CC BY
1
Для корреспонденции
Кишилова Светлана Анатольевна - младший научный сотрудник
Центральной лаборатории микробиологии ФГАНУ «ВНИМИ»
Адрес: 115093, Российская Федерация, г. Москва,
ул. Люсиновская, д. 35, корп. 7
Телефон: (499) 236-04-02
E-mail: s_kishilova@vnimi.org
https://orcid.org/0009-0000-9498-4757
Кишилова С.А.1, Терехова Р.П.2, Рожкова И.В.1, Юрова Е.А.1
Сравнительная оценка антагонистической активности коллекционных лактобацилл в отношении полирезистентных Klebsiella pneumoniae
1 Федеральное государственное автономное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности», 115093, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр хирургии имени А.В. Вишневского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
1 All-Russian Dairy Research Institute, 115093, Moscow, Russian Federation
2 A.V. Vishnevsky National Medical Research Center for Surgery, Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
Comparative evaluation of the antagonistic activity of collection lactobacilli against the multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae
Kishilova S.A.1, Terekhova R.P.2, Rozhkova I.V.1, Yurova E.A.1
С учетом известных данных о высокой распространенности полирезистентных энтеробактерий, в частности Klebsiella spp, энтерогеморрагических Escherichia coli и их возможности сохранять свою жизнеспособность в кисломолочных продуктах при использовании технологий, в процессе которых наряду с заква-сочными микроорганизмами могут выживать и даже размножаться некоторые энтеробактерии, обладающие повышенной устойчивостью к факторам внешней среды, в первую очередь активной кислотности, поиск новых штаммов молочнокислых пробиотических бактерий с выраженным антимикробным действием является одним из наиболее актуальных направлений исследований в пищевой биотехнологии. Представители рода Lactobacillus рассматриваются в настоящее время как наиболее перспективные объекты для поиска продуцентов
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция исследования - Рожкова И.В., Юрова Е.А.; сбор данных - Терехова Р.П., Кишилова С.А.; обработка данных, написание текста - Кишилова С.А.; редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.
Для цитирования: Кишилова С.А., Терехова Р.П., Рожкова И.В., Юрова Е.А. Сравнительная оценка антагонистической активности коллекционных лактобацилл в отношении полирезистентных Klebsiella pneumoniae // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 6. С. 120-127. DOI: https://doi. org/10.33029/0042-8833-2023-92-6-120-127
Статья поступила в редакцию 13.07.2023. Принята в печать 30.10.2023.
Funding. The study was not sponsored.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Сontribution. Research concept - Rozhkova I.V., Yurova E.A.; data collection - Terekhova R.P., Kishilova S.A.; data processing, text writing -
Kishilova S.A.; editing, approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors.
For citation: Kishilova S.A., Terekhova R.P., Rozhkova I.V., Yurova E.A. Comparative evaluation of the antagonistic activity of collection lactobacilli
against the multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (6): 120-7. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-
8833-2023-92-6-120-127 (in Russian)
Received 13.07.2023. Accepted 30.10.2023.
с пробиотическими свойствами. Наличие у них антагонистической активности является важным условием обеспечения биологической безопасности пищевых продуктов, создаваемых при использовании ферментации, и разработки эффективных мер борьбы с наиболее приоритетными по эпидемиологической значимости условно-патогенными и патогенными микроорганизмами. Цель работы - изучение антагонистической активности коллекционных пробиотических штаммов Lactobacillus по отношению к мультирезистентным Klebsiella рпеитотае для оценки их пригодности в производстве специализированных кисломолочных продуктов.
Материал и методы. Для определения антагонистической активности коллекционных штаммов Lactobacillus по отношению к штамму Klebsiella рпеитотае использовали 2 метода: совместного культивирования и диффузии в агар с использованием лунок.
Результаты. В результате проведенной оценки 2 штаммов молочнокислых бактерий - Lactobacillus helveticus NK1 и Lactobacillus (Lacticaseibacillus rham-nosus) rhamnosus F на наличие антагонистической активности по отношению к штамму Klebsiella pneumoniaе, полирезистентному к антибиотикам разных групп, была подтверждена высокая эффективность штамма L. rhamnosus F. Антагонистическая активность L. helveticus NK1 в отношении клебсиелл, выявленная в данном исследовании, была незначительной, что подтверждает важность поиска новых продуцентов, способных подавлять рост антибиоти-корезистентных энтеробактерий.
Заключение. Подтвержденная высокая антагонистическая активность штамма L. rhamnosus F позволяет рекомендовать его для включения в состав заквасок для производства специализированных кисломолочных продуктов для диетического (лечебного и профилактического) питания и использования в рационах людей с дисбиотическими нарушениями при инфекциях, связанных с оказанием медицинской помощи, в том числе обусловленными множественно резистентными штаммами Klebsiella pneumoniaе. Однако необходимы дальнейшие исследования по определению (выявлению) механизмов антимикробного действия штамма L. rhamnosus F.
Ключевые слова: антагонистическая активность; дисбиозы; Klebsiella pneumoniaе; лактобациллы
Taking into account the known data on the high prevalence of multi-drug-resistant Enterobacteriaceae, such as Klebsiella spp., enterohemorrhagic Escherichia coli, and their properties to maintain viability in fermented milk products when using technologies in which, along with starter microorganisms, some enterobacteria with increased resistance to environmental factors (primarily active acidity) can survive and even multiply, the search for new strains of lactic acid probiotic bacteria with a pronounced antimicrobial effect are currently one of the most relevant areas of research in food biotechnology. Representatives of the Lactobacillus genus are currently considered as the most promising objects for the search for producers with probiotic properties. Their antagonistic activity is an important condition for ensuring the biological safety of foods created using fermentation and for developing effective measures to combat conditionally pathogenic and patho -genic microorganisms of the highest priority in terms of epidemiological significance. The aim of the research was to study the antagonistic activity of collectible probiotic Lactobacillus strains in relation to multi-resistant Klebsiella pneumoniae, to assess their suitability in the production of specialized fermented milk products. Material and methods. To determine the antagonistic activity of Lactobacillus collection strains in relation to the Klebsiella pneumoniae strain, two methods were used: co-cultivation and diffusion into agar using wells.
Results. As a result of the study of 2 strains of lactic acid bacteria - Lactobacillus helveticus NK1 and Lactobacillus (Lacticaseibacillus rhamnosus) rhamnosus F as antagonists against Klebsiella pneimopiae hospital strain, characterized by multiresistance to antibiotics of different groups, the high efficacy of the L. rhamnosus F. strain was confirmed. Antagonistic activity of the L. helveticus NK1 strain was insignificant, which suggests the variability of Klebsiella and the importance of searching for an antagonist strain with the widest possible spectrum of action.
Conclusion. The confirmed high antagonistic activity of the L. rhamnosus F strain makes it possible to recommend it for inclusion in starter cultures. The prospects of using the L. rhamnosus F strain, including for the production of fermented milk products for therapeutic nutrition and other special dietary uses, and for use in the diets of people with dysbiotic disorders, patients with intestinal infections, in particular, caused by multi-resistant strains of Klebsiella pneumoniaе, related to nosocomial infections, are shown. However, further research is needed to determine (identify) the mechanisms of the antimicrobial action of L. rhamnosus F. strain.
Keywords: antagonistic activity; dysbiosis; Klebsiella pneumoniaе; Lactobacillus
Род Klebsiella относится к семейству Enterobacteria-ceae. Их отличительная особенность - наличие поли-сахаридной капсулы, покрывающей всю поверхность клетки, что дает дополнительную устойчивость к воздействиям внешней среды и помогает долго сохраняться как в окружающей среде, так и на различных предметах [1]. Представители рода встречаются повсеместно -в почве, воде, пищевых продуктах, в фекалиях человека, на коже и слизистых. Род Klebsiella насчитывает несколько видов, но наиболее эпидемически значимым является Klebsiella pneumoniae, которая может стать причиной многих заболеваний, в том числе острого и хронического простатита, пиелонефрита, цистита, пневмонии [2], раневых инфекций, заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Следствием широко распространенного в медицинской практике использования антибиотиков и биоцидных препаратов является формирование дисбиозов. В 2017 г. Всемирная организация здравоохранения обратила особое внимание на распространенность антибиотикорезистентных (АБР) K. pneumoniae, причислив их к числу наиболее опасных возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП) - ESCAPE-патогенов [1, 3], характеризующихся полирезистентностью к антибиотикам различных групп
[4]; высокой устойчивостью к дезинфицирующим средствам [2]; распространением в стационарах контактным (через медицинское оборудование и руки персонала)
[5] и воздушно-капельным путем. При исследовании пациентов с подтвержденным дисбиозом кишечника среди выделенных патогенных штаммов до 70% обладали множественной АБР, причем именно представители клебсиелл отличались большим генетическим разнообразием детерминант устойчивости по сравнению с другими энтеробактериями. Установлено, что при выраженных дисбактериозах кишечника клебсиеллы экспрессировали факторы вирулентности и обладали высокой устойчивостью к антибиотикам [6, 7]. Дисбиозы могут возникать в любом биотопе организма, однако в кишечнике возникают наиболее стойкие расстройства. Дисбиоз всегда имеет место при воспалительных заболеваниях кишечника [5]. В настоящее время медицинский персонал во всем мире отмечает рост именно воспалительных заболеваний кишечника, что связано с широким применением антибиотиков и биоцидных препаратов. Так, секвенирование кишечного метагенома пациентов после курсового приема ряда антибиотиков показало изменение его состава с персистированием АБР-штаммов. Затрудненная коррекция дисбиозов часто связана с формированием популяций энтеробак-терий, обладающих персистентным потенциалом, что способствует длительному выживанию возбудителя в организме [8].
Распространяясь как контактным, так и воздушно-капельным путем, полирезистентные клебсиеллы все чаще становятся причиной ИСМП [2, 7].
Известны различные механизмы, обеспечивающие устойчивость микроорганизмов к антимикробным агентам, такие как ферментативная инактивация, обра-
зование альтернативных метаболических путей, изменение проницаемости клеточной стенки и др. [3, 7]. Важным механизмом полирезистентности являются так называемые мембранные системы активного выброса (эффлюкса) из клетки токсичных для нее веществ [2]. И наконец, серьезную проблему представляет способность клинически значимых микроорганизмов образовывать биопленки [9, 10].
Проблема множественной устойчивости к антимикробным препаратом актуальна в пищевой отрасли. Широкое применение антибиотиков в сельском хозяйстве и ветеринарии привело к возрастанию селективного давления на микроорганизмы в пищевой цепи [11, 12]. В различных странах объемы антибиотиков, применяемых в сельском хозяйстве, многократно превышают объемы, используемые непосредственно в медицинской практике. Среди бактерий с высокой предрасположенностью к приобретению АБР доминируют представители Enterobacteriaceae и Enterococcus spp., они же являются основными контаминантами продовольственного сырья [11]. Возрастает роль продуцирующих токсины патогенных E. coli [13]. Исследование распространенности в пищевых продуктах полирезистентных микроорганизмов показало, что их доля варьирует от 10 до 50% [14]. Причем селекция устойчивости в пищевой цепи может инициироваться не только антибиотиками, но и другими биоцидными веществами [11]. Таким образом, в настоящее время пищевая цепь является значимым резервуаром накопления полирезистентных штаммов и может служить фактором их передачи человеку.
Представляется важным изучение пробиотических бактерий, исходя из их способности оказывать антимикробное действие на патогенные для человека микроорганизмы [15]. Сегодня экспертное сообщество повсеместно признает положительные эффекты пробиотиков при таких патологиях, как острые кишечные инфекции, некоторые заболевания ЖКТ, инфекционные заболевания, аллергия и др. [16]. Пробиотики способны модифицировать персистентные свойства микроорганизмов, расширяя круг препаратов для эффективной элиминации АБР-штаммов. Способность пробиотических микроорганизмов эффективно ингибировать энтеробактерии, несущие детерминанты множественной АБР, может быть полезна для разработки специализированных пищевых продуктов с целью коррекции дисбиотических состояний при колонизации кишечника АБР-бактериями.
Бактерии рода Lactobacillus способны ингибировать K. pneumoniae и других возбудителей [10], конкурируя за питательные вещества, образуя антимикробные агенты, такие как молочная, уксусная, пропионовая кислоты, перекиси, бактериоцины и др. Описано антимикробное действие 4 представителей молочнокислых бактерий (Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lacto-bacillus delbrueckii, Bifidobacterium longum), выделенных у здоровых людей, на антибиотикочувствительный коллекционный штамм K. pneumoniae АТСС 10031 [1].
Изучение потенциала пробиотических микроорганизмов в качестве новых антимикробных агентов
в отношении АБР-бактерий, контаминирующих пищевую продукцию, в том числе относящихся к возбудителям нозокомиальных инфекций, является на данный момент активно развивающейся областью исследований.
Цель данной работы - сравнительная оценка антагонистической активности коллекционных пробиотических штаммов Lactobacillus, предназначаемых для использования при изготовлении специализированных продуктов, способных ингибировать возбудителей ИСМП, в частности K. pneumoniae.
Материал и методы
Объектами исследования были Lactobacillus helve-ticus NK1 и Lacticaseibacillus rhamnosus F, выделенные из ЖКТ здоровых людей, находящиеся в коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института молочной промышленности (ФГАНУ «ВНИМИ»). Изолят K. pneumoniaе 10898, выделенный от пациента с ИСМП, был предоставлен ФГБУ «НМИЦ хирургии им. А.В. Вишневского» Минздрава России. Коллекционные штаммы лактобактерий хранили в лио-филизированном состоянии. Восстановление культур лактобацилл проводили в стерильном обезжиренном коммерческом молоке марки «Стандарт» (Комплимилк, Слуцкий сыродельный комбинат, Беларусь) с дальнейшим пересевом на MRS-бульон (ООО НПЦ «Био-компас-С», Россия) путем инкубации при температуре 37±1 °С в течение 24 ч. Для исследований использовали вторую генерацию культуры. Штамм K. pneumoniaе культивировали на питательном агаре (ПА) (ООО НПЦ «Био-компас-С», Россия). Для исследования использовали 24-часовую культуру с дальнейшим культивированием на MRS-бульоне.
Антибиотикорезистентность штамма K. pneumoniaе 10898 определяли с помощью автоматического микробиологического анализатора Vitek-2compact (bioMer-ieux, Франция) согласно МР 02.032-08 «Идентификация микроорганизмов и определение их чувствительности к антибиотикам с применением автоматического микробиологического анализатора VITEK 2 Compact». Для определения способности пробиотических штаммов L. helveticus NK1 и L. rhamnosus F подавлять рост полирезистентного штамма K. pneumoniaе 10898 использовали 2 метода - совместного культивирования и диффузии в агар, по МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». При совместном культивировании в 20 см3 МRS-бульона вносили по 1 см3 инокулятов лактобацилл и K. pneumoniaе и инкубировали в течение 24 и 48 ч при температуре 37±1 °С. Контролем была монокультура K. pneumoniaе, выращенная в тех же условиях. По окончании инкубирования проводили подсчет клеток K. pneumoniaе, выросших в монокультуре и при совместном культивировании с лактобациллами на ПА.
Для исследования антагонистической активности Lac-tobacillus методом диффузии в агар штаммы инкубиро-
Таблица 1. Антибиотикограмма Klebsiella pneumomaе 10898 Table 1. Antibiogram of Klebsiella pneumoniaе 10898
Антибиотик / Antibiotic Чувствительность* / Sensitivity*
Аминогликозиды / Aminoglycosides
Амикацин / Amikacin S
Нетилмицин / Netilmicin R
Ципрофлоксацин / Ciprofloxacin R
Цефалоспорины / Cephalosporins
Цефтазидим / Ceftazidime R
Цефаперазон/сульбактам Cefoperazone/sulbactam R
Имипенем / Imipenem R
Меропенем / Meropenem R
Пиперациллин/тазобактам Piperacillin/tazobactam R
Тигециклин / Tigecycline S
Колистин / Colistin S
П р и м е ч а н и е. * - R - устойчив; S - чувствителен (МР 02.032-08). N o t e. * - R - stable; S - sensitive (Methodical recommendations 02.032-08).
вали в течение 24 и 48 ч на стерильном обезжиренном молоке и MRS-бульоне при температуре 37±1 °С. В чашки Петри вносили ПА, содержащий K. pneumoniaе 10898 в концентрации 106 КОЕ/см3. После застывания агара подготавливали лунки диаметром 5 мм стерильным инструментом, в которые вносили по 50 мкм3 исследуемых образцов. Результаты учитывали через 24 и 48 ч инкубирования при 37±1 °С.
Все результаты представлены по данным 3 независимых экспериментов. Построение таблиц и графиков проводили с использованием программ Microsoft Office. Результаты исследования обработаны с применением программы SciDaVis.
Результаты и обсуждение
Характеристика штамма K. pneumoniaе 10898 по устойчивости к антибиотикам представлена в табл. 1.
Из данных табл. 1 видно, что изолят K. pneumoniaе 10898 устойчив к антибиотикам различных групп: фтор-хинолонов, цефалоспоринов, карбапенемов. Кроме того, наблюдалась устойчивость к пиперациллин/ тазобактаму (тазоцину), который является комбинированным антибиотиком класса уреидопенициллинов и ингибитора ß-лактамаз. Устойчивость клебсиелл к ß-лактамным антибиотикам связана с наличием у них гидролитических ферментов ß-лактамаз, включая ß-лактамазы с карбапенем-гидролазной активностью, гидролизующих карбапенемы, пенициллины и цефалоспорины [17, 18]. В то же время изолят сохранял чувствительность к антибиотикам групп полимиксинов (колистину) и глицилциклинов (тигециклину). К антибиотикам группы аминогликозидов проявлялась частичная устойчивость. Так, амикацин, механизм действия которого связан с нарушением синтеза белка на рибосомах бактериальной клетки и разрушением ее оболочки [17],
10
Продолжительность, ч / Duration, h
Монокультура Klebsiella / Klebsiella monoculture
Сокультивирование с L. helveticus NK1 Co-culture with L. helveticus NK1
Сокультивирование с L. rhamnosus F Co-culture with L. rhamnosus F
Динамика количества клеток Klebsiella pneumoniae 10898 в монокультуре и при сокультивировании с Lactobacillus
Dynamics in the number of Klebsiella pneumoniae 10898 cells in monoculture and when cocultivated with Lactobacillus
демонстрировал эффективность в отношении изолята. Этот антибиотик характеризуется высокой устойчивостью к ферментам бактерий. В то же время к антибиотику той же группы нетилмицину, действие которого основано на нарушении проницаемости цитоплазмати-ческой мембраны, штамм был резистентен.
Данные по антагонистической активности штаммов L. helveticus ЫК1 и L. rhamnosus Р по отношению к изо-ляту K. pneumoniaе 10898 при совместном культивировании представлены на рисунке, результаты статистической обработки экспериментальных данных - в табл. 2.
Полученные данные были статистически значимыми (р<0,05). Отклонения от среднего значения варьировали от 0,05 до 0,1. Значимость расхождения выборок оценивали по критерию Манна-Уитни, полученные результаты лежат в пределах среднего отклонения.
Анализ полученных данных показал, что динамика роста K. pneumoniae через 24 ч сокультивирования с L. helveticus NK1 практически не отличалась от динамики роста монокультуры: количество клеток составило 4,3x10® и 4,8x10® KOE/см3 соответственно. Незначительное подавляющее действие - до 2,9x107 KOE/см3 наблюдалось на вторые сутки сокультивирования. Что касается штамма L. rhamnosus F, то его антагонистическое действие на K. pneumoniae определялось уже через 24 ч - количество клеток патогена снижалось до 5,5x106 KOE/см3 и до 3,0x104 KOE/см3 через 48 ч совместного инкубирования.
Исследования антагонистической активности L. helveticus NK1, L. rhamnosus F, проведенные ранее Т.В. Федоровой и соавт. [18, 19] в отношении 5 штаммов Klebsiella с множественной антибиотикоустойчиво-стью, продемонстрировали не только вариабельность штаммов в способности подавлять рост патогенов, но и их избирательность в отношении разных изолятов K. pneumoniae. В нашем исследовании L. helveticus NK1 не проявил значительного антагонистического эффекта в отношении изолята K. pneumoniae, а антагонистическая эффективность L. rhamnosus F подтвердилась, что дает возможность рассматривать его с точки зрения перспективности для дальнейших исследований в качестве штамма-антагониста широкого спектра действия по отношению к патогенным микроорганизмам, циркулирующим в различных стационарах.
В исследовании М.А. Сухиной и соавт. [20] отмечалась способность лактобацилл проявлять избирательную активность в отношении различных видов патогенных бактерий. При исследовании антимикробного действия 21 штамма Lactobacillus, выделенных из толстокишечного биотопа пациентов, в отношении 31 клинического штамма Clostridium difficile продемонстрирована их избирательная активность.
Для подтверждения результатов, полученных при сокультивировании, антагонистическую активность штаммов коллекционных лактобацилл исследовали методом диффузии в агар (посев в лунки). Для оценки возможного влияния среды культивирования лактоба-цилл на их антагонистическую активность использовали MRS-бульон и стерильное обезжиренное молоко.
В табл. 3 показано антагонистическое влияние штаммов L. helveticus NK1 и L. rhamnosus F на рост K. pneumoniае 10898 при посеве в лунки бульонных культур, полученных при инкубации в MRS-бульоне и в стерильном обезжиренном молоке.
Таблица 2. Статистические значения экспериментальных данных Table 2. Statistical values of experimental data
Показатель, lg (КОЕ/см3) Index, lg (CFU/cm3) Продолжительность инкубации, ч / Duration of Incubation, h
K. pneumoniae K. pneumoniae + L. helveticus NK1 K. pneumoniae + L. rhamnosus F
24 48 24 48 24 48
Среднее значение, Х сред / Average value, Xavg 8,675 8,679 8,648 7,463 6,733 4,486
Среднее отклонение, а сред / Average deviation, a avg 0,049 0,105 0,051 0,071 0,079 0,079
Медиана по U-тесту Манна-Уитни Median by Mann-Whitney U-test 8,699 8,653 8,643 7,462 6,763 4,518
Таблица 3. Диаметр зон ингибирования роста Klebsiella pneumoniае 10898 в зависимости от питательной среды культивирования штаммов Lactobacillus, мм (M±m)
Table 3. Diameter of growth inhibition zones of Klebsiella pneumoniae 10898 depending on the culture medium of Lactobacillus strains, mm (M±m)
Исследуемая культура Culture under study Питательная среда / Culture medium
MRS-бульон / MRS broth стерильное обезжиренное молоко / Sterile skim milk
L. helveticus NK1 7±1 9±1
L. rhamnosus F 13±1 10±1
Из табл. 3 видно, что после инкубации в MRS-бульоне зоны ингибирования K. pneumoniae штаммом L. rham-nosus F почти в 2 раза превышали зоны ингибирования L. helveticus NK1, что подтверждает результаты, полученные методом сокультивирования. Результаты, полученные при инкубации в молоке, показали практически полное отсутствие различий между размерами зон подавления роста K. pneumonia штаммами лактобацилл. Известно, что в результате действия протеаз молочнокислых бактерий на белки, основным из которых является казеин, образуются более короткие единицы - пептиды и аминокислоты. Есть данные об антимикробной активности пептидов, образующихся в результате действия протеолитических ферментов молочнокислых бактерий [21]. Возможно, антимикробное действие L. helveticus NK1 на патогенный штамм при инкубации в молоке связано с его способностью к образованию пептидов с антимикробными свойствами.
В исследовании T. Onbas и соавт. [22] влияния супер-натанта пробиотического штамма Lactobacillus plan-tarum F 10, выделенного из микробиоты кишечника здоровых младенцев, на штаммы Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus из труднозаживающих ран, было продемонстрировано угнетение роста обоих госпитальных штаммов. У L. plantarum F10 была подтверждена антимикробная и антибиопленочная активность.
Далее в ходе исследования была определена антагонистическая активность супернатантов L. helveticus NK1 и L. rhamnosus F. В табл. 4 показано антагонистическое влияние штаммов L. helveticus NK1 и L. rhamnosus F на рост K. pneumoniае 10898 при посеве в лунки супер-натантов культур, полученных при инкубации в MRS-бульоне и стерильном обезжиренном молоке.
Антагонистическая активность бульонной культуры и супернатантов обоих штаммов практически не различалась. Сохранение значительного антагонистического влияния на клебсиеллу как живой культуры, так и супернатанта L. rhamnosus F подтверждает его эффек-
тивность в качестве антимикробного агента. Однако механизмы, дающие возможность этому штамму инги-бировать широкий спектр патогенов, предстоит дополнительно исследовать.
Следует отметить, что антимикробная активность, особенно по отношению к патогенам, вызывающим нарушения кишечного микробиома, токсикоинфекции и отравления, является одним из наиболее важных свойств штаммов для производства кисломолочных пробиотических продуктов и биологически активных добавок к пище на основе пробиотиков. Особое значение среди молочнокислых организмов принадлежит лактобациллам: представители L. rhamnosus, L. casei, L. acidophilus используются не только для производства кисломолочных продуктов, но входят в состав лекарственных препаратов, предназначенных в том числе для лечения дисбиозов кишечника [23]. Пробиотические препараты с использованием штаммов L. rhamnosus демонстрировали свою эффективность при лечении и профилактике антибиотикоассоциированной диареи, урогенитальных, респираторных инфекций [24].
Исследования штаммов лактобацилл, в том числе L. rhamnosus F, из коллекции пробиотических и молочнокислых микроорганизмов Центральной лаборатории микробиологии ФГАНУ ВНИМИ проводятся сотрудниками института в течение ряда лет. Подтверждены их антимикробные свойства в отношении условно-патогенных представителей энтеробактерий, в том числе поддерживающих дисбиоз кишечника [25]. С использованием в составе закваски штамма L. rham-nosus F был разработан кисломолочный продукт на основе кобыльего молока, обладающий антимикробной активностью [26]. Выраженные антимикробные свойства штамма L. rhamnosus F по отношению к штамму K. pneu-moniae 10898 подтверждают его перспективность в том числе и для разработки специализированных пищевых продуктов для диетического (лечебного) питания и биологически активных добавок к пище для комплексной
Таблица 4. Диаметр зон ингибирования роста Klebsiella pneumoniae 10898 супернатантами штаммов Lactobacillus в зависимости от питательной среды культивирования, мм (M±m)
Table 4. Diameter of growth inhibition zones of Klebsiella pneumoniae 10898 with supernatants of Lactobacillus strains depending on the culture medium, mm (M±m)
Исследуемый супернатант Supernatant Питательная среда / Culture medium
MRS-бульон / MRS broth стерильное обезжиренное молоко / Sterile skim milk
L. helveticus NK1 6±1 8±1
L. rhamnosus F 11±1 10±1
коррекции тяжелых дисбиотических состояний, связанных с энтеробактериями, обладающими устойчивостью к широкому спектру биоцидных препаратов, а также создания диетических кисломолочных продуктов, предназначенных для лиц с ИСМП, с включением в состав заквасочной микрофлоры антагонистически активных лактобактерий с направленным антагонизмом.
Заключение
Таким образом, определена значительная антагонистическая активность коллекционного штамма L. rham-nosus Р по отношению к изоляту K. pneumoniае 10898,
Сведения об авторах
что подтверждает его перспективность для дальнейших разработок биологически активных добавок к пище, а также специализированной продукции для диетического (лечебного или профилактического) питания, предназначенных для коррекции дисбиотических состояний, вызванных антибиотикоустойчивыми энтеробакте-риями, и для применения в комплексной терапии внутри-больничных инфекций, обусловленных K. pneumoniае. Возможно, комбинация пробиотиков с их биологически активными метаболитами была бы актуальна для создания субстанций с высокой антимикробной эффективностью. Однако необходимы дальнейшие исследования по определению (выявлению) механизмов антимикробного действия этой культуры.
Кишилова Светлана Анатольевна (Svetlana A. Kishilova) - младший научный сотрудник Центральной лаборатории микробиологии ФГАНУ «ВНИМИ» (Москва, Российская Федерация) E-mail: s_kishilova@vnimi.org https://orcid.org/0009-0000-9498-4757
Терехова Раиса Петровна (Raisa P. Terekhova) - заведующий лабораторией профилактики и лечения бактериальных инфекций ФГБУ «НМИЦ хирургии им. А.В. Вишневского» Минздрава России (Москва, Российская Федерация) E-mail: terekhova@ixv.ru https://orcid.org/0000-0002-4622-1429
Рожкова Ирина Владимировна (Irina V. Rozhkova) - кандидат технических наук, старший научный сотрудник, заведующий Центральной лабораторией микробиологии ФГАНУ «ВНИМИ» (Москва, Российская Федерация) E-mail: i_rozhkova@vnimi.org_ https://orcid.org/0000-0003-4441-4515
Юрова Елена Анатольевна (Elena A. Yurova) - кандидат технических наук, старший научный сотрудник, заведующий лабораторией технохимического контроля ФГАНУ «ВНИМИ» (Москва, Российская Федерация) E-mail: e_yurova@vnimi.org https://orcid.org/0000-0003-3369-5673
Литература
Mogna L., Deidda F., Nicola S., Amoruso A., Del Piano M., Mogna G. 9. In vitro inhibition of Klebsiella pneumoniae by Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii LDD01 (DSM 22106): an innovative strategy to possibly counteract such infections in humans? // J. Clin. Gastroenterol. 2016. Vol. 50, suppl. 2. P. S136—S139. DOI: https://doi.org/10.1097/ 10. MCG.0000000000000680
Шагинян И.А., Чернуха М.Ю. Неферментирующие грамотри-цательные бактерии в этиологии внутрибольничных инфекций: 11. клинические, микробиологические и эпидемиологические особенности // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2005. Т. 7, № 3. С. 271-285.
Damian M., Usein C.R., Palade A.M., Ceciu S., Cosman M. Molecular epidemiology and virulence characteristics of Klebsiella pneumoniae strains isolated from hospital-associated infections // Open Epidemiol. J. 2009. Vol. 2. Р. 69-78. DOI: https://doi.org/10.2174/1874297100902010069 Габриэлян Н.И., Горская Е.М., Романова Н.И., Цирульникова О.М. Госпитальная микрофлора и биопленки // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2014. Т. 14, № 3. С. 83-91. DOI: https://doi.org/10.15825/1995-1191-2012-3-83-91 Корниенко Е.А. Микробиота кишечника пробиотической терапии при воспалительных кишечника // Фарматека. 2015. № 2 (295). С. 39-43. Устюжанин А.В., Чистякова Г.Н., Ремизова И.И., Генетические детерминанты антибиотикорезистентности энтеро-бактерий, выделенных в ходе микробиологического мониторинга 15. в перинатальном центре // Эпидемиология и вакцинопрофилак-тика. 2023. Т. 22, № 4. С. 49-55. DOI: https://doi.org/10.31631/2073-3046-2023-22-4-49-55 16.
Masuda N., Sakagawa E., Ohya S. Outer membrane proteins responsible for multiple drug resistance in Pseudomonas aeruginosa // Antimicrob. Agents Chemother. 1995. Vol. 39, № 3. Р. 645-649. DOI: https://doi. 17. org/10.1128/AAC. 39.3.645
Бухарин О.В., Валышев А.В., Черкасов С.В. Персистентный потенциал условно-патогенных микроорганизмов // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2005. № 4. С. 43-48.
возможности заболеваниях
Маханек А.А.
12.
13.
14.
Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Бактериальные биопленки как ест ест вен ная форма су ществовани я бак т ерий в ок ру жающей среде и организме хозяина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011. № 3. С. 99-109.
Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms // Clin. Microbiol. Rev. 2002. Vol. 15, N 2. Р. 167-193. DOI: https://doi.org/10.1128/cmr.15.2.167-193.20 Шевелева С.А. Антибиотикоустойчивые микроорганизмы в пище как гигиеническая проблема (обзорная статья) // Гигиена и санитария. 2018. Т. 97, № 4. С. 342-354. DOI: https://doi.org/10.18821/0016-9900-2018-97-4-342-354
Тутельян А.В., Юшина Ю.К., Соколова О.В., Батаев Д.С., Фе-сюн А.Д., Датий А.В. Образование биологических пленок микроорганизмов на пищевых производствах // Вопросы питания. 2019. Т. 88, № 3. С. 32-43. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-209-10027 Farrokh C., Jordan K., Auvra F., Glass K., Oppegaard H., Raynaud S. et al. Review of Shiga-toxin-producing Escherichia coli (STEC) and their significance in dairy production // Int. J. Food Microbiol. 2013. Vol. 162, № 2. Р. 190-212. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijfood-micro.2012.08.008
Короткевич Ю.В. Анализ резистентности к антибиотикам энтеробак-терийи энтерококков, выделяемыхизпищевыхпродуктов//Вопросы питания. 2016. Vol. 85, № 2. Р. 5-13. DOI: https://doi.org/10.24411/ 0042-8833-2016-00018
Рожкова И.В., Бегунова А.В. Пробиотические микроорганизмы как фактор повышения здоровья // Молочная промышленность. 2020. № 7. С. 38-39. DOI: https://doi.org/10.31515/1019-8946-2020-06-38-39 Шевелева С.А. Медико-биологические требования к пробиоти-ческим продуктам и биологически активным добавкам к пище // Инфекционные болезни. 2004. Т. 2, № 3. С. 86-90. Рожкова И.В., Бегунова А.В., Васина Д.В., Кубанова М.Х., Крупенио Т.В., Шарапченко С.О., Габриэлян Н.И. Антагонистическая активность Lactobacillus spp. в отношении госпитальных штаммов Klebsiella spp. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2018. Т. 20, № S1. С. 180.
2.
4
5
6
7
8
18. Федорова Т.В., Васина Д.В., Бегунова А.В., Рожкова И.В., 22. Раскошная Т.А., Габриэлян Н.И. Антагонистическая активность молочнокислых бактерий Lactobacillus spp. в отношении клинических изолятов Klebsiella pneumoniae // Прикладная биохимия
и микробиология. 2018. Т. 54, № 3. С. 264-276. DOI: https://doi. 23. org/10.7868/S0555109918030054
19. Savinova O.S., Glazunova O.A., Moiseenko K.V., Begunova A.V., Rozh-kova I.V., Fedorova T.V. Exoproteome analysis of antagonistic interactions between the probiotic bacteria Limosilactobacillus reuteri LR1 and Lacticaseibacillus rhamnosus F and multidrug resistant strain of Klebsi-
ella pneumonia // Int. J. Mol. Sci. 2021. Vol. 22, N 20. Article ID 10999. 24. DOI: https://doi.org/10.3390/yms222010999
20. Сухина М.А., Шелыгин Ю.А., Жуховицкий В.Г., Фролов С.А., Кашников В.Н., Веселов А.В. и др. Перспективы использования антагонистической активности лактобацилл для подавления 25. роста Clostridium (Clostridioides) difficile // Экспериментальная
и клиническая гастроэнтерология. 2018. Т. 160, № 12. С. 19-24. DOI: https://doi.org/10.31146/1682-8658-ecg-160-12-19-24
21. Самохина Л.С., Головин М.А., Комолова Г.С., Ганина В.И., Ионова 26. И.И., Шаталова Е.С. Антибактериальная активность лактофер-рина из коровьего молока // Молочная промышленность. 2012. №
7. С. 56-57.
Onbas T., Osmanagaoglu O., Kiran F. Potential properties of Lactobacillus plantarum F-10 asabio-control strategy for wound infections // Probiotics Antimicrob. Proteins. 2019. Vol. 11. Р. 1110-1123. DOI: https://doi.org/10.1007/s12602-018-9486-8
Ардатская М.Д., Бельмер С.В., Добрица В.П., Захаренко С.М., Лазебник Л.Б., Минушкин О.Н., Орешко Л.С. и др. Дисбиоз (дисбактериоз) кишечника: современное состояние проблемы, комплексная диагностика и лечебная коррекция // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2015. Т. 117, № 5. С. 13-50.
Трухан Д.И. Нарушения кишечного микробиоценоза: расширение сферы применения пробиотиков // Медицинский совет. 2022. Т. 16, № 7. С. 132-143. DOI: https://doi.org/10.21518/2079-701Х-2022-16-7-132-143
Бегунова А.В., Рожкова И.В., Ширшова Т.И., Крысанова Ю.И. Антимикробные свойства Lactobacillus в кисломолочных продуктах // Молочная промышленность. 2020. № 6. С. 22-23. DOI: https://doi.org/10.31515/1019-8946-2020-06-22-23 Симоненко Е.С., Бегунова А.В. Разработка кисломолочного продукта на основе кобыльего молока и ассоциации молочнокислых микроорганизмов // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 5. С. 115-125. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-5-115-125
References
1. Mogna L., Deidda F., Nicola S., Amoruso A., Del Piano M., Mogna G. 15. In vitro inhibition of Klebsiella pneumoniae by Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii LDD01 (DSM 22106): an innovative strategy to possibly counteract such infections in humans? J Clin Gastroenterol. 2016; 50 (suppl 2): S136—9. DOI: https://doi.org/10.1097/MCG.0000000000000680 16.
2. Schagenyan I.A., Chernukha M.Yu. Infections caused by nonfermenting gram-negative rods: epidemiological, microbiological and clinical features. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya [Clinical 17. Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy]. 2005; 7 (3): 271—85.
(in Russian)
3. Damian M., Usein C.R., Palade A.M., Ceciu S., Cosman M. Molecular epidemiology and virulence characteristics of Klebsiella pneumoniae strains isolated from hospital-associated infections. Open Epidemiol
J. 2009; 2: 69-78. DOI: https://doi.org/10.2174/1874297100902010069 18.
4. Gabrielyan N.I., Gorskaya E.M., Romanova N.I., Tsirul'nikova O.M. Nosocomial infection and microbial biofilms in surgery. Vestnik transplan-tologii i iskusstvennykh organov [Bulletin of Transplantology and Artificial Organs]. 2012; 14 (3): 83-91. DOI: https://doi.org/10.15825/1995-1191-2012-3-83-91 (in Russian)
5. Kornienko E.A. Gut microbiota and probiotic therapy possibilities in 19. inflammatory bowel diseases. Farmateka [Pharmateca]. 2015; 2 (295): 39-43. (in Russian)
6. Ustyuzhanin A.V., Chistyakova G.N., Remizova I.I., Makhanek A.A. Genetic determinants of antibiotic resistance of enterobacteria isolated during microbiological monitoring in the perinatal center. Epidemiologiya
i vaktsinoprofilaktika [Epidemiology and Vaccine Prophylaxis]. 2023; 22 20. (4): 49-55. DOI: https://doi.org/10.31631/2073-3046-2023-22-4-49-55 (in Russian)
7. Masuda N., Sakagawa E., Ohya S. Outer membrane proteins responsible for multiple drug resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 1995; 39 (3): 645-9. DOI: https://doi.org/10.1128/ AAC.39.3.645 21.
8. Bukharin O.V., Valyshev A.V., Cherkasov S.V. Persistent potential of conditionally pathogenic microorganisms. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika [Epidemiology and Vaccine Prophylaxis]. 2005; (4): 43-8. (in Russian)
9. Romanova Yu.M., Gintsburg A.L. Bacterial biofilms as a natural form 22. of existence of bacteria in the environment and host organism. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2011; (3): 99-109. (in Russian)
10. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms of clini- 23. cally relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 2002; 15 (2): 167-93. DOI: https://doi.org/10.1128/cmr.15.2.167-193.20
11. Sheveleva S.A. Antimicrobial-resistant microorganisms in food as a hygienic problem. Gigiena i sanitariya [Hygiene and Sanitation]. 2018; 97 (4): 342-54. DOI: https://doi.org/10.18821/0016-9900-2018-97-4-342-354
(in Russian) 24.
12. Tutel'yan A.V., Yushina Yu.K., Sokolova O.V., Bataev D.S., Fesyun A.D., Datiy A.V. Formation of biological films of microorganisms in food productions. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2019; 88 (3): 32-43. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-209-10027 (in Russian) 25.
13. Farrokh C., Jordan K., Auvra F., Glass K., Oppegaard H., Raynaud S., et al. Review of Shiga-toxin-producing Escherichia coli (STEC) and their significance in dairy production. Int J Food Microbiol. 2013; 162 (2): 190-212. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2012.08.008 26.
14. Korotkevich Yu.V. Antibiotic resistance analysis of Enterococcus spp. and Enterobacteriaceae spp. isolated from food. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; 85 (2): 5-13. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2016-00018 (in Russian)
Rozhkova I.V., Begunova A.V. Probiotic microorganisms as a factor in improving health. Molochnaya promyshlennost' [Dairy Industry]. 2020; (7): 38-9. DOI: https://doi.org/10.31515/1019-8946-2020-06-38-39 (in Russian)
Sheveleva S.A. Medico-biological requirements to probiotic products and biologically active food supplements. Infektsionnye bolezni [Infectious Diseases]. 2004; 2 (3): 86-90. (in Russian)
Rozhkova I.V., Begunova A.V., Vasina D.V., Kubanova M.Kh., Krupe-nio T.V., Sharapchenko S.O., Gabrielyan N.I. Antagonistic activity of Lactobacillus spp. against hospital strains of Klebsiella spp. Vestnik transplantologii i iskusstvennykh organov [Bulletin of Transplantology and Artificial Organs]. 2018; 20 (S1): 180. DOI: https://doi.org/10.7868/ S05551099118030054 (in Russian)
Fedorova T.V., Vasina D.V., Begunova A.V., Rozhkova I.V., Raskosh-naya T.A., Gabrielyan N.I. Antagonistic activity of lactic acid bacteria Lactobacillus spp. in relation to clinical isolates of Klebsiella pneu-moniae. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya [Applied Biochemistry and Microbiology]. 2018; 54 (3): 264-76. DOI: https://doi.org/10.7868/ S0555109918030054 (in Russian)
Savinova O.S., Glazunova O.A., Moiseenko K.V., Begunova A.V., Rozh-kova I.V., Fedorova T.V. Exoproteome analysis of antagonistic interactions between the probiotic bacteria Limosilactobacillus reuteri LR1 and Lacti-caseibacillus rhamnosus F and multidrug resistant strain of Klebsiella pneumonia. Int J Mol Sci. 2021; 22 (20): 10999. DOI: https://doi.org/10.3390/ ims222010999
Sukhina M.A., Shelygin Yu.A., Zhukhovitsky V.G., Frolov S.A., Kash-nikov V.N., Veselov A.V., et al. Prospects of using antagonistic activity of lactobacilli to suppress the growth of Clostridium (Clostridioides) difficile. Eksperimental'naya i klinicheskaya gastoenterologiya [Experimental and Clinical Gastroenterology]. 2018; 160 (12): 19-24. DOI: https://doi. org/10.31146/1682-8658-ecg-160-12-19-24 (in Russian) Samokhina L.S., Golovin M.A., Komolova G.S., Ganina V.I., Iono-va I.I., Shatalova E.S. Antibacterial activity of lactoferrin from cow's milk. Molochnaya promyshlennost' [Dairy Industry]. 2012; (7): 56-7. (in Russian)
Onbas T., Osmanagaoglu O., Kiran F. Potential properties of Lactobacillus plantarum F-10 asabio-control strategy for wound infections. Probiotics Antimicrob Proteins. 2019; 11: 1110-23. DOI: https://doi.org/10.1007/ s12602-018-9486-8
Ardatskaya M.D., Bel'mer S.V., Dobritsa V.P., Zakharenko S.M., Laze-bnik L.B., Minushkin O.N., Oreshko L.S., et al. Colon dysbacteri-osis (dysbiosis): modern state of the problem, comprehensive diagnosis and treatment correction. Experimental and clinical gastroenterology. Eksperimental'naya i klinicheskaya gastoenterologiya [Experimental and Clinical Gastroenterology]. 2015; 117 (5): 13-50. (in Russian) Trukhan D.I. Disorders of intestinal microbiocenosis: expanding the application of probiotics. Meditsinskiy sovet [Medical Council]. 2022; 16 (7): 132-43. DOI: https://doi.org/10.21518/2079-701X-2022-16-7-132-143 (in Russian)
Begunova A.V., Rozhkova I.V., Shirshova T.I., Krysanova Yu.I. Antimicrobial properties of Lactobacillus in fermented milk products. Molochnaya promyshlennost' [Dairy Industry]. 2020; (6): 22-3. DOI: https://doi. org/10.31515/1019-8946-2020-06-22-23 (in Russian) Simonenko E.S., Begunova A.V. Development of fermented milk product based on mare milk and lactic microorganisms association. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2021; 90 (5): 115-25. DOI: https://doi. org/10.33029/0042-8833-2021-90-5-115-125 (in Russian)
