CC BY
12
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИММУНОФЕНОТИПА ОПУХОЛЕВЫХ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМОЙ
Чуксина Ю.Ю.1, Белоусов К.А.2, Яздовский В.В.3, Голенков А.К.4 ©
1Старший научный сотрудник, к.м.н., лаборатория клинической иммунологии и тканевого типирования; Младший научный сотрудник отделения клинической гематологии и иммунотерапии; 3Заведующий лабораторией клинической иммунологии и тканевого типирования, д.м.н., профессор; ^Руководитель отделения клинической гематологии и
иммунотерапии, д.м.н., профессор.
ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, Москва, Российская Федерация
Аннотация
В статье представлены результаты сравнительного анализа
иммунофенотипических показателей опухолевых плазматических клеток костного мозга и периферической крови у больных множественной миеломой в сопоставлении с клиническими особенностями течения заболевания.
Ключевые слова: множественная миелома, плазматические клетки, проточная цитометрия, иммунофенотипирование.
Keywords: Мultiple myeloma, plasma cells, Flow cytometry, Immunophenotyping.
Введение. Множественная миелома (ММ) - это злокачественная опухоль, морфологическим субстратом которой являются плазматические клетки, продуцирующие моноклональный иммуноглобулин. ММ составляет 13% среди гемопоэтических опухолей [3, 63].
Адгезия плазматических клеток (ПК) ММ к внеклеточному матриксу костного мозга с помощью адгезивных молекул (СБ11с, CD56, CD138, CD33) локализует опухолевые клетки в костномозговом окружении.
Синдекан-1 (CD138) регулирует рост и выживаемость опухолевых клеток, адгезия миеломных клеток через синдекан-1 к коллагену активирует матриксную металлопротеиназу-1, способствуя резорбции костей и инвазии опухоли [1, 238].
Развитие технологии проточной цитометрии привело к значительному совершенствованию иммунофенотипических исследований плазматических клеток при множественной миеломе (ПК ММ), которые позволили открыть существование различающихся функциональных субклонов. Одним из примеров таких субклонов служат циркулирующие опухолевые клетки множественной миеломы (ЦОК ММ). Установлено, что ЦОК присутствуют в подавляющем большинстве случаев у больных ММ (80%), а также примерно в 20% «тлеющих» процессов и моноклональной гаммапатии неопределенного значения [6, 705; 5, 3595].
Как следствие геномной и транскрипционной гетерогенности, различаются и профили иммунофенотипической экспрессии клональных ПК ММ. Уже установлены корреляции различных исходов и различных возможных цитогенетических нарушений с наличием или отсутствием различных антигенов [4, 682].
Иммунофенотипические изменения сопровождают каждую стадию дифференцировки активированных В-лимфоцитов в ПК.
Постепенная утрата экспрессии В-ассоциированных антигенов CD19 и CD20 свидетельствует о снижении способности реагировать на антигенную стимуляцию.
© Чуксина Ю.Ю., Белоусов К.А., Яздовский В.В., Голенков А.К., 2016 г.
Снижение яркости экспрессии CD45, усиление экспрессии CD38 и CD138 отражают степень созревания ПК.
Изучение иммунофенотипического профиля субклона ЦОК ММ в сравнении с клональными плазматическими клетками костного мозга (ПК КМ) позволит прогнозировать особенности течения заболевания, найти новые патогенетические подходы к индивидуализации терапии пациентов.
Цель исследования: Изучение иммунофенотипического профиля опухолевых плазматических клеток костного мозга и ЦОК MM в сопоставлении с клиническими особенностями заболевания у больных ММ.
Материалы и методы: Параллельное иммунофенотипическое исследование проб костного мозга и ПК проведено 19 пациентам ММ методом 4-цветной лазерной проточной цитометрии (2-х лазерный проточный цитофлюориметр FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения «CellQwest».
14 пациентов имели впервые диагностированную ММ, 5 пациентов были выявлены ранее и оказались резистентны к предшествующим режимам терапии. Возраст пациентов варьировал от 30 до 80 лет. 100% пациентов имели III стадию заболевания.
У 4-х (21%) пациентов выявлена плазмоцитома грудной стенки (3 пациента) и угла нижней челюсти (1 пациент);
Протеинурия Бенс-Джонса выявлена у 11 (58%) больных;
Деструкция костной системы, переломы - у 6 (32%) пациентов;
Миеломная нефропатия - у 3 больных (16%).
Выделение опухолевых ПК проводилось из гейта CD38++/SSC и CD38++/CD138+, в анализ включалось не менее 500.000 событий [2, 68].
Определялась экспрессия CD56, CD19, CD20, CD79b, CD81, CD11^ CD33, CD27, CD117. Критерием позитивности считали наличие экспрессии антигена на поверхности более чем 20% опухолевых клеток.
Оценка интенсивности экспрессии антигенов проводилась по параметру средней интенсивности флюоресценции - Mean Fluorescence Intensity (MFI), выраженной в условных единицах (у. е.).
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием статистической программы Statistica v. 8.0. c расчетом средней и квадратичной ошибки средней (М+-м). Достоверность различий оценивалась с помощью t-критерия Стъюдента.
Результаты: Данные по выявляемости позитивных антигенов в гейте опухолевых плазмоцитов у пациентов с первичной ММ представлены в таблице 1.
Таблица 1
Частота выявления позитивных антигенов в гейте опухолевых плазмоцитов у пациентов с первичной ММ (% наблюдений)
Показатель Костный мозг Периферическая кровь Достоверность различий (Р)
CD19+ 3 /14 (21,4%) 4 / 13 (30,8%)
CD20+ 3 / 14 (21,4%) 2/ 13 (15,4%)
CD79b + 7 / 14 (50%) 8 / 13 (61,5%)
CD81+ 11 /14 (78,6%) 12 / 13 (92,3%)
CD1^+ 8/ 14 (57,1%) 12 / 13 (92,3%) < 0, 005
CD27+ 13/14 (92,9%) 11/ 13 (84,6%)
CD33+ 3 / 14 (21,4%) 4 / 13 (30,8%)
CD56+ 14/ 14 (100%) 13 / 13 (100%)
При впервые диагностированной множественной миеломе в большинстве наблюдений выявлена яркая позитивная экспрессия таких маркеров, как СБ56, СБ81, СБ27, СБ79Ь как на опухолевых ПК КМ, так и на ЦОК ММ, но статистически значимым
(р=0,0478) оказалось увеличение числа наблюдений с позитивной экспрессией молекул интегрина СБ11с на ЦОК ММ по сравнению с клональными клетками КМ.
Сравнительная оценка количественных показателей опухолевых ПК КМ и периферической крови по экспрессии исследуемых антигенов представлена в таблице 2.
Таблица 2
Иммунофенотипическая характеристика опухолевых плазматических клеток у пациентов с первичной ММ (% позитивных клеток)
Содержание Костный мозг Периферическая Достоверность
позитивных клеток, (%) кровь различий (Р)
CD38+ bright 6,07+-2,5 1,2+-0,5 <0,05
CD38+ / CD138+ 67,8+-8,2 36,4+-8,7 <0,01
CD38+ / CD138- 32,8+-8,1 59,9+-8,7 < 0,05
CD56+ 70,2 +- 6,7 57,4 +- 6,2
CD19+ 35,0+-8,03 46,02+-7,4
CD20+ 33,8 +-12,1 33,2+-7,4
CD79b + 51,8+- 7,7 48,6 +- 7,9
CD81+ 62,5 +- 7,99 72,1 +-5,1
CD1^+ 35,1+- 7,7 55,7+-6,6 < 0,05
CD27+ 63,4 +- 6,2 57,3 +- 7,3
CD33+ 53,8 +- 1,8 26,0 +- 1,4 < 0,001
CD117+ 36,5 4,8 -
По сравнению с клональными ПК КМ, при иммунофенотипировании ЦОК ММ выявлено:
достоверное снижение экспрессии CD38+ bright; достоверное снижение содержания клеток, коэкспрессирующих CD38++/CD138+ и увеличение содержания популяции клеток с фенотипом CD38++CD138-;
статистически значимое увеличение количества клеток, экспрессирующих интегрин CD11c; статистически значимое (p<0,001) снижение числа клеток, экспрессирующих молекулы адгезии CD33.
В таблицах представлены данные по различной степени интенсивности экспрессии CD45 на опухолевых ПК у пациентов с первичной ММ и у пациентов, резистентных к терапии.
Таблица 3
Различия в интенсивности экспрессии CD45 на опухолевых клетках КМ и ЦОК ММ у
первичных пациентов с ММ (% наблюдений)
Показатель Костный мозг Периферическая кровь
CD45 neg/dim 9 / 14 (64,2%) 5 / 13 (38, 5%)
CD45 bright 5 / 14 (35,7%) 7 / 13 (53, 8%)
Таблица 4
Различия в интенсивности экспрессии СБ45 на опухолевых клетках КМ и ЦОК ММ у
резистентных больных ММ (% наблюдений)
Показатель Костный мозг Периферическая кровь
CD45 neg/dim+ 4 / 7 (57%) 2/7 (28,6%)
CD45bright+
3/7 (43%)
5/7 (71,4%
Выявлено преобладание негативной / слабой экспрессии CD45 (neg/dim) на ПК КМ и преобладание позитивной яркой (bright) экспрессии данного маркера на ЦОК в ПК, что характерно как для первичных, так и для резистентных пациентов с ММ.
Не было выявлено достоверных различий в экспрессии других маркеров, связанных с созреванием, таких как CD19, CD20, CD27 и CD79b.
Уровень экспрессии тетраспонина CD81, который ассоциируется с повышением индекса пролиферации при ММ, был одинаково высоким как на ПК КМ, так и на ЦОК ММ.
Позитивная экспрессия рецептора фактора стволовых клеток CD117 на ПК КМотмечалась у 1 пациентки в дебюте заболевания с сопутствующей плазмоцитомой угла нижней челюсти, у которой после проведения 5 курсов велкейда, циклофосфана, преднизолона через 9 месяцев было зафиксировано прогрессирование заболевания в виде локального роста опухоли (увеличения плазмоцитомы), что при иммунофенотипическом исследовании костного мозга выражалось в увеличении числа опухолевых ПК (CD38++/CD138+/CD56+) и появлением CD117-позитивных ПК в периферической крови.
Заключение: Иммунофенотипирование опухолевых ПК КМ до начала терапии позволяет выявить экспрессию антигенов, характеризующих индивидуальные особенности опухолевого клона конкретного пациента. Миеломные ЦОК имеют уникальный иммунофенотипический профиль экспрессии белков: менее «зрелый» фенотип, характеризующийся более низким уровнем экспрессии синдекана-1 (CD138), молекул адгезии CD33, более высоким уровнем экспрессии СD45, повышенным уровнем экспрессии интегринов CD11c. Наличие в циркуляции субклона опухолевых ПК, экспрессирующих молекулы CD11c, CD117 может свидетельствовать о диссеминации патологического процесса.
Можно предположить, что ЦОК представляет фенотипическое подмножество миеломных ПК в КМ с более низким уровнем экспрессии молекул адгезии и, как следствие, менее выраженную зависимость от ниш стромальных клеток КМ, что повышает их способность выходить в периферическую кровь и вызывать поздние (экстрамедуллярные) поражения.
Литература
1. Бессмельцев С.С. Множественная миелома (патогенез, клиника, диагностика, дифференциальный диагноз). Часть 1 // Клиническая онкогематология, 2013. Т. 6, № 3. С. 237257.
2. Б. Паива. Плазматические клетки и их субпопуляции в костном мозге: методологические аспекты исследования. Иммунология гемопоэза, 2014, С. 64-75.
3. Поддубная И.В., Савченко В.Г. Множественная миелома // Современная онкология. 2014. Экстравыпуск. С. 63-72.
4. Bianchi G., Kyle R.A., Larson D.R.,et al. High levels of peripheral blood circulating plasma cells as a specific risk factor for progression of smoldering multiple myeloma. Lukemia, Mar 2013; 27 (3): 680685.
5. Paiva B., Paino T.,Sayagues J.v. et al. Detailed characterization of multiple myeloma circulating tumor cells shows unique phenotypic, cytogenetic, functional, and circadian distribution profile. Blood., Nov. 21, 2013; 122(22): 3591-3598
6. Paiva B., Perez-Andres M., Vidriales M.B. et al. Competition between clonal plasma cells and normal cells for potentially overlapping bone marrow niches is associated with a progressively altered cellular distribution in MGUS vs myeloma. Lukemia, Apr. 2011; 25 (4): 697-706.
