Иммунофенотипическая характеристика опухолевых плазмоцитов костного мозга и периферической крови при множественной миеломе, осложненной плазмоцитомами

Белоусов К.А.; Митина Т.А.; Чуксина Ю.Ю.; Голенков А.К.; Трифонова Е.В.; Катаева Е.В.; Черных Ю.Б.; Высоцкая Л.Л.; Захаров С.Г.; Клинушкина Е.Ф.; Митин А.Н.; Бакиров Б.А.

КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА

УДК 616.71 -018.46-006.448 © Коллектив авторов, 2019

К.А. Белоусов1, Т.А. Митина1, Ю.Ю. Чуксина1, А.К. Голенков1, Е.В. Трифонова1, Е.В. Катаева1, Ю.Б. Черных1, Л.Л. Высоцкая1, С.Г. Захаров1, Е.Ф. Клинушкина1, А.Н. Митин2, Б.А. Бакиров3 ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОПУХОЛЕВЫХ

ПЛАЗМОЦИТОВ КОСТНОГО МОЗГА И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЕ, ОСЛОЖНЕННОЙ ПЛАЗМОЦИТОМАМИ 1ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт

им. М.Ф. Владимирского», г. Москва 2ФГБУГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, г. Москва 3ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет»

Минздрава России, г. Уфа

Цель исследования: изучить иммунофенотипические особенности миеломных плазматических клеток костного мозга (ПлК КМ) и циркулирующих опухолевых клеток периферической крови (ЦОК ММ) при множественной миеломе (ММ), осложненной плазмоцитомами.

Материал и методы. Обследовано 18 пациентов с ММ в возрасте от 41 года до 85 лет (Медиана возраста 58 лет). У всех были 3-я стадия ММ по Durie-Salmon и плазмоцитомы различной локализации. Средний индекс по шкале Карновско-го составил 40%. У 9 пациентов была первичная ММ, 9 человек ранее получали химиотерапию.

Результаты. У всех пациентов выявлена позитивная экспрессия антигенов CD56, CD81, CD27 и CD11с на ПлК КМ и ЦОК ММ. Отмечено увеличение частоты встречаемости позитивной экспрессии CD19, CD79b, низкая встречаемость позитивной экспрессии CD138 на ЦОК ММ. Экспрессия CD20 выявлялась достоверно чаще на ПлК КМ по сравнению с ЦОК ММ у пациентов с плазмоцитомами менее 7 см в диаметре.

Выводы. Полученные результаты свидетельствуют о менее «зрелом» иммунофенотипе ЦОК ММ, ее высокой способности к распространению опухолевого процесса и появлению локального опухолевого роста.

Ключевые слова: множественная миелома, иммунофенотип, плазмоцитома, плазматические клетки, циркулирующие опухолевые клетки периферической крови.

K.A. Belousov, T.A. Mitina, Yu.Yu. Chuksina, A.K. Golenkov, E.V. Trifonova, E.V. Kataeva, Yu.B. Chernykh, L.L. Vysotskaya, S.G. Zakharov, E.F. Klinushkina, A.N. Mitin, B.A. Bakirov IMMUNOPHENOTYPIC CHARACTERISTICS OF TUMOR PLASMOCYTES OF BONE MARROW AND PERIPHERAL BLOOD IN MULTIPLE MYELOMA COMPLICATED BY PLASMOCYTOMAS

Objective: to study the immunophenotypic features of bone marrow myeloma plasma cells (BM PC) and peripheral blood circulating tumor cells (CTC MM) with multiple myeloma (MM) complicated by plasmacytomas.

Materials and methods. 18 patients with MM, aged 41 to 85 years, were examined (Me 58). All had stage 3 disease according to Durie-Salmon and plasmacytomas of different localization. The average Karnowski index was 40%. 9 patients had primary MM, 9 previously received chemotherapy.

Results. All patients showed positive expression of CD56, CD81, CD27 and CD11c antigens on BM PC and CTC MM. An increase in the frequency of occurrence of positive expression of CD19, CD79b, a low occurrence of positive expression of CD138 on the CTC MM was noted. Expression of CD20 was detected significantly more often on BM PC as compared to CTC MM in patients with plasmacytomas less than 7 cm in diameter.

Conclusions. The results indicate a less «mature» immunophenotype of the CTC MM, its high ability to spread the tumor process, and the appearance of local tumor growth.

Key words: multiple myeloma, immunophenotype, plasmacytoma, plasma cells, peripheral blood circulating tumor cells.

Наличие экстрамедуллярных и костных плазмоцитом при множественной миеломе (ММ) создает серьезную клиническую ситуацию, характеризующуюся тяжелым течением заболевания и, как правило, плохим прогнозом в отношении показателей качества жизни и выживаемости пациентов [1]. Внедрение в терапию ММ, осложненной плазмоцитомами, ингибиторов протеасом и иммуномодуляторов зачастую не позволяет достичь у этих пациентов хорошего противоопухолевого ответа, который

наблюдается в лечении неосложненной ММ [2]. Костные плазмоцитомы представляют собой опухолевые массы, поражающие осевой скелет (ребра, позвонки, череп, кости грудины и таза). Костные плазмоцитомы исходят из костного мозга через нарушенный кортикальный слой кости. Экстрамедуллярные плазмоцитомы являются опухолями мягких тканей различной анатомической ориентации. Они удалены от костного мозга. Возникновение экстрамедуллярных плазмоцитом при ММ может быть вы-

звано рядом причин: проведением инвазивных процедур (оперативное лечение, катетеризация), переломом кости, наличием плазмоклеточного лейкоза [2]. Механизмы возникновения как экстрамедуллярных плазмоцитом, так и плаз-моцитом, связанных с костью, при впервые диагностированной и резистентной/рецидивной ММ еще недостаточно изучены. Ряд исследований, посвященных этой проблеме, показали, что экспрессия ядерного белка р53 в плазматических клетках (ПлК), наряду с увеличением их индекса пролиферации М1В-1, присутствует в 75% случаев ММ, осложненной экстрамедуллярными плазмоцитомами [3]. Наличие плазмо-цитом при ММ часто ассоциируется с высокими уровнями лактатдегидрогеназы в сыворотке крови и комплексными цитогенетическими аномалиями [4,5,6], т.е. с прогностическими неблагоприятными факторами. При множественной миеломе важную роль играют адгезивные белки, экспрессированные на опухолевых клетках, такие как CD29 (бета1-интегрин), CD49d (альфа-4-интегрин, субъединица VLA-4), молекула межклеточной адгезии-1 СБ54 (1САМ-1), CD138 (синдекан-1) и CD184 (СХС-хемокиновый рецептор-4 (CXCR4). Они участвуют в формировании адгезивной лекарственной устойчивости (САМ-DR) и процессах миграции опухолевых плазмоцитов [6]. Важно отметить, что способность бортезомиба избирательно ингибировать CD49d позволила впервые преодолеть адгезивную лекарственную устойчивость при ММ, ранее рефрактерной к вин-кристину, дексаметазону, доксорубицину. Обсуждается значение мембранной молекулы адгезии CD56, потеря экспрессии которой плазматической клеткой, как правило, имеет место при прогрессии ММ, агрессивном течении заболевания и наличии плазмоцитом [2,7]. Возможные механизмы образования плазмоцитом при ММ также связаны со снижением экспрессии молекул клеточной адгезии, нарушением регуляции хемокиновых рецепторов (CD184) клетками микроокружения опухоли [8-11]. Наличие циркулирующих опухолевых плазматических клеток при ММ (ЦОК ММ) коррелирует с показателями прогрессии и низкой выживаемости при этом заболевании [12,13]. Установлены их некоторые отличия в экспрессии различных антигенов в сравнении с опухолевыми плазматическими клетками костного мозга (ПлК КМ) [14, 15]. Возможно, что различия иммунофенотипи-ческого профиля ПлК КМ и ЦОК ММ могут определять многообразие форм клинических проявлений ММ, что позволит определить новые ключевые показатели для оптимизации противоопухолевой терапии.

Цель исследования - изучить иммуно-фенотипические особенности миеломных плазматических клеток костного мозга (ПлК КМ) и циркулирующих опухолевых клеток периферической крови (ЦОК ММ) при множественной миеломе (ММ), осложненной плазмоцитомами.

Материал и методы

Обследовано 18 пациентов с ММ (9 женщин и 9 мужчин) в возрасте от 41 года до 85 лет (Ме возраста - 59 лет). У всех пациентов установлена 3-я стадия заболевания по 8а1шоп-Оипе, у 3-х (16,7%) пациентов - 3В ст. и плазмоцитомы различной локализации. У 9 (50%) пациентов выявлена миелома Ок, у 4-х (22,2%) пациентов - GХ, по 1 пациенту -Ак, АХ, БХ. У 2-х (11,1%) пациентов выявлена парапротеинемия Бенс-Джонса (у 1 пациента -Бенс-Джонс к, у 1 - Бенс-Джонс Х). Протеи-нурия Бенс-Джонса зафиксирована у 9 пациентов. Средний уровень плазматических клеток в костном мозге по данным миелограммы составил 19,3% (0,4-69,0%). Два пациента получали на момент исследования заместительную почечную терапию. Средний индекс по шкале Карновского составил 40%. У 9 пациентов на момент исследования была впервые диагностирована ММ, 9 пациентов ранее получали противоопухолевую терапию (УСР, VMP, RVР), среднее количество курсов - 6,5 (1-13 курсов). Все 9 пациентов, ранее получавших терапию, находились в стадии рецидива или прогрессии заболевания. 13 (72,2%) пациентов имели плазмоцитомы с поражением костей различной локализации (позвоночник, кости черепа, ребра, ключица), у 5 (27,8%) пациентов имелись экстрамедуллярные плазмоцитомы (почки, яички, плевра, скелетная мышечная ткань). У 14 (77,8%) больных плазмоцитомы уже имелись на момент постановки диагноза, у 4 (22,2%) пациентов локальный опухолевый рост появился в процессе лечения. У 14 (77,8%) пациентов плазмоцитомы были более 7 см в диаметре. Примечательно, что у 100% пациентов с экстрамедуллярным поражением плазмоци-томы были более 7см в диаметре. У всех пациентов наличие плазмоцитом было подтверждено гистологически. Помимо стандартных исследований при множественной миеломе, рекомендованных Международной рабочей группой по миеломе (IMWG) от 2014г., для уточнения локализации, размера и распространенности плазмоцитом пациентам проводились инструментальные исследования (УЗИ, КТ, МРТ). Характеристика пациентов представлена в табл. 1.

Таблица 1

Клиническая характеристика больных ММ, _осложненной плазмоцитомами_

Всего пациентов 18

Мужчин/женщин 9/9

Медиана возраста, лет Ме 59 (41-85)

Распределение пациентов по изотипу парапротеина 9(50%) - Gk, 4(22,2%) - GI, 1 Ak, 1 AI, 1 DI. 2(11,1%) парапротеинемия Бенс-Джонса: 1( Бенс-Джонс k), 1 ( Бенс-Джонс I). Протеинурия Бенс-Джонса - 9 пациентов

Костные/экстрамедуллярные плазмоцитомы 13 (72,2%)/5(27,8%)

Размер более/менее 7см в диаметре 14 (77,8%)/4 (22,2%)

Первичные/ранее получавшие лечение пациенты 9/9

Параллельное иммунофенотипическое исследование аспирата костного мозга (КМ) и образцов периферической крови было проведено всем больным с ММ методом четырехцветной лазерной проточной цитометрией (двухлазерным проточным цитофлюоримет-ром FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения «CellQwest». Аспират костного мозга предварительно подвергали фильтрованию (фильтр Filcons, размер пор 70 мкм, Becton Dickinson, USA) и двукратной отмывке раствором фос-фатно-солевого буфера (ФСБ), затем проводили лизис эритроцитов (лизирующим раствором PharmLyse (Becton Dickinson, USA), далее проводили двукратную отмывку раствором ФСБ. Образцы периферической крови предварительно разливали на несколько порций объемом по 500 мкл, лизировали эритроциты лизирующим раствором PharmLyse (Becton Dickinson, USA), дважды отмывали раствором ФСБ и концентрировали осадок в одной пробирке при 1500 об/мин 5 мин.

Далее образцы костного мозга и ПлК были инкубированы при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте с монокло-нальными антителами (МАТ) определенной специфичности, конъюгированными с флюоресцентными красителями в различных сочетаниях. Использовали следующие МАТ: анти-CD38-FITC (HIT2), анти^138-РБ (MI15); анти-CD45-PerCP, APC (2D1); анти^56-РБ, APC (NCAM16.2); анти-CD11с-PE (S-HCL-3), анти-CD27-PE (M-T271), анти^28- PE (CD28.2), анти-CD79b-PE (3A2-2E7), анти-CD117- PerCP (104D2), анти- CD19-PerCP-Су5,5; APC (SJ25C1); анти^20- APC (2H7), анти-CD33-APC (P67.6) (все производства

Becton Dickinson, USA); анти-CDSi- PE (клон JC64) (производство Becman Coulter, USA).

Стратегия гейтирования и выбор имму-нофенотипических маркеров, адаптированных для 4-цветного проточного цитометра, проведены в соответствии с рекомендациями Европейского Консорциума по проточной цитомет-рии (Euro-Flow, 2012). В качестве «каркасных» маркеров для идентификации и количественной оценки плазматических клеток наряду с характеристиками светорассеяния использованы CD38 и CD45. Основными этапами стратегии гейтирования плазматических клеток у больных ММ являлись выделение гейта CD38-позитивных клеток с высокой интенсивностью экспрессии - (bright) против канала бокового светорассеивания (SSC) с последующей оценкой в пределах гейта CD38+(bright) содержания позитивных клеток по интересующим антигенам. Критерием позитивности считали наличие экспрессии антигена на поверхности более чем 20% опухолевых клеток [16,17]. Нормальные плазматические клетки КМ и плазматические клетки образцов периферической крови (ОПК) исключались по фенотипу CD45+(bright)CD19+CD56-. В анализ включалось не менее 500.000 событий. Количественная оценка ПлК проводилась по содержанию CD38+(bright) клеток в пересчете на все ядро-содержащие клетки (ЯСК) костного мозга (КМ) и периферической крови (ПК).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием статистической программы Statistica v. 8.0. c расчетом средней и квадратичной ошибки средней (М±т), медианы с указанием минимального и максимального значений. Для определения статистической значимости различий в средних значениях количественных показателей использовался критерий Стъюдента. Частота встречаемости антигенов в исследуемых когортах пациентов сравнивалась по критерию Фишера.

Результаты

На рис. 1 и 2 представлены данные по частоте встречаемости позитивных антигенов в гейте ПлК CD38+(bright) в сравнительном аспекте между плазматическими клетками костного мозга (ПлК КМ) и циркулирующими опухолевыми клетками множественной мие-ломы (ЦОК ММ) у разных групп пациентов с плазмацитомами.

У больных с впервые выявленной ММ, осложненной плазмоцитомами, частота встречаемости позитивной экспрессии CD138 достоверно (р=0,01) более низкая у циркулирующих опухолевых клеток множественной миеломы (ЦОК ММ) по сравнению с плазма-

тическими клетками костного мозга (ПлК КМ). У пациентов обнаружена высокая частота встречаемости позитивной экспрессии маркеров CD56, СD11c, CD81, CD27, CD28 как на опухолевых ПлК КМ, так и на ЦОК ММ. В группе пациентов, ранее получавших терапию, частота встречаемости позитивной экспрессии CD138 также достоверно (р=0,004) снижена у ЦОК ММ по сравнению с ПлК КМ. У пациентов с впервые выявленной ММ достоверных различий в определении позитив-

ной экспрессии таких антигенов, как CD56, СD11c, CD81, CD27, CD28, CD19, CD20, CD79b, не установлено. Позитивная экспрессия миелоидных антигенов CD117 и CD33 встречалась в единичных наблюдениях как на ПлК КМ, так и на ЦОК ММ (табл. 2).

Как видно из данных табл. 2, частота встречаемости позитивной экспрессии CD79b на ПлК костного мозга у пациентов с впервые выявленной ММ достоверно выше (р=0,01), чем у пациентов, ранее получавших лечение.

№

CD138+ CD? 6+ CD1I7+ CDHc CD33+ CD81+ CD27+ CD28+ CDm CD20 CD79b

■ костный мозг ■ периферическая кровь Рис. 1. Частота встречаемости поверхностных антигенов в гейте плазматических клеток CD38+(bright) костного мозга и периферической крови у пациентов с впервые выявленной множественной миеломой. *р=0,01

100 90 80 7D 60 5D 40 3D 2D 1D О

11.1 [¡¡jj

Ж щу

1, [о] [о] ^ J

СБ138+ СБ56+ СБ 117 СБ11с+ СБЗЗ+ СБ81+ СБ27+ СБ28+ СБ19+ СБ20+ С079Ь ■ костный мозг ■ периферическая кровь

Рис. 2. Частота встречаемости поверхностных антигенов в гейте ПлК КМ(СЭ38+++) и ЦОК ММ у пациентов, ранее получавших терапию. *p=0,004

Сравнительная оценка определения позитивных антигенов ПлК КМ у пациентов

Таблица 2

Показатель Пациенты с впервые выявленной ММ Пациенты, ранее получавшие терапию р

CD138+ 8/9 (88,9%) 8/9(88,9%) 1,00

CD56+ 7/ 8 (87,5%) 9/9(100%) 0,27

CD117+ 1/8 (12,5%) 1/9(11,1%) 0,93

CD11c+ 7/8 (87,5%) 8/8(100%) 0,30

CD33+ 1/8 (12,5%) 0/8 0,30

CD81+ 7/8 (87,5%) 7/9 (77,7) 0,60

CD27+ 8/8 (100 %) 7/8 (87,5) 0,30

CD28+ 3/5 (60,0%) 4/7(57,1%) 0,92

CD19+ 4/9 (44,4%) 3/9(33,3) 0,63

CD20+ 2/8 (25,0%) 0/9 0,11

CD79b+ 6/8 (75%) 1/8(12,5%) 0,01

При анализе данных, представленных в табл. 3, установлено, что частота встречаемости позитивной экспрессии CD19 на ЦОК ММ

у пациентов с впервые выявленной ММ достоверно выше (р=0.003), чем у пациентов, ранее получавших терапию. Таким образом, у паци-

ентов с впервые выявленной ММ наблюдалась более высокая частота встречаемости антигенов в ранней стадии дифференцировки плазматических клеток СБ79Ь и СБ 19 в костном мозге и в периферической крови. Помимо анализа частоты встречаемости нами была проведена

При сравнительном анализе количества плазматических клеток, рассчитанных в процентах от всех ядросодержащие клеток, у пациентов с впервые выявленной ММ не выявлено существенных различий между количеством плазмоцитов костного мозга и циркулирующих опухолевых клеток, обнаруженных

Среди пациентов с ММ, получавших терапию, также не было отмечено существенных различий между количеством плазмоцитов костного мозга и циркулирующих опухолевых клеток, рассчитанных в процентах от всех ЯСК. ЦОК ММ у этой группы пациентов также характеризовались достоверным снижением (р=0,0003) экспрессии молекулы синдекана-1 (CD138+) и увеличением (р=0,0005) содержания популяции CD138-негативных ПлК.

Все 5 пациентов с экстрамедуллярными плазмоцитомами ранее получали противоопухолевую терапию, были в стадии прогрессии заболевания. У 1 пациента иммунофенотипы ПлК КМ и ЦОК ММ были идентичными, причем содержание ПлК в костном мозге и в пе-

количественная оценка плазматических клеток, экспрессирующих СБ138 (табл. 4, 5). Количественная оценка всех ПлК проводилась по содержанию CD38+(bright)-клеток в пересчете на все ядросодержащие клетки (ЯСК) костного мозга и периферической крови.

Таблица 3

Таблица 4

в периферической крови. ЦОК ММ у больных с впервые выявленной ММ характеризовались достоверным (р<0,001) снижением экспрессии молекулы синдекана-1 (СБ 138), значительным увеличением (р<0,001) содержания популяции CD138 -негативных плазматических клеток.

Таблица 5

риферической крови составляло 78 и 81,3% соответственно. Иммунофенотип ПлК данного пациента представлен CD138+ CD56+ CD81+ CD117- CD19- CD20- CD45 (-/+). Клиническое течение ММ у него было быстропрогрессиру-ющим с наличием плазмоцитомы, хронической почечной недостаточности и исходом в плаз-моклеточный лейкоз.

Остальные 4 пациента имели содержание ПлК костного мозга от ЯСК в диапазоне от 0,5 до 4,1%; в периферической крови - от 0,04 до 2,4%. У всех этих пациентов наблюдалась позитивная экспрессия CD79b на ПлК периферической крови, у 3-х - позитивная. Фенотип ПлК КМ характеризовался CD 138+ во всех случаях; CD56 (-) наблюдался у 1 пациента, что сопро-

Сравнительная оценка выявленных позитивных антигенов циркулирующих опухолевых клеток ММ

у пациентов с впервые выявленной ММ и пациентов, ранее получавших терапию

Показатель Пациенты с впервые выявленной ММ Пациенты, ранее получавшие терапию р

CD138+ 3/8 (37,5%) 2/9(22,2%) 0,49

CD56+ 8/9 (88,9%) 9/9(100%) 0,30

CD117+ 3/9 (33,3%) 1/9(11,1%) 0,26

CD11c+ 8/9 (88,9%) 8/8 (100%) 0,33

CD33+ 3/9 (33,3%) 0/8 0,07

CD81+ 9/9 (100%) 8/9(88,9%) 0,30

CD27+ 6/9 (66,7%) 8/8(100%) 0,07

CD28+ 3/5 (60,0%) 5/7(71,4%) 0,68

CD19+ 6/9 (66,7%) 0/9 0,003

CD20+ 1/9 (11,1%) 0/9 0,30

CD79b+ 5/9 (55,5%) 3/8 (37,5%) 0,46

Количество опухолевых плазматических клеток и особенности экспрессии СБ138 в ПлК КМ и ЦОК ММ у больных с впервые выявленной ММ, осложненной плазмоцитомами (п=9), %

Показатель Костный мозг (ПлК ММ) М±т; Me (min-max) Периферическая кровь (ЦОК ММ) М±т; Me (min-max) р

CD38+(bright) клетки от всех ЯСК Из них: 4,17±1,64; 1,5 (0,1-12,6) 1,62±0,6; 1,2 (0,1-2,9) Р>0,05

CDm+клетки 82,77±5,97 18,2±8,4 P<0,001 p=0,0000)

CD138- клетки 16,0±6,3 88,8±4,0 P<0,001 (p=0,0000)

Количество опухолевых плазматических клеток и особенности экспрессии СЭ138 в ПлК КМ и ЦОК ММ у ранее получавших терапию больных ММ, осложненной плазмоцитомами (п=9), %

Показатель Костный мозг (ПлК ММ) М±m; Me (min-max) Периферическая кровь (ЦОК ММ) М±m; Me (min-max) р

CD38+(bright) клетки от всех ЯСК Из них: 5,25±2,2; 4,1 (0,5-78) 2,07±0,7; 1,6 (0,1-81,3) Р>0,05

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

еЭ138+клетки 79,4±7,3 23,6±10,8 P<0,001 (p=0,0003)

CD138- клетки 20,95±7,2 73,4±10,6 P<0,001 (p=0,0005)

вождалось позитивной экспрессией CD11с, CD81, CD27, CD79b, отсутствием экспрессии CD19 и CD20; в ПлК ПК этого пациента обнаружены CD56 (+), позитивность CD11с, CD81,

CD27, CD19, CD79b, отсутствие экспрессии CD20, CD117, CD33. В 1 случае обнаружена позитивная экспрессия CD117 в ПлК костного мозга и периферической крови (табл. 6).

Таблица 6

Иммунофенотип ПлК КМ и ЦОК ММ у пациентов с экстрамедуллярными плазмоцитомами

Пациент Антиген СЭ138 СЭ56 СЭ117 СЭ11с СЭ33 СЭ81 СЭ27 СЭ28 СЭ19 СЭ20 СЭ79Ъ

1. ПлК КМ + + - 0 0 + 0 0 - - 0

ЦОК ММ + + - 0 0 + 0 0 - - 0

2. ПлК КМ + - - + - + + 0 - - +

ЦОК ММ + + - + - + + 0 + - +

3. ПлК КМ + + - + -- + + + - - -

ЦОК ММ + + - + - + + - - +

4. ПлК КМ + + - ++ - - -+ - - - -

ЦОК ММ - + - - + - - - +

5. ПлК КМ +- + + ++ - + + + +- - +

ЦОК ММ + + - + + + - +

Анализ частоты обнаружения позитивной экспрессии изучаемых поверхностных молекул у пациентов с костными и экстрамедуллярными плазмоцитомами (рис. 2) показал, что только в группе пациентов с костными плазмоцитомами частота встречаемости позитивной экспрессии CD138 достоверно (р=0,0004) ниже при ЦОК ММ по сравнению с ПлК КМ. Напротив, у пациентов с наличием экстрамедуллярных плазмоцитом не получено достоверных различий по частоте встречаемости изучаемых антигенов между ПлК КМ и ЦОК ММ. Оценка параметров поверхностного фенотипа опухолевых плазматических клеток костного мозга в группах пациентов с костными и экстрамедуллярными плазмоци-томами не выявила достоверных различий в

частоте экспрессии большинства изучаемых маркеров (рис. 3,4).

При оценке фенотипических особенностей ЦОК ММ в двух сравниваемых группах выявлена достоверно (р=0,0004) более высокая частота встречаемости CD79b у пациентов с экстрамедуллярными плазмоцитомами (табл. 7). При сравнении частоты встречаемости позитивной экспрессии изучаемых поверхностных антигенов на ПлК КМ и ЦОК ММ в группах пациентов с плазмоцитомами в зависимости от размеров образования (более или менее 7 см) (рис. 5, рис. 6) нами была определена достоверно (р=0,008; р=0,03 соответственно) более низкая частота встречаемости позитивной экспрессии CD138 на ЦОК ММ в обеих группах пациентов (табл. 8).

10,7 | 138,4

СП 138+ СГО6+ СО] 17+ СШ 1е+ СОЗЗ+ СШ1 + СП27+ СП28+ СО 19+ СВ2(Н С07Я>

■ костный МОЗГ ■ периферический крсжь Рис. 3. Частота встречаемости поверхностных антигенов в гейте ПлК КМ (СЭ38+++) и ЦОК ММ у пациентов с ММ с костными плазмоцитомами. *р=0,0004

Сравнительная оценка выявляемости позитивных антигенов ЦОК ММ

Таблица 7

Показатель Пациенты с костными плазмоцитомами Пациенты с экстрамедуллярными плазмоцитомами р

СЭ138+ 2/13 (15,3%) 3/5(60%) 0,06

СЭ56+ 10/13 (76,9%) 5/5(100%) 0,24

СЭ117+ 0/13 1/5(20%) 0,10

СЭ11с+ 11/13 (84,6%) 4/4(100%) 0,40

СЭ33+ 2/13 (15,3%) 0/4 0,40

СЭ81+ 12/13 (92,3%) 4/5(80%) 0,46

СЭ27+ 12/13 (92,3%) 4/4(100%) 0,57

СЭ28+ 5/ 9 (55,6 %) 2/3(66,6%) 0,74

СЭ19+ 3/13 (23,1%) 1/5(20%) 0,89

СЭ20+ 1/13 (7,6%) 0/5 0,52

СЭ79Ъ+ 1/13 (7,6%) 4/4(100%) 0,0004

CD1ÎS+ CD 561 CD117+ CDU с СШЗ+ CDE1+ CD27I CD28I CD 19+ CDKH CD70M

■ :-г-]П мозг ■ периферическая кровь

Рис. 4. Частота встречаемости поверхностных антигенов в гейте ПлК КМ (СБ38+++) и ЦОК ММ у пациентов с ММ с экстрамедуллярными плазмоцитомами

CD13S- CD56— CD117+ CDllc- CD33- CDS1+ CD27- CD28- CD19- CD20- CD7ï>b-

■ костный мозг ■ периферическая кровь

Рис. 5. Частота встречаемости поверхностных антигенов в гейте ПлК KM (CD38+++) и ЦОК ММ у пациентов с ММ с плазмоцитомами более 7 см в диаметре. *p=0,008

CD138- CD56- CD117+ CDllc- CD33+ CDS1+ CD27- CD28- CD19+ CD20- CD79b-■ костный мозг ■ периферическая кровь

Рис. 6. Частота встречаемости поверхностных антигенов в гейте ПлК (CD38+++) у пациентов с ММ с плазмоцитомами менее 7 см в диаметре. *p=0,03

Таблица 8

Сравнительная оценка выявляемости позитивных антигенов ПлК КМ у пациентов с плазмоцитомами более 7 и менее 7 см

Показатель Плазмоцитома более 7 см Плазмоцитома менее 7 см Р

CD138+ 11/14(78,5%) 4/4(100%) 0,31

CD56+ 12/14(85,7%) 4/4(100%) 0,42

CD117+ 2/14(14,2%) 0/4 0,42

CD11c+ 12/13(92,3%) 4/4(100%) 0,57

CD33+ 1/13(7,6%) 0/4 0,57

CD81+ 11/14(78,5%) 4/4(100%) 0,31

CD27+ 11/13(84,6%) 4/4(100%) 0,40

CD28+ 5/8 (62,5%) 3/4(75%) 0,67

CD19+ 6/14 (42,8%) 1/4(25%) 0,52

CD20+ 0/14 1/4(25%) 0,05

CD79b+ 5/13(38,4%) 2/4 (50%) 0,68

При сравнении фенотипических особенностей ПлК КМ и ЦОК ММ у пациентов с ММ в зависимости от размеров плазмоцитом (табл. 8) нами отмечено, что у пациентов с плазмоцитомой размером менее 7 см в диаметре отмечалась значительно (р=0,05) более высокая частота позитивной экспрессии СБ20 только на ПлК КМ по сравнению с пациентами, имеющими плазмоцитомы более 7 см в диаметре. Стоит отметить, что ЦОК ММ у всех пациентов сравниваемых групп не экс-прессировали данную молекулу.

Обсуждение

Нами выявлено, что общее количество ЦОК ММ (в % от ЯСК) достоверно не отличалось от числа опухолевых плазматических клеток костного мозга как у впервые выявленных, так и у ранее получавших терапию пациентов с ММ, осложненной плазмоцито-мами. Возможно, это положение является особенностью при таком клинически осложненном варианте заболевания. Сравнительный анализ фенотипических особенностей ПлК КМ и ЦОК ММ у пациентов выявил выраженные статистически значимые различия по частоте встречаемости и интенсивности экспрессии антигена CD138, который представлен на большей части популяции ПлК КМ, но при этом практически мало экспрессирован на популяции ЦОК ММ. Этот факт является весьма важным в понимании механизмов ме-тастазирования при ММ с формированием участков локального опухолевого роста.

Синдекан-1 (CD138) как адгезивная молекула обеспечивает связь плазматической клетки с костно-мозговым микроокружением и способствует ее выживаемости [18]. Лишенные этого белка опухолевые плазматические клетки, вероятно, теряют связь с костномозговым матриксом и выходят в циркуляцию, где выживаемость им обеспечивает высокая экспрессия CD38, CD56, CD81 и другие поверхностные белки, в том числе и адгезивные, позволяющие ЦОК ММ сохранять активность в периферической крови и фиксироваться в некроветворных тканях. Это предположение подтверждается клинической характеристикой пациентов, принявших участие в этом исследовании и имевших опухолевое поражение центральной нервной системы, почек, яичек или иной локализацией.

В процессе дифференцировки В-клетки памяти в плазматическую клетку происходят постепенная утрата экспрессии В-ассоциированных маркеров (CD19, CD20, CD27), снижение и/или утрата экспрессии CD45, усиление экспрессии CD38 и CD138.

Экспрессия синдекана-1 (CD138) характерна только для плазматических клеток, независимо от того, являются ли они нормальными или злокачественными. Низкий уровень пролиферации (менее 1%) миелом-ных плазматических клеток и рецидивирующее течение ММ являются причиной предположения о самовоспроизводимости популяции миеломных клеток (стволовых опухолевых клеток ММ), способной к возобновлению роста опухоли и устойчивой к терапии [19]. Было установлено, что роль стволовых мие-ломных клеток могут играть плазматические клетки, в которых отсутствует экспрессия CD 138 [20]. Некоторые экспериментальные и клинические исследования показали, что CD138-негативные клетки отличались более высокой клоногенной активностью и более выраженной экспрессией CD19 и CD20. Они способны при длительном культивировании восстанавливать CD138-позитивную популяцию клеток миеломы, а также обладают устойчивостью к химиотерапии. Некоторые авторы охарактеризовали данную популяцию клеток как менее зрелую и обладающую повышенным пролиферативным потенциалом [21-25]. Кроме того, потеря внеклеточного домена синдекана-1 в результате протеолитиче-ского высвобождения («shedding», или «слу-щивание») может приводить к увеличению уровня сывороточного синдекана-1 у больных с ММ и снижению выживаемости [26].

Позитивная экспрессия CD19 на ЦОК ММ выявлялась достоверно чаще, чем на ПлК КМ, у впервые диагностированных пациентов с ММ, осложненной плазмоцитомами. Этот факт свидетельствует о менее «зрелой» с биологической точки зрения популяции опухолевых клеток, обнаруженных в периферической крови. Кроме того, повышенная экспрессия CD19 на опухолевых клетках костного мозга часто коррелирует с неблагоприятным цито-генетическим профилем [27].

CD79b - трансмембранный гетеродимер -является антигеном дифференцировки В-лимфоцитов и участвует в проведении акти-вационных сигналов [28].

Частота встречаемости позитивной экспрессии CD79b на ПлК костного мозга у впервые выявленных пациентов достоверно выше, чем у ранее получавших терапию пациентов, а выраженное увеличение частоты встречаемости CD79b на ЦОК ММ в большей степени характерно для экстрамедуллярных плазмоцитом. Таким образом, выявление позитивной экспрессии CD79b ПлК КМ у впервые выявленных пациентов может означать

повышение риска развития экстрамедуллярных плазмоцитом, а также может указывать на включающиеся механизмы редактирования опухоли, которые позволяют избегать противоопухолевый контроль, реализуемый проводимыми терапевтическими опциями и собственно иммунной системой пациента.

Экспрессия поверхностного CD20 была обнаружена достоверно чаще на ПлК КМ по сравнению с ЦОК ММ у пациентов с размерами плазмоцитом менее 7 см в диаметре. Этот факт трудно объяснить. Позитивная экспрессия CD20 встречается в 10-15% случаев у больных с ММ и коррелирует с редким кли-нико-морфологическим вариантом «Small lymphocyte-like plasma cell myeloma» и наличием неблагоприятных генетических аномалий в виде транслокаций (11; 14) [29,30].

Обычно в процессе дифференцировки плазматическая клетка теряет молекулу CD20, поэтому обнаружение ее мембранной экспрессии на ПлК КМ у пациентов с плазмоци-томами менее 7 см в диаметре, возможно, свидетельствует о некоторой фенотипической "незрелости" или может коррелировать с меньшей пролиферативной активностью этого опухолевого клона. Отсутствие экспрессии CD20 на ЦОК ММ, вероятно, связано с потерей этой молекулы при выходе плазматической клетки из костного мозга в периферическую кровь. Полученные данные требуют дальнейшего изучения пролиферативного потенциала плазматических клеток при ММ.

Значение экспрессии молекул CD27 (антиген дифференцировки В-клеток - кле-ток-памяти) и CD28 на опухолевых плазматических клетках при ММ в настоящее время интенсивно изучается. По данным некоторых исследователей снижение экспрессии CD27 и высокий уровень экспрессии CD28 на опухолевых плазматических клетках являются факторами развития медуллярных или экстрамедуллярных рецидивов при ММ. Вместе с тем высокая экспрессия CD28, определяемая на ЦОК ММ, способствует избеганию апоптоза плазмоцитами опухолевого клона. [31,32].

Заключение

В результате исследования нами получены данные о существовании у больных с ММ, осложненной плазмоцитомами, субклона циркулирующих опухолевых клеток, характеризующихся уникальным иммунофенотипи-ческим профилем экспрессии поверхностных антигенов. Существенное увеличение частоты встречаемости позитивной экспрессии антигенов CD19, CD79b, выраженное снижение

экспрессии молекулы адгезии (CD138) на ЦОК ММ свидетельствуют о менее «зрелом» фенотипе этой популяции и потенциально высокой ее способности к диссеминации.

В ходе проведенного исследования установлено, что независимо от статуса заболевания, вида и размера плазмоцитом, частота встречаемости позитивной экспрессии CD138 значительно ниже на ЦОК ММ, чем на ПлК КМ. Экспрессия этого белка на поверхности миеломной клетки обеспечивает связь опухоли с костно-мозговым матриксом и способствует ее выживанию [33]. Таким образом, вероятно, что потеря молекулы синдекана-1 имеет отношение к миграции опухолевых плазмоцитов из костного мозга в периферическую кровь, где циркулирующая опухолевая клетка за счет (в первую очередь) высокой экспрессии CD38 поддерживает свой гомеостаз. Выявленная позитивная экспрессия адгезивных молекул CD11c и CD56, представленных на ЦОК ММ, может способствовать аккумуляции этих клеток в различных местах и способствовать росту плазмоцитом. Эти результаты получены у больных с ММ, осложненной плазмоцитомами. В то же время в ранее опубликованных литературных источниках [34,35] нет ссылок на такое клиническое течение заболевания. В этой связи мы предполагаем связь наличия плазмоцитом при ММ с высокой экспрессией адгезивных молекул.

Наличие ЦОК при ММ указывает на то, что зрелые опухолевые плазматические клетки обладают пластичностью и в определенных условиях способны трансформироваться в клетки, сходные по своим характеристикам со стволовыми опухолевыми клетками.

Выявленное в данном исследовании сочетание определенных иммунофенотипиче-ских маркеров, экспрессируемых ПлК КМ, позволяет у пациентов с впервые выявленной ММ прогнозировать развитие таких важных осложнений, как появление экстрамедуллярных или солитарных костных плазмоцитом. Наличие клона ЦОК ММ создает предпосылки к распространению опухолевого процесса и появлению локального опухолевого роста и требует отдельного иммунологического мониторинга. При иммунофенотипическом исследовании пациентов с ММ представляется необходимым учитывать популяцию CD138-негативных миеломных клеток как в ком-партменте ПлК КМ, так и при детекции ЦОК ММ, что позволит прогнозировать развитие заболевания и корректировать терапию.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах статьи: Белоусов Кирилл Александрович - научный сотрудник отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО МОНИКИ. Адрес: 129110, г. Москва, ул. Щепкина, 61/2. E-mail: k_bel88@mail.ru.

Митина Татьяна Алексеевна - д.м.н., руководитель отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО МОНИКИ. Адрес: 129110, г. Москва, ул. Щепкина, 61/2. E-mail: mi_69@inbox.ru.

Чуксина Юлия Юрьевна - старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории ГБУЗ МО МОНИКИ. Адрес: 129110, г. Москва, ул. Щепкина, 61/2. E-mail: tchuxina2009@yandex.ru.

Голенков Анатолий Константинович - д.м.н., профессор кафедры терапии ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ. Адрес: 129110, г. Москва, ул. Щепкина, 61/2.

Трифонова Елена Викторовна - к.м.н., старший научный сотрудник отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО МОНИКИ. Адрес: 129110, г. Москва, ул. Щепкина, 61/2.

Катаева Елена Васильевна - к.м.н., старший научный сотрудник отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО МОНИКИ. Адрес: 129110, г. Москва, ул. Щепкина, 61/2.

Черных Юлия Борисовна - к.м.н., старший научный сотрудник отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО МОНИКИ. Адрес: 129110, г. Москва, ул. Щепкина, 61/2.

Высоцкая Людмила Леонидовна - к.м.н., научный сотрудник отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО МОНИКИ. Адрес: 129110, г. Москва, ул. Щепкина, 61/2.

Захаров Сергей Геннадьевич - научный сотрудник отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО МОНИКИ. Адрес: 129110, г. Москва, ул. Щепкина, 61/2.

Клинушкина Елена Федоровна - м.н.с., зав. отделением клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО МОНИКИ. Адрес: 129110, г. Москва, ул. Щепкина, 61/2.

Митин Александр Николаевич - зав. лабораторией дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России. Адрес: 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24.

Бакиров Булат Ахатович - д.м.н., зав. кафедрой госпитальной терапии № 2 ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450008, г. Уфа, ул. Ленина, 3. E-mail: Bakirovb@gmail.com.

ЛИТЕРАТУРА

1. Damaj G, Mohty M, Vey N, et al. Features of extramedullary and extraosseous multiple myeloma: a report of 19 patients from a single center. Eur J Haematol 2004;73:402.

2. Blade J, Fernandez de Larrea C, et al. Soft-tissue plasmacytomas in multiple myeloma: incidence, mechanisms of extramedullary spread. and treatment approach. J Clin Oncol 2011;29:3805-12.

3. Sheth N, Yeung J, Chang H. p53 nuclear accumulation is associated with extramedullary progression of multiple myeloma. Leuk Res 2009;33:1357-60.

4. Barlogie B, Smallwood L, Smith T, Alexanian R. High serum levels of lactic dehydrogenase identify a high-grade. Ann Intern Med 1989;110:521-5.

5. Fassas AB, Spencer T, Sawyer J, et al. Both hypodiploidy and deletion of chromosome 13 independently confer poor prognosis in multiple myeloma. Br J Heamatol 2002;118:1041-7.

6. Бессмельцев С.С. Множественная миелома (патогенез, клиника, диагностика, дифференциальный диагноз). Часть I. Клиническая онкогематология. 2013, N°3 т.6: с. 237-254.

7. Noborio-Hatano K, Kikuchi J, Takatoku M, et al. Bortezomib overcomes cell-adhesion mediated drug resistance through down regulation of VLA-4 expression in multiple myeloma. Oncogene 2009;28:231-42.

8. Kremer M, Ott G, Nathrath M, et al. Primary extramedullary plasmacytoma and multiple myeloma: phenotypic differences revealed by immunohistochemical analysis. J Pathol 2005;205: 92-101.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

9. Ali R, Ozkalemkas F, Ozkan A, et al. Bortezomib and extramedullary disease in multiple myeloma. The shine and dark side of the moon. Leuk Res 2007;31:1153-5.

10. Oliveira AM, Maria DA, Metzger M, et al. Thalidomide treatment down-regulates SDF-1 alpha and CXCR4 expression in multiple myeloma patients. Leuk Res 2009;33:970-3.

11. Wirk B, Wingard JR, Moreb JS. Extramedullary disease in plasma cell myeloma: the iceberg phenomeno. Bone Marrow Transplant 2013;48:10-8.

12. Hedvat CV, Comenzo RL, Teruya-Fedstein J, et al. Insights into extramedullary tumor cell growth revealed by expression profiling of human plasmacytomas and multiple myeloma. Br J Haematol 2003;122: 728-44.

13. Paiva B, Paino T, Sayagues J-M, Garayoa M, San-Segundo L, Martin M et al. Detailed characterization of multiple myeloma circulating tumor cells shows unique phenotypic, cytogenetic, functional, and circadian distribution profile. Blood 2013; 122: 3591-3598.

14. Nowakowski GS, Witzig TE, Dingli D, Tracz MJ, Gertz MA, Lacy MQ et al. Circulating plasma cells detected by flow cytometry as a predictor of survival in 302 patients with newly diagnosed multiple myeloma. Blood 2005; 106: 2276-2279.

15. С.В. Шевелев, Т.А. Митина, Ю.Б. Черных, Е.В. Катаева, В.В. Яздовский, Ю.Ю. Чуксина. Иммунофенотипирование трансформированных плазматических клеток костного мозга у больных множественной миеломой. Евразийский онкологический журнал 33(03)2014. Тезисы VIII съезда онкологов и радиологов СНГ и Евразии 16-18 сентября 2014 - Т.33 (03) - С.631-632.

16. Current applications of multiparameter flow cytometry in plasma cell disorders.T Jelinek, R Bezdekova, M Zatopkova, L Burgos, 3M Simicek,T Sevcikova, B Paiva, R Hajek. Blood Cancer J. 2017 Oct; 7(10): e617.Published online 2017 Oct 20.

17. О.Ю. Якимович, О.М. Вотякова, Н.В. Любимова, Н.Н. Тупицин. Клиническая онкогематология, 2016; 9 (3): 926-301.

18. Maria Kraj, Joanna Kopec-Szlezak, Ryszard Pogfod, Barbara Kruk. Folia Histochemica et cytobiologica, Vol.49, N°1 , 2011 р. 168-182.

19. Liu Z, Xu J, He J, Zheng Y, Li H, Lu Y, Qian J, Lin P, Weber DM, Yang J, Yi Q. A critical role of autocrine sonic hedgehog signaling in human CD138+ myeloma cell survival and drug resistance. Blood. 2014 Sep 25;124(13):2061-71.

20. Yaccoby S. The phenotypic plasticity of myeloma plasma cells as expressed by dedifferentiation into an immature, resilient, and apopto-sis-resistant phenotype. Clin Cancer Res 2005; 11(21): 7599-606.

21. Matsui W., Huff C.A., Wang Q. et al. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells. Blood 2004; 103 (6):2332-6.

22. Reghunathan R., Bi C., Lui S.C. et al., Clonogenic multiple myeloma cells have shared stemness signature associated with patient survival. Oncotarget 2013; 4(8): 1230-40.

23. Fuhler G.M., Baanstra M., Chesikc D. et al. Bone marrow stromal cell interaction reduces syndecan-1 expression and induces kinomic changes in myeloma cells. Exp. Cell Res. 2010; 316(11): 1816-28.

24. Zlei M., Egert S., Wider D. et al. Characterization of in vitro growth of multiple myeloma cells. Exp. Hematol 2007; 35(10): 1550-61.

25. Matsui W., Wang Q., Barber J.P. et al. Clonogenic multiple myeloma progenitors, stem cell properties, and drug resistance. Cancer Res 2008; 68 (1): 190-7.

26. Kawano Y., Fujiwara S., Wada N et al. Multiple myeloma cells expressing low levels of CD138 have an immature phenotype and reduced sensitivity to lenalidomide. Int. J. Oncol. 2012; 41(3):876-84.

27. Seidel C., Sundan A., Hjorth M. Et al. Serum syndecan-1: a new independent prognostic marker in multiple myeloma. Blood 2000; 95(2):388-92.

28. Andrei Garifullin, Irina Martynkevich, Sergei Voloshin, Alexei Kuvshinov, Ludmila Martynenko, Elizaveta Kleina and Kudrat Abdul-kadyrov. The Frequency of Genetic Anomalies According to Clonal Plasma Cells' Phenotype in Patients with Newly Diagnosed (ND) Multiple Myeloma (MM). Blood 2015 126:5316.

29. Die V1, Milosevic-Jovcic N, Petrovic S, Markovic D, Bila J, Boskovic D, Stefanovic G, Markovic O, Glibetic M. Signaling status of IgG B cell receptor (IgG BCR) is indicative for an activated state of circulating B cells in multiple myeloma. Ann Hematol. 2007 Dec;86(12):905-12.

30. Nelly Robillard, Hervé Avet-Loiseau, Richard Garand, Philippe Moreau, Danielle Pineau, Marie-Josée Rapp, Jean-Luc Harousseau and Régis Bataille. CD20 is associated with a small mature plasma cell morphology and t(11;14) in multiple myeloma. Blood 2003 102:1070-1071.

31. Heerema-McKenney A et al. Clinical, immunophenotypic, and genetic characterization of small lymphocyte-like plasma cell myeloma: a potential mimic of mature B-cell lymphoma. Am JClin Pathol 2010; 133(2): 265-270.

32. Karthick R.M. Raja, Lucie Kovarova and Roman Hajek. Review of phenotypic markers used in flow cytometric analysis of MGUS and MM, and applicability of flow cytometry in other plasma cell disorders. British Journal of Haematology, 2010, 149, 334-351.

33. Megan E. Murray, Catherine M. Gavile, Jayakumar R. Nair, Chandana Koorella, LouiseM. Carlson, Daniela Buac, Adam Utley, Marta Chesi, P. Leif Bergsagel, Lawrence H. Boise and Kelvin P. Lee. CD28-Mediated Pro-Survival Signaling in Multiple Myeloma, Blood 2014 123:3770-3779.

34. Lukas Janker, Rupert Laurenz Mayer, Andrea Bileck, Dominique Kreutz, Johanna C. Mader, Kirsten Utpatel, Daniel Heudobler, Hermine Agis, Christopher Gerner and Astrid Slany Metabolic, anti-apoptotic and immune evasion strategies of primary human myeloma cells indicate adaptations to hypoxia.

35. Paiva B, Paino T, Sayagues JM, Garayoa M, San-Segundo L, Martín M, Mota I, Sanchez ML, Barcena P, Aires-Mejia I, Corchete L, Jimenez C, Garcia-Sanz R, Gutierrez NC, Ocio EM, Mateos MV, Vidriales MB, Orfao A, San Miguel JF. Detailed characterization of multiple myeloma circulating tumor cells shows unique phenotypic, cytogenetic, functional, and circadian distribution profile.

REFERENCES

1. Damaj G, Mohty M, Vey N, et al. Features of extramedullary and extraosseous multiple myeloma: a report of 19 patients from a single center. Eur J Haematol 2004;73:402.

2. Bladé J, Fernández de Larrea C, et al. Soft-tissue plasmacytomas in multiple myeloma: incidence, mechanisms of extramedullary spread. and treatment approach. J Clin Oncol 2011;29:3805-12.

3. Sheth N, Yeung J, Chang H. p53 nuclear accumulation is associated with extramedullary progression of multiple myeloma. Leuk Res 2009;33:1357-60.

4. Barlogie B, Smallwood L, Smith T, Alexanian R. High serum levels of lactic dehydrogenase identify a high-grade. Ann Intern Med 1989;110:521-5.

5. Fassas AB, Spencer T, Sawyer J, et al. Both hypodiploidy and deletion of chromosome 13 independently confer poor prognosis in multiple myeloma. Br J Heamatol 2002;118:1041-7.

6. Bessmel'tsev S.S. Mnozhestvennaya mieloma (patogenez, klinika, diagnostika, differentsial'nyi diagnoz). Chast' I. Klinicheskaya onkogematologiya. 2013, №3 t.6: s. 237-254. (in Russ)

7. Noborio-Hatano K, Kikuchi J, Takatoku M, et al. Bortezomib overcomes cell-adhesion mediated drug resistance through down regulation of VLA-4 expression in multiple myeloma. Oncogene 2009;28:231-42.

8. Kremer M, Ott G, Nathrath M, et al. Primary extramedullary plasmacytoma and multiple myeloma: phenotypic differences revealed by immunohistochemical analysis. J Pathol 2005;205: 92-101.

9. Ali R, Ozkalemkas F, Ozkan A, et al. Bortezomib and extramedullary disease in multiple myeloma. The shine and dark side of the moon. Leuk Res 2007;31:1153-5.

10. Oliveira AM, Maria DA, Metzger M, et al. Thalidomide treatment down-regulates SDF-1 alpha and CXCR4 expression in multiple myeloma patients. Leuk Res 2009;33:970-3.

11. Wirk B, Wingard JR, Moreb JS. Extramedullary disease in plasma cell myeloma: the iceberg phenomeno. Bone Marrow Transplant 2013;48:10-8.

12. Hedvat CV, Comenzo RL, Teruya-Fedstein J, et al. Insights into extramedullary tumor cell growth revealed by expression profiling of human plasmacytomas and multiple myeloma. Br J Haematol 2003;122: 728-44.

13. Paiva B, Paino T, Sayagues J-M, Garayoa M, San-Segundo L, Martín M et al. Detailed characterization of multiple myeloma circulating tumor cells shows unique phenotypic, cytogenetic, functional, and circadian distribution profile. Blood 2013; 122: 3591-3598.

14. Nowakowski GS, Witzig TE, Dingli D, Tracz MJ, Gertz MA, Lacy MQ et al. Circulating plasma cells detected by flow cytometry as a predictor of survival in 302 patients with newly diagnosed multiple myeloma. Blood 2005; 106: 2276-2279.

15. S.V. Shevelev, T.A. Mitina, Yu.B. Chernykh, E.V. Kataeva, V.V. Yazdovskii, Yu.Yu. Chuksina. Immunofenotipirovanie transformiro-vannykh plazmaticheskikh kletok kostnogo mozga u bol'nykh mnozhestvennoi mielomoi. Evraziiskii onkologicheskii zhurnal 33(03)2014. Tezisy VIII s''ezda onkologov i radiologov SNG i Evrazii 16-18 sentyabrya 2014 - T.33 (03) - S.631-632. (in Russ)

16. Current applications of multiparameter flow cytometry in plasma cell disorders.T Jelinek, R Bezdekova, M Zatopkova, L Burgos, 3M Simicek, T Sevcikova, B Paiva, R Hajek. Blood Cancer J. 2017 Oct; 7(10): e617.Published online 2017 Oct 20.

17. O.Yu.Yakimovich, O.M. Votyakova, N.V. Lyubimova, N.N. Tupitsin. Klinicheskaya onkogematologiya, 2016; 9 (3): 926-301. (in Russ)

18. Maria Kraj, Joanna Kopec-Szlezak, Ryszard Pogfod, Barbara Kruk. Folia Histochemica et cytobiologica, Vol.49, N°1 , 2011 p. 168-182.