянот П.К. Применение серологических методов и ПЦР для обнаружения вируса лейкоза крупного рогатого скота в образцах крови, молока и носовых истечений / Н.Т. Джапаралиев, Л.Б. Прохватилова, А.И. Ломакин, П.К. Ая-нот // Достижения молодых ученых в ветеринарную практику (Материалы конференции молодых ученых). Владимир: ОКНИИиМС, ВНИИЗЖ. - 2000. С.127-131.
6. Иванова Л. А. Опыт применения иммунофер-ментного анализа для выявления антител к вирусу лейкоза на заключительном этапе оздоровления // Бюл. ВИЭВ. -1999. - т. 72. С. 202-209
7. Козырева Н.Г. Совершенствование диагностики ВЛКРС инфекции у телят / Н.Г. Козырева, Л.А. Иванова, М.И. Гулюкин // Ветеринария и Кормление. - 2013. - № 1. -С. 16-17.
8. Прохватилова Л.Б. Разработка метода выявления вируса лейкоза КРС с помощью полимеразной цепной реакции // Л.Б. Прохватилова, С.Н. Колосов, А.И. Ломакин // Акт. пробл. биотехнол. в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Мат. науч. конф.- М., 1996а. - С. 66-67.
9. Смирнов Ю.П. Эффективность различных методов оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза / Вестн. РАСХН, 1999. - № 2. - С. 69-71.
10. Carli K.T., Sen A., Batmaz H., Kennerman E. Detection of IgG antibody to bo-vine leukemia virus in urine and serum by two enzyme immunoassays // Lett. Appl. Microbiol.- 1999.-Vol.28, N.6.- P.416-418.
11. Somura Y. Comparison of the copy numbers of bovine leukemia virus in the lymph nodes of cattle with enzootic bovine leukosis and cattle with latent infection // Y. Somura, E. Sugiyama, H. Fujikawa, K. Murakami // Arch. Virol. - 2014. -№159(10). - Р. 2693-2697.
12. Florent G. Detection of antibodies to bovine leukemia virus in bovine milk samples with an ELISA involving two monoclonal antibodies // G. Florent, J.C. Delgoffe, N. Zygraich // Vet. Microbiol. - 1988. - V. 18, № 1.- P. 89-93.
