CC BY
36
ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНОВ БАКТЕРИОЦИНОВ У ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS Д № 75 И LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS Д № 76
Торопов В. А.1, Шалаева О. Н.1, Рощина Е. К.1, Вахитов Т. Я.1, Ситкин С. И.1-2
1 Гос. НИИ ОЧБ ФМБА России
2 СЗГМУ им. И.И. Мечникова
Вахитов Тимур Яшэрович
Vakhitov Timur Yasherovich [email protected]
Торопов Вячеслав Антонович — научный сотрудник лаборатории микробиологии Шалаева Ольга Николаевна — научный сотрудник лаборатории микробиологии
Рощина Евгения Константиновна — научный сотрудник лаборатории микробиологии Вахитов Тимур Яшэрович — доктор биол. наук, начальник лаборатории микробиологии
Ситкин Станислав Игоревич — Dr. med., канд. мед. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории микробиологии; доцент
Toropov Vyacheslav Antonovich — Researcher, Laboratory of Microbiology
Shalaeva Olga Nikolaevna — Researcher, Laboratory of Microbiology
Roshchina Evgeniya Konstantinovna — Researcher, Laboratory of Microbiology
Vakhitov Timur Yasherovich — ScD in Biology, Head of the Laboratory of Microbiology
Sitkin Stanislav Igorevich — Dr. med., PhD, Leading Researcher, Laboratory of Microbiology; Associate Professor
Цель исследования: поиск генов бактериоцинов у пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus Д № 75 и Lactobacillus acidophilus Д № 76, входящих в состав БАД «Витафлор».
Материалы и методы: Антагонистическую активность штаммов L. acidophilus Д № 75 и Д № 76 оценивали методом отсроченного антагонизма. Идентификацию генов бактериоцинов проводили методом ПЦР с использованием прай-меров, специфичных для генов бактериоцина гельветицина J. Амплифицированные фрагменты секвенировали при помощи секвенатора ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer и анализировали с применением базы данных NCBI/BLASTX.
Результаты: Исследуемые бактерии проявляют выраженную антагонистическую активность (АА) против Escherichia coli 075 и Salmonella Enteritidis 209. АА пробиотических штаммов возрастала в 2-2,5 раза в присутствии метабиотика БАД «Актофлор-С», что указывает на ее индуцибельную природу. В ДНК обоих штаммов были выявлены идентичные последовательности размером 537 пар оснований (п.о.), гомологичных фрагменту гена гельветицина штамма L. helveticus DPC4571 (ген lhv_1632). Секвенирование этих фрагментов показало, что они отличаются от референсной ДНК штамма DPC4571 тремя нуклеотидами (А вместо Г в позиции 46, Ц вместо Т в позиции 249 и А вместо Т в позиции 537), причем все эти замены не приводят к изменениям соответствующей аминокислотной последовательности бактериоцина. Кроме фрагмента 537 п.о. у штамма L. acidophilus Д № 76 был выявлен другой фрагмент гена бактериоцина величиной 283 п.о., имевший 95% гомологии с геном гельветицина J штамма L. helveticusR0052 (ген R0052_09025). В базе данных NCBI/BLASTX еще у 11 микроорганизмов, относящихся к L. acidophilus, L. amylovorus, L. crispatus, L. gallinarum, L. helveticus и L. kitasatonis, были обнаружены последовательности, гомологичные гену гельветицина штамма L. helveticus DPC4571.
Заключение: Полученные данные свидетельствуют о существовании, по крайней мере, двух бактериоцинов у L. acidophilus Д № 76 и одного — у L. acidophilus Д № 75. Однако истинный потенциал бактериоцинов этих пробиотических штаммов для здоровья человека еще только предстоит раскрыть.
Ключевые слова: Актофлор-С, антагонистическая активность, Витафлор, гельветицин, гены бактериоцинов, лакто-бациллы, пробиотики, секвенирование.
Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2016; 134 (10): 58-65
Резюме
Summary
Aim: to detect the bacteriocin genes of probiotic strains Lactobacillus acidophilus D-75 and Lactobacillus acidophilus D-76 (components of Vitaflor dietary supplement).
Materials and Methods: The antagonistic activity of L. acidophilus D-75 and L. acidophilus D-76 strains was estimated by the deferred antagonism method. The identification of bacteriocin genes was performed by PCR using helveticin J gene primers. Amplified fragments were sequenced using ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer and were analyzed using NCBI/BLASTX.
Results: The test bacteria exhibit pronounced antagonistic activity (AA) against Escherichia coli O75 and Salmonella Enteritidis 209. In the presence of Actoflor-S (metabiotic dietary supplement) the antagonistic activity of tested probiotic strains was 2-2.5-fold increased indicating its inducible nature. The identical sequences of 537 bp homologous to gene fragment of helveticin of L. helveticus DPC4571 (lhv_1632 gene) were detected in DNA of both strains. Sequencing of these fragments showed difference in three nucleotides compared to the reference DNA of DPC4571 strain (A instead of G at position 46, C instead of T at position 249 and A instead of T at position 537), but all these replacements do not lead to changes in the amino acid sequence of a bacteriocin. For L. acidophilus D-76 another bacteriocin gene fragment of 283 bp was identified (in addition to 537 bp fragment). The latter had 95% homology with the helveticin J gene of L. helveticus R0052 (R0052_09025 gene). In NCBI/BLASTX database the sequences homologous to the helveticin gene of L. helveticus DPC4571 were found in 11 microorganisms related to L. acidophilus, L. amylovorus, L. crispatus, L. gallinarum, L. helveticus and L. kitasatonis.
Conclusion: Thus, our study shows that there are at least two bacteriocins in L. acidophilus D-76 and one bacteriocin in L. acidophilus D-75. However, the true potential of these probiotic bacteriocins for human health has yet to be realized.
Keywords: Actoflor-S, antagonistic activity, bacteriocin gene, helveticin, Lactobacillus, probiotics, sequencing, Vitaflor. Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2016; 134 (10): 58-65
Введение
Бактерии вида Lactobacillus acidophilus (Bacillus acidophilus) впервые были выделены из желудочно-кишечного тракта человека в 1900 году австрийским врачом Эрнстом Моро, работавшим в лаборатории первооткрывателя кишечной палочки Теодора Эшериха в Граце, а затем в Вене [1]. В настоящее время они широко используются в составе пробиотических препаратов, предназначенных для нормализации функций желудочно-кишечного тракта. Штаммы этого L. acidophilus Д № 75 и L. acidophilus Д № 76 входят в состав БАД «Витафлор», применяемой как для нормализации микрофлоры кишечника, так и для повышения эффективности терапии целого ряда заболеваний желудочно-кишечного тракта [2]. Предполагается, что высокая эффективность препарата обеспечивается за счет симбиотических взаимоотношений между L. acidophilus Д № 75 и L. acidophilus Д № 76, что приводит к повышению выживаемости бактерий, возрастанию их физиологической и антагонистической активности. Согласно методическим указаниям МУК 4.2.2602-10, регулирующим безопасность пробиотических препаратов, производственные штаммы должны быть охарактеризованы по способности продуцировать полезные для человека биологически активные вещества, в том числе и бактериоцины.
Бактериоцины представляют собой низкомолекулярные белки, обладающие антимикробным действием. От антибиотиков они отличаются тем, что синтезируются на рибосомах и имеют относительно узкий спектр антимикробного действия [3]. У грамположительных бактерий (включая Lactobacillus acidophilus) синтез бактериоцинов
происходит под контролем комплекса генов, расположенных на плазмидах или в составе хромосомы [4]. В этот комплекс помимо структурных генов входят также гены пострансляционной модификации бактериоцина, гены, детерминирующие белок устойчивости клетки к собственному бактериоци-ну (так называемый белок иммунности), а также гены белков системы транспорта бактериоцина во внеклеточную среду [5].
Бактериоцины — не единственный фактор антагонизма лактобацилл. Значительную роль в обеспечении антагонистической активности этих бактерий играют молочная кислота и некоторые другие низкомолекулярные метаболиты, например, уксусная и янтарная кислоты, перекись водорода, этанол [6]. Эти факторы антагонизма являются неспецифическими, то есть выделяются клетками вне зависимости от стадии роста и присутствия в среде чужеродных бактерий.
Отличительной особенностью бактериоцинов является то, что их синтез носит, как правило, ин-дуцибельный характер. Он осуществляется только на определенной стадии развития популяции, либо при наличии бактерий-конкурентов, относящихся к другому виду или штамму. В ряде случаев синтез бактериоцинов регулируется индуктором (пептидной природы) и начинается только после того, как его концентрация в среде достигнет определенного порогового значения [7, 8]. Концентрация индуктора повышается в процессе роста культуры (гомоиндукция) и/или при наличии в среде других бактерий (антагонистов) или продуктов их жизнедеятельности (гетероиндукция) [9]. Добавление пребиотиков (например, олигосахаридов) в среду
также может способствовать повышению продукцию бактериоцинов [10].
Результаты экспериментальных исследований позволяют сегодня рассматривать продукцию бактериоцинов как один из возможных механизмов антимикробной активности пробиотических штаммов микроорганизмов, в том числе относящихся к лактобациллам [11]. Способность некоторых молочнокислых бактерий продуцировать бактериоцины в среде, имитирующей состав ну-триентов содержимого толстой кишки человека (бульон Макфарлейна), была недавно продемонстрирована канадскими учеными. При этом все изучаемые бактериоцин-продуцирующие штаммы ингибировали рост патогенной Listeria ivanovii, а их ингибирующая активность коррелировала с продукцией бактериоцинов [12].
В предыдущих работах было показано наличие индуцибельной антагонистической активности у пробиотического штамма L. acidophilus Д № 75, что свидетельствовало о возможном синтезе им бактериоцина(ов). Индукция синтеза бактериоцина при этом могла осуществляться добавкой
собственной культуральной жидкости данного штамма (отобранной с более поздней стадии роста), присутствием гетерологичных бактерий, внесением их культуральной жидкости или даже добавлением модельной смеси метаболитов, состоящей из 12-13 метаболитов пробиотического штамма Escherichia coli М-17 (препарат «Акто-флор-С») [9].
Обработка собственной культуральной жидкости штамма L. acidophilus Д № 75 протеолити-ческими ферментами, такими как протеиназа К, пепсин, трипсин, приводила к понижению антагонистической активности. Это подтверждало, что непосредственным индуктором антагонизма или/и его действующим фактором является вещество пептидной природы. Полученные данные, таким образом, свидетельствовали о том, что штамм L. acidophilus Д № 75 при определенных условиях способен синтезировать бактериоцины [9].
Для подтверждения этого предположения в настоящей работе был осуществлен поиск генов бактериоцинов в составе ДНК штаммов L. acidophilus Д № 75 и L. acidophilus Д № 76.
Материалы и методы исследования
Культуры бактерий. Основными объектами исследования служили штаммы Lactobacillus acidophilus Д № 75 и Д № 76, входящие в состав БАД «Витафлор». В качестве культур сравнения в работе использовали следующие штаммы рода Lactobacillus: L. delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC21815, L. plantarum 8p-A3, L. fermenti 90Т-С4, L. acidophilus 20T, L. acidophilus 7m, L. acidophilus 5e13, L. acidophilus 7m13 и L. helveticus 30510.
Для изучения антагонистической активности L. acidophilus Д № 75 и Д № 76 использовали штаммы условно патогенных бактерий Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis 209 (S. Enteritidis 209) и Escherichia coli O75. Все штаммы бактерий поддерживались и хранились в коллекции микроорганизмов ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России.
Получение рабочих культур L. acidophilus Д № 75 и L. acidophilus Д № 76. Ампулы с лиофильно высушенными музейными культурами L. acidophilus Д № 75 и L. acidophilus Д № 76, полученные из коллекции микроорганизмов, стерильно вскрывали, содержимое суспендировали в 1 мл стерильной дистиллированной воды (1 мл — объем культуры в ампуле до высушивания) и регидратировали в течении 2 часов при температуре +37 °C. Из ампулы отбирали 150 мкл клеточной суспензии, засевали в 5 мл среды МРС-1 [9] и выращивали при температуре +37 °C в течение 18 часов (1-й пассаж). Из полученной культуры отбирали 50 мкл и засевали в 5 мл свежей среды МРС-1 и вновь выращивали при той же температуре в течение 14 часов (2-й пассаж). В выращенную культуру добавляли кри-опротектор (глицерин) в количестве 10% (v/v), стерильно разливали ее по микропробиркам (по 1 мл) и хранили в холодильнике при -70 °C.
Условия культивирования бактерий штаммов Д № 75, Д № 76 и 5e13. Рабочие культуры, хранящиеся при температуре -70 °C, активировали,
проводя два последовательных пассажа на среде МРС-1, так же, как описано выше для музейной культуры. Затем 40 мкл активированной культуры помещали в 4 мл питательной среды МРС-1, культивировали в стационарных условиях в течение 5 часов при +37 °C до достижения середины логарифмической фазы роста и использовали для выделения ДНК.
Микробиологический тест на антагонистическую активность. Антагонистическую активность штаммов L. acidophilus оценивали по степени подавления роста тест-штаммов E. coli O75 и S. Enteritidis 209, используя метод отсроченного антагонизма. Антагонистическая активность исследовалась на среде МРС-5 [9] и среде МРС-5, содержащей в качестве индуктора синтеза бактериоцинов модельную смесь метаболитов Escherichia coli М-17 (Актофлор-С) в концентрации 2 мг/мл.
Тест-культуры E. coli O75 и S. Enteritidis 209 предварительно активировали, проводя два последовательных пассажа на LB бульоне [9]: 150 мкл клеточной суспензии, хранившейся при -70 °C, вносили в 5 мл бульона (3% засев) и инкубировали 14 часов при +37 °C (1-й пассаж). 2-й пассаж проводили при аналогичных условиях, используя 1% засев. Активированные клеточные культуры использовали в дальнейшем в качестве посевного материала для получения клеток в логарифмической фазе роста.
Для проведения анализа штаммы L. acidophilus Д № 75, L. acidophilus Д № 76 и L. acidophilus 5e13 высевались на чашки Петри диаметральным штрихом и помещались в термостат при температуре +37 °C. На 2-е сутки роста на чашках Петри перпендикулярно диаметральному штриху на расстоянии 2 мм от края штриха подсевали выращенные до логарифмической стадии роста тест-культуры E. coli O75 и S. Enteritidis 209. Подсев осуществлялся
от анализируемого штамма к краю чашки Петри. исследуемой культуры до зоны роста тест-культур Чашки помещали в термостат при +37 °С на 24 часа, и рассчитывали площади зоны ингибирования после чего измеряли расстояния от зоны роста роста тест-культур по формуле (1).
S = я x r2,
(1)
где г — расстояние от зоны роста исследуемой культуры до зоны роста тест-культур (мм), 8 — площадь зоны ингибирования роста (мм2).
Статистическую обработку данных проводили стандартными методами с использованием
критерия Стьюдента. В качестве характеристики степени индукции синтеза бактериоцина использовали индекс стимуляции антагонистической активности, который рассчитывали по формуле (2):
K = S1/S2,
(2)
где К — индекс стимуляции антагонистической активности, Sj и S2 — площадь зоны ингибирования роста анализируемыми культурами в среде с Актофлором-С и без него соответственно (мм2).
Выделение хромосомной ДНК. Для выделения хромосомной ДНК использовали модифицированный метод фенол-хлороформной экстракции с помощью органических растворителей и цетилтриме-тиламмония бромида (Cetrimonium bromide, CTAB) [13]. ДНК выделяли из 30 мг биомассы каждого из штаммов L. acidophilus Д № 75, Д № 76 и штамма сравнения L. acidophilus 5е . Для лизиса бактерий применяли раствор, содержащий 250 ед/мл мутанолизина и 0,3 мг/мл РНК'зы в буфере TE (10 мМ Трис-HCl, pH = 8,0; 5 мМ ЭДТА). Полученный препарат хромосомной ДНК растворяли в 30 мкл буфера TE и хранили при температуре +4 °C.
Электрофорез ДНК в агарозном геле. Электрофорез проводили в горизонтальном 0,9-1,6% агарозном геле в буфере 1xSB (10 мМ NaOH в 0,25% растворе H3BO3; pH = 8,2) при напряжении 200 В. Для визуализации ДНК-полос в геле использовали водный раствор бромистого этидия (0,5 мкг/мл). Результат регистрировали в системе Gel Imager (компания «ДНК-Технология», Россия). Для оценки размера ДНК использовали маркеры относительного молекулярного веса GeneRuler DNA Ladder Mix марки #SM0331 и марки #SM0383 (компания «Fermentas»).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР проводили в программируемом термостате модели ТП4-ПЦР-01-«Терцик» (компания «ДНК-Технология»). Дизайн праймеров осуществляли
с использованием инструментов VectorNTI и OLIGO 7 Primer Analysis Software, а также биоинформационной базы данных NCBI.
Препаративное получение матриц ДНК. ПЦР-фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в агарозном геле. На пути движения фрагментов ДНК в геле делали лунки, в которые заливали легкоплавкую LMP-агарозу. За продвижением фрагментов следили при помощи УФ-лампы. После вхождения фрагмента ДНК в область легкоплавкой агарозы, его вырезали из агарозного геля и выделяли с использованием набора для очистки ДНК (ООО «Цитокин») в соответствии инструкцией по применению.
Секвенирование. Полученные очищенные фрагменты ДНК секвенировали на автоматическом секвенаторе ABI PRISM* 310 Genetic Analyzer с использованием набора реактивов BigDye* Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit в соответствии с инструкцией.
Анализ секвенированных нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программ BIOEdit и VectorNTI. Для поиска гомологичных последовательностей в банке данных NCBI применяли программу BLAST, позволяющую проводить сравнение как нуклеотидных, так и кодируемых ими аминокислотных последовательностей.
Для сравнения нуклеотидных последовательностей ДНК анализируемых штаммов использовали пакет программ VectorNTI. Поиск соответствующих гомологичных фрагментов в геномах бактерий из базы данных NCBI осуществляли при помощи пакета программ BLASTX.
Результаты исследования и их обсуждение
Микробиологический тест на индуцибельную антагонистическую активность для анализируемых штаммов L. acidophilus Д № 75, Д № 76 и 5е . В качестве индуктора антагонистической активности использовали модельную смесь метаболитов E. coli M-17 — БАД «Актофлор-С». Как показано в табл. 1 введение этого препарата в среду роста повышало антагонистическую активность анализируемых штаммов примерно в 2 раза. Полученные результаты позволили высказать предположение о синтезе бактериоцинов в ответ на присутствие метаболитов посторонней микрофлоры (при добавлении БАД «Актофлор-С» концентрация молочной кислоты, ответственной за формирование неспецифической
антагонистической активности, не меняется [9]). Для подтверждения данной гипотезы был проведён генетический анализ ДНК штаммов Д № 75 и Д № 76 на наличие структурно функциональных генов бактериоцинов.
Подбор праймеров и оптимизация режима ПЦР. Согласно данным литературы, одним из наиболее изученных бактериоцинов L. acidophilus и L. helveticus является гельветицин J [7, 14]. Для выявления генов этого бактериоцина был осуществлен поиск соответствующих нуклеотидных последовательностей в полностью секвенированных геномах L. helveticus DPC4571 и L. helveticus R0052 и выбраны последовательности прямых
Таблица 1.
Индекс стимуляции антагонистической активности (К) для штаммов L. acidophilus Д № 75, Д № 76 и 5е13
Таблица 2.
Праймеры, построенные на матрицах ДНК штаммов L. helveticus DPC4571 и L. helveticus R0052
Исследуемые штаммы
Индекс стимуляции антагонистической активности (К) Актофлором-С для L. acidophilus Д № 75, Д № 76 и 5е 13 относительно условно патогенных E. coliO75 и S. Enteritidis 209
E. coli O75
S. Enteritidis 209
L. acidophilus Д № 75 2,30 2,49
L. acidophilus Д № 76 1,97 2,30
L. acidophilus 5е 13 1,86 1,67
Ген бактериоцина (штамм) Прямой праймер Обратный праймер Длина ампликона Температура отжига, °C
lhv_1632 (L. helveticus DPC4571) 5'-AAATACACAA 5'-TTTGCGGC 538 bp +53 °C
CTTCCACGTTT-3' ATTAACATGGAT-3'
R0052 09025 (L. helveticus R0052) 5'-TTTAAATAGA GCTGGTTCTCA-3' 5'-ACATAAATAT AGTTTGCTCCA-3' 284 bp +46 °C
Рисунок 1.
Амплификация ДНК с праймерами, синтезированными на матрице гена \hv_1632 штамма L. heiveticus DPC4571, при температуре отжига +53 °С.
1 — L. delbrueckii subsp. 6 -bulgaricus ATCC21815, 7 -
2 — L. plantarum 8p-A3, 8 -
3 — L. fermenti 90Т-С4, 9 -
4 — L. acidophilus 20T, 10
5 — маркер молекулярного 11 веса ДНК,
- L. acidophilus 7m,
- L. acidophilus 5e13, L. acidophilus 7m13, L. helveticus 30510,
L. acidophilus Д № 75, L. acidophilus Д № 76.
] 2 3 4 5 6 7 К 9 Hi I I
Таблица 3.
Фрагменты гена бактери-оцина гельветицина у L. acidophilus Д № 75, Д № 76, 5е 13 длиной 537 п.о., выровненные относительно фрагмента гена lhv_1632 штамма L. helveticus DPC4571
Наименование штамма
Нуклеотидная последовательность, кодирующая бактериоцин
Номер последнего нуклеотида во фрагменте гена
L. acidophilus D-76 ---------------------------------------AATACACAACTTCCACGTTTG
L. acidophilus D-75
L. acidophilus 5e13 ------------------------------------------------------------
L. helveticus DPC4571 GTAAAGTACCCAAGACTTTTACCAGAAAGATATACTTCAAATACACAACTTCCACGTTTG
L. acidophilus D-76 TCACACTTGAATCACGTAACCGACATTCCTTATGATGGTCATGATCACTTGCACAGAGTA
L. acidophilus D-75 TCACACTTGAATCACGTAACCGACATTCCTTATGATGGTCATGATCACTTGCACAGAGTA
L. acidophilus 5e13 ------------TAMGCTACCGACATTCCTTATGATGGTCATGATCACTTGCACAGAGTA
L. helveticus DPC4571 TCACACTTGAATCACGTAACCGACGTTCCTTATGATGGTCATGATCACTTGCACAGAGTA
L. acidophilus D-76 GAAGCTTCAGTTTCACCAAATGGCAAGTACTTCATGATTGCTTCAATTTGGGATGATGGT
L. acidophilus D-75 GAAGCTTCAGTTTCACCAAATGGCAAGTACTTCATGATTGCTTCAATTTGGGATGATGGT
L. acidophilus 5e13 GAAGCTTCAGTTTCACCAAATGGCAAGTACTTCATGATTGCTTCAATTTGGGATGATGGT
L. helveticus DPC4571 GAAGCTTCAGTTTCACCAAATGGCAAGTACTTCATGATTGCTTCAATTTGGGATGATGGT
L. acidophilus D-76 TCAGGTCACTTTGGTTTGTTTGACTTAAATGAAGTAAACCAAAAGTTGAATGAAAATGGC
L. acidophilus D-75 TCAGGTCACTTTGGTTTGTTTGACTTAAATGAAGTAAACCAAAAGTTGAATGAAAATGGC
L. acidophilus 5el3 TCAGGTCACTTTGGTTTGTTTGACTTAAATGAAGTAAACCAAAAGTTGAATGAAAATGGC L. helveticus DPC4571
L. acidophilus D-76 ACTAAGAACACGCCAATCACTGATTTACATTGCTTGAGTGCTTTCCACATCGACAACTTC
L. acidophilus D-75 ACTAAGAACACGCCAATCACTGATTTACATTGCTTGAGTGCTTTCCACATCGACAACTTC
L. acidophilus 5e ACTAAGAACACGCCAATCACTGATTTACATTGCTTGAGTGCTTTCCACATCGACAACTTC
L. helveticus DPC4571 ACTAAGAACACGCCAATCACTGATTTACATTGCTTGAGTGCTTTCCATATCGACAACTTC
L. acidophilus D-76 GATAATCCAAGTGTTGCTCCAGATGAAGAAATGCCACAAATGATTGATTCAGTTCAAGG
L. acidophilus D-75 GATAATCCAAGTGTTGCTCCAGATGAAGAAATGCCACAAATGATTGATTCAGTTCAAGG L. acidophilus 5e13
L. helveticus DPC4571 GATAATCCAAGTGTTGCTCCAGATGAAGAAATGCCACAAATGATTGATTCAGTTCAAGG
L. acidophilus D-76 CTATGCTATTGATGATGATAAGAATATCTATATTTCTAACCAATTGTCACCAAAGATTAAC
L. acidophilus D-75 CTATGCTATTGATGATGATAAGAATATCTATATTTCTAACCAATTGTCACCAAAGATTAAC
L. acidophilus 5e13 CTATGCTATTGATGATGATAAGAATATCTATATTTCTAACCAATTGTCACCAAAGATTAAC
L. helveticus DPC4571 CTATGCTATTGATGATGATAAGAATATCTATATTTCTAACCAATTGTCACCAAAGATTAAC
21 22
360
81 82 48 420
141
142 108 480
201 202 168 540
261 262 28 600
321
322 288 660
381
382 348 720
Наименование штамма
Нуклеотидная последовательность, кодирующая бактериоцин
Номер последнего нуклеотида во фрагменте гена
Таблица 3.
Окончание.
L. acidophilus D-76 L. acidophilus D-75 L. acidophilus 5e13 L. helveticus DPC4571
L. acidophilus D-76 L. acidophilus D-75 L. acidophilus 5e13 L. helveticus DPC134571
L. acidophilus D-76 L. acidophilus D-75 L. acidophilus 5e13 L. helveticus DPC134571
CATGAAACTGGTGAAGTAACTACTTGGTCACGTAAGATTGTTAAGTTCCCATGGGGTGAA 441 CATGAAACTGGTGAAGTAACTACTTGGTCACGTAAGATTGTTAAGTTCCCATGGGGTGAA 442
408
CATGAAACTGGTGAAGTAACTACTTGGTCACGTAAGATTGTTAAGTTCCCATGGGGTGAA 780 ACAAACAGTGATAACTGGC&AGTASCTATGGTTGATGGTATTGATTTACCAGATCGTTAC 501 ACAAACAGTGATAACTGGCAAGTAGCTATGGTTGATGGTATTGATTTACCAGATCGTTAC 502
467
ACAAACAGTGATAACTGGCAAGTAGCTATGGTTGATGGTATTGATTTACCAGATCGTTAC 840
AGTGAAATGGAAAGTATCCATGTTAATGCCGCAAAT------------------------ 537
538
-GT----TKGGGGG---------------------------------------------- 476
AGTGAAATGGAAAGTATCCATGTTAATGCCGCAAATGATATTTACTTAACTGTGGCTTAC 900
и обратных праймеров, приведенные в табл. 2. При выборе праймеров руководствовались следующими критериями:
1. Температура отжига праймеров должна находиться в области +(50 ± 8) °C и быть ниже температуры плавления ДНК;
2. Длина ампликона не должна превышать 600 нуклеотидных пар;
3. Количество Г+Ц в праймерах должно быть не более 50% и
4. Праймеры не должны образовывать вторичные структуры («шпильки»).
Для повышения надежности результатов при проведении генетического анализа использовали не только штаммы L. acidophilus Д № 75 и Д № 76, но и ряд других родственных бактерий рода Lactobacillus (рис. 1). Эти штаммы были использованы в качестве контрольных, что позволило избежать ложноположительных результатов.
Электрофоретический анализ ПЦР-фрагментов показал, что из всех 8 штаммов искомые фрагменты ДНК были обнаружены только в геномах L. acidophilus Д № 75 и Д № 76, а также в геноме родственного штамма L. acidophilus 5е . Последний штамм использовался в дальнейшем в качестве культуры сравнения. Результаты эксперимента представлены на рис. 1.
Полученные ПЦР-фрагменты ДНК штаммов L. acidophilus Д № 75, Д № 76 и штамма сравнения L. acidophilus 5е разделяли методом электрофореза в агарозном геле, локализовали фрагменты в легкоплавкой агарозе и очищали с применением стандартных сорбционных спин-колонок (набор для выделения ДНК, ООО «Цитокин»). Концентрация ПЦР-фрагментов в полученных препаратах определялась стандартными спектрофотометри-ческими методами и составляла около 7 мкг/мл.
Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНКL. acidophilus Д№ 75, Д№ 76 и L. acidophilus 5е . После проведения ПЦР, очистки полученных ампликонов и последующего их секвенирования были получены нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК всех штаммов. Из них для дальнейшего анализа были отобраны 16 фрагментов для штамма Д № 76, 5 фрагментов для штамма Д № 75 и 6 фрагментов для штамма 5е . Остальные фрагменты имели большое количество нуклеотидных
замен (относительно друг друга и относительно последовательностей генов lhv_1632 и R0052_09025), либо длина полученных фрагментов была значительно меньше ожидаемой.
Сравнительный анализ полученных нуклеотидных последовательностей. 16 полученных ПЦР-фрагментов ДНК L. acidophilus Д № 75, Д № 76 и 5е сравнивали между собой и с референсны-ми последовательностями генов бактериоцинов у L. helveticus DPC4571 и L. helveticus R0052. Сравнительный анализ показал, что геном L. acidophilus Д № 76 содержит два фрагмента ДНК, протяженностью 283 пар оснований (п.о.) и 537 п.о. соответственно, а геном L. acidophilus Д № 75 — только второй фрагмент.
Фрагмент длиной 537 п.о. оказался идентичным у обоих штаммов и на 97% совпадал с соответствующим фрагментом гена гельветицина L. helveticus DPC4571 (ген lhv_1632). От референсной ДНК он отличался тремя нуклеотидными заменами: А вместо Г в позиции 46, Ц вместо Т в позиции 249 и А вместо Т в позиции 537.
Фрагмент длиной 283 п.о. на 95% совпал с соответствующим фрагментом гена гельветицина J L. helveticus R0052 (ген R0052_09025) и отличался от него нуклеотидными заменами в позициях 20 (А вместо Ц), 73 (Г вместо Т), 77-80 (ГГАА вместо ТАТТ), 83 (Ц вместо А), 115 (Ц вместо Т), а также наличием делеции в областях 24-25, 71-73, 79-80, 254-255. Эти нуклеотидные замены приводят к аминокислотным заменам в областях 73, 77-80 и 115.
В табл. 3 приведены последовательности генов бактериоцинов анализируемых штаммов, выровненные относительно друг друга и относительно гена lhv_1632 штамма L. helveticus DPC4571. Нуклеотидные замены выделены шрифтом.
Выявленные нуклеотидные расхождения в последовательностях генов бактериоцинов L. acidophilus Д № 75, L. acidophilus Д № 76, L. acidophilus 5е 13 по отношению друг к другу и в сравнении с L. helveticus DPC4571 не приводят к аминокислотным заменам. В то же время у L. acidophilus Д № 76 выявлены нуклеотидные замены во фрагменте ДНК гельветицина J (длиной 283 п.о.) в сравнении с геном бактериоцина штамма L. helveticus R0052, которые приводят к аминокислотным заменам. Нуклеотидные различия между штаммами Д № 75, Д № 76,
5е, R0052 и DPC4571 являются подтверждением их индивидуальности и указывают на различия в их филогенетическом происхождении.
В результате поиска соответствующих гомологичных фрагментов у других бактерий в базе данных NCBI/BLAST были найдены 11 микроорганизмов с бактериоцинами (L. acidophilus, L. amylovorus, L. crispatus, L. gallinarum, L. helveticus и L. kitasatonis), аминокислотные последовательности которых имели участки, высокогомологичные фрагментам штаммов L. acidophilus Д № 76 и Д № 75.
Выводы
Штаммы молочнокислых бактерий L. acidophilus Д № 75 и L. acidophilus Д № 76, входящие в состав симбиотического пробиотического препарата «Ви-тафлор», проявляют выраженную антагонистическую активность в отношении штаммов E. coli O75 и S. Enteritidis 209. При этом антагонистическую активность штаммов L. acidophilus Д № 75 и Д № 76 способны индуцировать не только условно патогенные микроорганизмы, но и метаболиты пробио-тических бактерий, входящие в состав препарата «Актофлор-С», что согласуется с полученными ранее результатами [9].
На основе генетического анализа у L. acidophilus Д № 75 и Д № 76 выявлены участки ДНК, гомологичные фрагментам генов гельветицина J L. helveticus R0052 (95% идентичности у L. acidophilus Д № 76) и гельветицина L. helveticus DPC4571 (97% идентичности у L. acidophilus Д № 75 и L. acidophilus Д № 76). Сравнение аминокислотных последовательностей соответствующих фрагментов генов показало, что нуклеотидные замены во фрагменте длиной 537 п.о. не приводят к аминокислотным заменам, то есть являются синонимичными. Для фрагмента величиной 283 п.о. нуклеотидные замены в позициях 73, 77-80 и 115 приводят к аминокислотным заменам.
Полученные нами данные свидетельствуют о существовании, по крайней мере, двух бактериоцинов у L. acidophilus Д № 76 и одного — у L. acidophilus Д № 75. Однако окончательный вывод о наличии функционально активного бактериоцинового кластера невозможен без проведения дальнейшего анализа. В частности, для функционирования
Литература
1. Weirich Л, Hoffmann GF. Ernst Moro (1874-1951) — a great pediatric career started at the rise of university-based pediatric research but was curtailed in the shadows of Nazi laws. Eur J Pediatr. 2005 Oct;164(10):599-606. doi: 10.1007/s00431-005-1703-2.
2. Петров Л. Н., Вербицкая Н. Б., Добрица В. П., Галкин Г. Н., Петров Н. Л. Бактериальные пробиотики. Биотехнология, клиника, алгоритмы выбора. — СПб.: ФГУП Гос. НИИ ОЧБ, 2008. — 136 с.
3. Riley МЛ, Wertz JE. Bacteriocins: evolution, ecology, and application. Annu Rev Microbiol. 2002;56:117-37. doi: 10.1146/annurev.micro.56.012302.161024.
4. Cui Y, Zhang C, Wang Y, Shi J, Zhang L, Ding Z, Qu X, Cui H. Class Ila bacteriocins: diversity and new developments. Int J Mol Sci. 2012 Dec 6;13(12):16668-707. doi: 10.3390/ijms131216668.
Присутствие структурно целостных фрагментов генов бактериоцинов в геномах L. acidophilus Д № 75 и L. acidophilus Д № 76 является веским доказательством существования у данных про-биотических штаммов системы биосинтеза бак-териоцина. Окончательные выводы о бактери-оциновой активности у исследуемых штаммов, однако, можно сделать только после проведения дополнительных исследований, в частности, после подтверждения экспрессии кластера генов синтеза бактериоцинов.
бактериоцинов требуется наличие не только их структурных генов, но и генов белков иммунности к собственным бактериоцинам, а также генов экспорта бактериоцинов из клетки.
Несмотря на то, что вопрос о том, насколько продукция бактериоцинов существенна для проявления микроорганизмами пробиотических свойств, до сих пор остается открытым, изучение способности продуцировать бактериоцины у высокоэффективных и хорошо зарекомендовавших себя на практике штаммов бактерий является важным шагом к пониманию механизмов действия пробиотиков и прогнозированию их клинической эффективности [15, 16].
Продукция бактериоцинов симбиотическими микроорганизмами, на наш взгляд, вправе рассматриваться как одна из «ключевых» метаболических функций микробиоты, особенно с учетом того, что основные бактериоцин-продуцирующие виды относятся к роду Lactobacillus, входящему в состав филометаболического ядра микробиоты кишечника [17].
По мнению проф. Б. А. Шендерова, бактериоцины пробиотических бактерий (в числе других низкомолекулярных соединений микробного происхождения) могут служить основой для создания метабиотиков — принципиально нового класса препаратов, на молекулярном уровне модулирующих метаболическую активность микробиоты или непосредственно эукариотических клеток и оказывающих терапевтическое действие при целом ряде хронических заболеваний человека [18].
5. Garneau S, Martin NI, Vederas JC. Two-peptide bacteriocins produced by lactic acid bacteria. Biochimie. 2002 May-Jun;84(5-6):577-92.
6. Лппuk H, Shchepetova J, Kullisaar T, Songisepp E, Zilmer M, Mikelsaar M. Characterization of intestinal lactoba-cilli as putative probiotic candidates. J Appl Microbiol. 2003;94(3):403-12.
7. Joerger MC, Klaenhammer TR. Characterization and purification of helveticin J and evidence for a chromo-somally determined bacteriocin produced by Lactobacillus helveticus 481. J Bacteriol. 1986 Aug;167(2):439-46.
8. Drider D, Fimland G, Héchard Y, McMullen LM, Prévost H. The continuing story of class Ila bacteriocins. Microbiol Mol Biol Rev. 2006 Jun;70(2):564-82. doi: 10.1128/MMBR.00016-05.
9. Вахитов Т. Я., Вербицкая Н. Б., Добролеж О. В., Полевая Е. В., Кобатов А. И. Влияние метаболитов пробиотических и патогенных бактерий на антагонистическую активность Lactobacillus acidophilus Д № 75 // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ). — 2013. — № 92 (08) — С. 312-327. — Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2013/08/pdf/22.pdf
10. Pranckuté R, Kaunietis A, Kuisiené N, Citavicius DJ. Combining prebiotics with probiotic bacteria can enhance bacterial growth and secretion of bacteriocins. Int J Biol Macromol. 2016 Aug;89:669-76. doi: 10.1016/j. ijbiomac.2016.05.041.
11. Dobson A, Cotter PD, Ross RP, Hill C. Bacteriocin production: a probiotic trait? Appl Environ Microbiol. 2012 Jan;78(1):1-6. doi: 10.1128/AEM.05576-11.
12. Fernandez B, Le Lay C, Jean J, Fliss I. Growth, acid production and bacteriocin production by probiotic candidates under simulated colonic conditions. J Appl Mi-crobiol. 2013 Mar;114(3):877-85. doi: 10.1111/jam.12081.
13. van Soolingen D, Hermans PW, de Haas PE, Soil DR, van Embden JD. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex
strains: evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol. 1991 Nov;29(11):2578-86.
14. Foster LM, Tompkins TA, Dahl WJ. A comprehensive post-market review of studies on a probiotic product containing Lactobacillus helveticus R0052 and Lactobacillus rhamnosus R0011. Benef Microbes. 2011 Dec 1;2(4):319-34. doi: 10.3920/BM2011.0032.
15. Drider D, Bendali F, Naghmouchi K, Chikindas ML. Bacteriocins: Not Only Antibacterial Agents. Probi-otics Antimicrob Proteins. 2016 Aug 1. doi: 10.1007/ s12602-016-9223-0.
16. Hegarty JW, Guinane CM, Ross RP, Hill C, Cotter PD. Bacteriocin production: a relatively unharnessed probiotic trait? F1000Res. 2016 Oct 27;5:2587. eCollection 2016. doi: 10.12688/f1000research.9615.1.
17. Ситкин С. И., Ткаченко Е. И., Вахитов Т. Я. Фило-метаболическое ядро микробиоты кишечника // Альманах клинической медицины. — 2015. — № 40. — С. 12-34. doi: 10.18786/2072-0505-2015-40-12-34.
18. Shenderov BA. Metabiotics: novel idea or natural development of probiotic conception. Microb Ecol Health Dis. 2013 Apr 12;24. doi: 10.3402/mehd.v24i0.20399.
