CC BY
34
УДК 616-006.432-02:615.277.3.015:616-018
S. Sh. Gadzhieva1, Е. R. Polosukhina1, L. A. Sedakova1, Н. М. Treshalina1,
A. Yu. Baryshnikov1, V. Е. Nebolsin2
COMPARABLE EFFICACY OF COMBINED THERAPY USING DICARBAMINE® WITH OTHER INDUCERS OF DIFFERENTIATION
1 N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
2 Pharmenterprises Ltd., Moscow
ABSTRACT
The data obtained earlier indicated that monotherapy of subcutaneously transplantable Friend erythroleukemia (EF) with various differentiation inducers — Dicarbamine (Dcr), all-trans-retinoic acid (ATRA) and Reaferon (RFN) is ineffective. The tumor growth inhibition (TGI) was 66-78 % immediately after treatment and decreased to 15—40 % by the 15th day. When Dcr and ATPA were used simultaneously TGI was only 6 % by the 15th day. The efficacy of these preparations in different combinations and injection sequences was studied. Comparative study has showed that consecutive injection of Dcr and RFN or ATRA and Dcr failed to increase efficacy: by the 17th day TGI was 12-41 %. The best results were obtained with combination of RFN+Dcr: long and statistically significant TGI was 61-67 % (p<0.05). The effective treatment scheme has been developed: RFN with single dose of 10 000 Ul/kg subcutaneously daily on the 2-6* day, Dcr with single dose of 4,5 mg/kg daily on the 7—11th day after tumor inoculation.
Key words: differentiation inducers, Friend erithroleukemia, tumor growth inhibition, combined therapy.
С. Ш. Гаджиева1, E. P. Полосухина1, JI. А. Седакова1, E. М. Трещалина1,
А. Ю. Барышников1, E. В. Небольсин2
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОМБИНИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДИКАРБАМИНА® И ДРУГИХ ИНДУКТОРОВ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 2 ООО «Фарминтерпрайсез», Москва
РЕЗЮМЕ
Ранее нами были получены данные о том, что монотерапия подкожно трансплантированного эритролейкоза Френд (ЭФ) разными индукторами дифференцировки — дикарбамином (Dcr), реафероном (РФН) и политрансре-тиноевой кислотой (АТРА) — малоэффективна. Сразу после лечения торможение роста опухоли (ТРО) составляло 66-78 % и снижалось к 15-м суткам до 15-40 %. Одновременное применение Dcr и АТРА ухудшало результаты лечения: на 15-е сутки ТРО составляло всего 6 %. В настоящей работе изучена эффективность применения этих препаратов в различных сочетаниях и последовательности введения. Сравнительное изучение показало, что последовательное введение Dcr и РФН или АТРА и Dcr не приводит к повышению эффективности: на 17-е сутки ТРО=12-41 %. Лучшие результаты получены при сочетании Dcr+ATPA и РФН+Dcr — длительное и статистически значимое ТРО=63-67 % (р<0,05 для группы РФН+Dcr). Эффективная схема: РФН подкожно ежедневно на
2-6-е сутки в разовой дозе 10 тыс. МЕ/кг, Dcr перорально ежедневно на 7-11-е сутки в разовой дозе 4,5 мг/кг.
Ключевые слова: индукторы дифференцировки, эритролейкоз Френд, ингибирование опухолевого роста, комбинированная терапия.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что индукторы дифференцировки опосредуют свое действие на клетки через рецепторы [11, 16]. Особенно ярко это свойство проявляется у цито-
кинов и ретиноидов [4, 9, 15, 17]. Для комбинированной терапии гемобластозов человека применяются некоторые препараты с таким механизмом действия и среди них политрансретиноевая кислота (АША, ве-
саноид, третиноин) и а-2Ь-интерферон (а-2Ь-ИФН, реаферон, интрон-А, веллферон) [8,10-12, 14].
АША специфически связывается с ядерными рецепторами ретиноевой кислоты (РК) или рецепторами Х-ретиноидов клеток промиелоцитарного лейкоза, запуская программируемую гибель клеток — апоптоз. В процессе запуска апоптоза происходит димеризация активированных РК-рецепторов, которые затем высокоаффинно связываются с генами-мишенями ДНК и регулируют транскрипцию мРНК. После это следует ряд процессов, включая повышение экспрессии фактора трансформации-р, снижение орнитиндекарбокси-лазной активности и подъем трансглютаминазной активности, запускающих апоптоз [11, 17]. АТЯА используется при лечении промиелоцитарного лейкоза человека в моно- и комбинированной терапии [1, 2, 12]. а-2Ь-ИФН — рекомбинантный цитокин, продуцируемый бактериальным штаммом псевдомонады, в генетический аппарат которой встроен ген человеческого лейкоцитарного а-2Ь-ИФН. Дифференцировка, индуцированная а-2Ь-ИФН, хорошо изучена в культуре клеток волосатоклеточного лейкоза человека. Показано, что ИФН взаимодействует с ИФН-рецепторами через специфические белки, которые димеризуются и транслоцируются в ядро, где активируют соответствующие гены. Под действием ИФН в организме происходят следующие процессы: увеличение экспрессии мембранных антигенов или рецепторов к гормонам, ускорение созревания недифференцированных клеток и восстановление нормального сдерживающего контроля пролиферации [3, 4, 13]. Препараты а-2Ь-ИФН используются для лечения онкологических больных хроническим миелолейкозом, волосатоклеточным лейкозом, множественной миеломой, неходжкинскими лимфомами, острыми лейкозами [8, 10, 12].
Дикарбамин (Осг) — новый отечественный неспецифический индуктор дифференцировки, представляющий собой 2-(имидазол-4-ил)-этанамид пентандиовой-1,5 кислоты молекулярной массой 225 [5]. Ранее нами на клетках миелолейкоза человека №34 было показано, что Бег индуцирует дифференцировку ранних миело-идных предшественников на дискретном этапе, сдвигая блок дифференцировки на несколько ступеней, о чем свидетельствует модуляция экспрессии антигена СБЗЗ. Вместе с тем Бег способен тормозить пролиферацию только тех клеток, в которых присутствует аберрантная форма рецептора ретиноевой кислоты ИАЯ-а, образующаяся в результате специфической хромосомной транслокации 1(15; 17) и присутствующая только в клетках этой линии. На мышах с подкожно трансплантированным ЭФ, клеточный состав которого представлен низкодифференцированными гемопоэтическими клетками различных пулов, способных к дифференцировке, Бег ускорял созревание клеток-предшественниц миелоид-ного и лимфоидного рядов [6, 7]. Предварительные опыты, проведенные с этими же индукторами на мышах с ЭФ, показали, что монотерапия на ранних сроках после трансплантации не приводит к длительному эффекту (табл. 1).
Таблица 1
Эффективность дикарбамина, транеретиноевой кислоты или реаферона при лечении мышей с эритролейкозом Френд
Группа Разовая доза препаратов Суммарная доза препаратов Путь введения препаратов Сутки после трансплантации опухоли
7-е 15-е
Средний объем опухоли, ММ,И ТРО,% Средний объем опухоли, мм3- ТРО,%
Контроль (физиологический раствор) 0,2 мл 1.0 мл п/к 234 (162-306) 802 (489-765)
РФН Ютыс. МЕ/кг 50 тыс МЕ/кг П/к 79 (45-113) 66'” 486 (335-637) 39
ATRA 03 иг/кг 1,5 мг/кг п/к 117 (74-160) 71W* 595 (88-1102) 15
DCR 4,5 мг/хг 22,5 мг/кг per OS 52 (29-85) 78"' 483 (209-757) 40
DCR +ATRA 4,5 мг/кг 0,3 мг/кг 22.5 мг/кг 1.5 мг/кг per OS п/ж 13 (38-222) 44 757 (420-1094) 6
* Лечение проводили ежедневно на 2-6-е сутки после перевивки гемобласто-за.
** Среднее арифметическое с доверительным интервалом ***р< 0,05.
Видно, что значимый и достоверный эффект (ТРО=66-78 %; р<0,05) отмечался только на 1-е сутки после отмены препаратов. В течение последующих дней во всех 3 группах эффективность снижалась до 24-52 % на 7-е сутки и до 15-40 % на 9-е сутки после окончания введения. В группе с комбинированным лечением при одновременном введении 2 миелоидных индукторов дифференцировки Dcr и ATRA непосредственный эффект практически отсутствовал, ТРО=44 % (р>0,05), а в последующие сроки ингибирование уменьшилось до 6 %. Этот феномен был расценен как следствие возможной конкуренции двух близких по действию препаратов. Поэтому для ответа на вопрос, возможно ли комбинированное применение этих индукторов дифференцировки, было проведено изучение двойных комбинаций с использованием Dcr и АТРА с последовательным введением. Кроме того, изучена комбинация каждого из препаратов с РНФ в аналогичной последовательности введения для выявления возможной направленности действия Dcr.
Цель настоящего исследования — сравнительное изучение эффективности 2 двойных комбинаций Dcr+ATRA и Dcr+РФН в разных сочетаниях и последовательности введения.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В опыте использованы мыши из разведения ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, которых содержали в виварии отдела экспериментальных животных РОНЦ на брикетированных кормах. Всего использовано 95 мы-шей-самок BDF! массой 18-20 г. В опыте использован 17-й пассаж in vivo на мышах DBA2. Для опыта брали клетки асцита в количестве 107 клеток/мышь и трансплантировали п/к по 0,4 мл в питательной среде 199.
ЭФ — спонтанно возникший гемобластоз, обнаруженный у мышей после трансплантации асцитной карциномы Эрлиха. Клеточный состав ЭФ представлен популяцией различных гемопоэтических клеток чрезвычайно низкой дифференцировки, в т. ч. редкой для мышей популяции миелоидных предшественников [15, 18].
После трансплантации опухоли мышей делили на группы (п=19), оставляя одну в качестве контроля. Препараты начинали вводить мышам на 2-е сутки после трансплантации. Об эффективности терапии судили по двум показателям: торможению роста опухоли (ТРО %), рассчитанному по отношению к группе контроля, а также по скорости роста опухоли, рассчитанной как соотношение средних объемов опухоли (V/V0) в разные сроки после лечения к начальному объему в каждой подопытной группе. Наблюдение за мышами продолжали до 17 сут после трансплантации. Объем опухолей измеряли на 7, 12 и 17-е сутки после трансплантации.
Препараты
Dcr (ООО «Фарминтерпрайсез») использован в виде субстанции-порошка белого цвета, растворимой в воде. Мышам вводили per os 0,065% раствор препарата в разовой дозе 4,5 мг/кг (суммарная доза 22,5 мг/кг).
ATRA (Sigma) использована в виде субстанции, которая представляет собой желтый порошок, хорошо \ растворимый в этаноле и оливковом масле. В опыте
применяли 0,006% спиртово-масляный раствор, который вводили мышам п/к в разовой дозе 0,3 мг/кг (суммарная доза 1,5 мг/кг).
) РФН в ампулах по 2,0 мл для парентерального вве-
дения предварительно разводили в физиологическом растворе до концентрации 1000 МЕ/мл и вводили мышам п/к в разовой дозе 10 тыс. МЕ/кг (суммарная доза 50 тыс. МЕ/кг).
Схема лечения
Мыши были разделены на 5 групп, которые получали:
1-я группа (контроль) — на 2-11-е сутки физиологический раствор п/к в объеме 0,2 мл/мышь;
2-я группа — Dcr на 2-6-е сутки, ATRA на 7-11-е сутки;
3-я группа — ATRA на 2-6-е сутки, Dcr на 7-11-е сутки;
4-я группа — Dcr на 2-6-е сутки, РФН на 7-11-е сутки;
5-я группа — РФН на 2-6-е сутки, Dcr на 7-11-е сутки.
Статистическую обработку результатов опыта выполняли с использованием стандартных методов вариационной статистики программы Microsoft Excel. Достоверность различий в исследовании определяли с помощью доверительного интервала, достоверными считали различия при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В группе контроля (табл. 2, рис. 1) на 7-е сутки после трансплантации гемобластоза средний объем п/к опухолевого узла достигал 268 (164-372) мм3, на 12-е сутки — Vcp=1975 (1126-2824) мм3 и на 17-е сутки — Vcp=2775 (1939-3611) мм3. При этом скорость роста опухоли выражается соотношением V/V0=7,4 и 10,4. Представленные данные показывают, что кривая роста опухоли без лечения имеет 2 составляющие: в течение 12 сут после трансплантации опухоль увеличивается почти до 8-кратного размера — экспоненциальная фаза роста, а в течение последующих 5 дней скорость роста опухоли замедляется, прирост к 17-м суткам не превышает 1,5-кратного размера—стабильная фаза роста.
Таблица 2
Эффективность комбинированной терапии эритролейкоза Френд дикарбамином, трансретиноевой кислотой или реафероном в разных сочетаниях и последовательности введения
Группа Разовая доза препаратов Суммарная доза препаратов Сутки терапии Средний объем опухоли, MMJ" WV. ТРО,%
Сутки после трансплантации опухоли
7-е 12-е 17-е 12-е 17-е 7-е 12-е 17-е
Контроль (физиологи- ческий раствор) 0,2 мл 2,0 мл 2-11-е 268 (164-372) 1975 (1126-2824) 2775 (1939-3611) 7,4 10,4
DCR, 2-6 ATRA, 7-11 4,5 мг/кг 0,3 мг/кг 22.5 мг/кг 1.5 мг/кг 2-6-е 7-11-е 93 (13-80) 1029 (509-1549) 1024 (46-2002) 11,1 11,0 65" 48 63
ATRA, 2-6 DCR, 7-11 0,3 мг/кг 4,5 мг/кг 1.5 мг/кг 22.5 мг/кг 2-6-е 7-11-е 109 (60-158) 1695 (827-2563) 2453 (669-4237) 15,6 22,5 59" 14 12
DCR.2-6 РФН, 7-11 4,5 мг/кг 10 тыс. МЕ/кг 22,5 мг/кг 50 тыс. МЕ/кг 2-6-е 7-11-е 96 (46-146) 1463 (885-2041) 1646 (697-2595) 15Д 17,1 64" 26 41
РФН, 2-6 DCR, 7-11 10 тыс. МЕ/кг 4,5 мг/кг 50 тыс. МЕ/кг 22,5 мг/кг 2-6-е 7-11-е 129 (40-218) 769 (372-1166) 921 (123-1719) 6,0 7,1 52 61 67”
* Средняя арифметическая с доверительным интервалом **р<0,05
Сутки после после трансплантации опухоли
Контроль Осг+АТЯА АТЯА+С)сг
-о-Рсг+РФН -о-РФН+ГХ*
Рис. 1. Эффективность комбинированной терапии эритролейкоза Френд Бег, ПТРК и РФН в зависимости от последовательности их введения
В группе Бсг+АТЯА (рис. 2, см. табл. 2) на 7-е сутки после трансплантации средний объем опухоли составил 93 (13-80) мм3, а на 12-е и 17-е сутки — 1029 (509-1549) и 1024 (46-2002) мм3 соответственно. Скорость роста опухоли выражается соотношением У/У0=11,1 и 11,0. Результаты комбинированного применения Осг+АТИА показывают, что через 24 ч после курса Бег ТРО=65 % (различие с контролем достоверно; р<0,05), а после курса АТЛА эффект снижается до ТРО=48 %. Через 5 дней после окончания комбинированного лечения в этой группе мышей эффективность регистрировалась на уровне ТРО=63 %, хотя различие с контролем в этот срок наблюдения не было достоверным. При этой комбинации длительность экспоненциальной фазы не изменилась, но после отмены Бег скорость роста относительно возросла. Эффективность комбинации Бсг+АТКА реализовалась стабилизацией роста опухоли, зарегистрированной после окончания курса Эсг.
Сутки после после трансплантаций опухоли
Контроль -^-Осг+АТЯА
Рис. 2. Динамика роста опухоли в контроле и в группе Бсг+АТЯА
В группе АША+Осг (рис. 3, см. табл. 2) средний объем опухоли на 7-е сутки после трансплантации был равен 109 (60-158) мм3, а на 12-е и 17-е сутки увеличивался до 1695 (827-2563) и 2453 (669-4237) мм3 соответственно. Скорость роста опухоли выражается уравнением \уУ0=15,6 и 22,5. Видно, что через 24 ч после окончания курса АША ТРО=59 % (р<0,05), а после курса Бег эффект снижался в 3 раза, ТРО=14-12 %. Скорость роста опухоли в этой группе сразу после комбинированного лечения возросла в сравнении с другими группами, применительно к контролю — в 2 раза. В результате при этой комбинации длительность экспоненциальной фазы не изменилась, хотя на фоне Бег скорость роста опухоли относительно увеличилась.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Сутки после после трансплантации опухоли
“^Контроль АТЯА+Осг
Рис. 3. Динамика роста опухоли в контроле и в группе АТЯА+Осг
В группе Бсг+РФН (рис. 4, см. табл. 2) на 7-е сутки после трансплантации средний объем опухоли возрастал до 96 (46-146) мм3, на 12-е сутки — до 1463 (885-2041) мм3 и на 17-е сутки — до 1646 (697-2595) мм3. Скорость роста опухоли выражается соотношением У/У0=15,2 и 17,1. Результаты лечения этой комбинацией показали, что после курса введения Осг ТРО=64 % (р<0,05). После курса введения РФН отмечена тенденция к снижению противоопухолевого эффекта, ТРО=26 % (р>0,05). Через 5 дней после окончания комбинированного лечения эффект не достиг значимой величины, ТРО=41 %. Скорость роста опухоли в этой группе на фоне введения Бег к 12-м суткам была выше контрольной почти в 2 раза и в течение 5 дней после окончания комбинированного лечения практически не менялась. Длительность экспоненциальной фазы соответственно оставалась прежней, хотя на фоне РФН скорость роста возросла.
В группе РФН+Осг на 7-е сутки после трансплантации средний объем опухоли был равен 129 (40-218) мм3, на 12-е сутки — 769 (372-1166) мм3, на 17-е сутки — 921 (123-1719) мм3. Скорость роста опухоли вы-
Сутки после после трансплантация опухоли
-Контроль
Рис. 4. Динамика роста опухоли в контроле и в группе Бсг+РФН
ражается соотношением У/У0=5,9 и 7,1 (рис. 5, см. табл. 2). У этих мышей на фоне комбинированного лечения ТРО=52-61 %. Через 5 дней после окончания комбинированного лечения эффект был выраженным и достоверным: ТРО=67 % (р<0,05). Анализ кривой скорости роста опухоли в этой группе показывает, что достигнута стойкая стабилизация процесса с уменьшением показателя в 1,5 раза в сравнении с контролем после окончания терапии.
Сутки после после трансплантации опухоли
-Контроль
Рис. 5. Динамика роста опухоли в контроле и в группе РФН+Бсг
Эффективность комбинации Бсг+РФН (Бег — первый) реализуется в основном за счет эффекта одного Бег, РФН ничего не добавляет к этому эффекту, что согласуется с данными литературы [4] и объясняется тем, что препараты а2-интерферона более эффективны при их применении в ранние сроки развития опухоли.
В случае введения РФН первым ингибирующий эффект пролонгируется на фоне введения Бег и удерживается на достоверном уровне дольше. В этом случае, видимо, важно, чтобы препараты, не имеющие определенной общей мишени для дифференцирующего действия, реализовали свой эффект строго в этой последовательности. Механизм этого взаимодействия требует углубленного изучения.
выводы
1. Эффективность АША или Бег в монорежиме при раннем лечении характеризуется достоверным кратковременным торможением роста опухоли на 59-65 % (р<0,05), а РФН не вызывает достоверного эффекта, ТРО=52 %.
2. Комбинации АТЯА+Бсг, Бсг+РФН в указанной последовательности применения не вызывают достоверного эффекта в течение 5 дней после лечения, ТРО<41 %.
3. При сочетании Бег и АТРА или РФН и Бег в указанной последовательности ингибирующий эффект удерживается в течение 5 дней после лечения на уровне ТР0=63-67 %.
4. Достоверный противоопухолевый эффект ТРО=67 % (р<0,05) получен при введении РФН на
2-6-е сутки и Бег на 7-11-е сутки после трансплантации ЭФ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеев Н. А. Клинические аспекты лейкопении, нейтропении и функциональных нарушений ней-трофилов. — СПб.: Фолиант, 2002. С. 19-42.
2. Волкова М. А., Ширин А. Д., Османов Д. Ш. и др. Возможности современной терапии острого промие-лоцитарного лейкоза // Современная онкология. — 2001. — Т. 3, № 2. — С. 52-55.
3. Грачева Л. Клиническая эффективность а-ин-терферона при злокачественных образованиях крови // РМЖ. — 1998. —Т.6,№ 1.
4.ДеВита В. Т., Хеллман С., Розенберг С. Биологические методы лечения онкологических заболеваний.
— М.: Медицина, 2002. С. 826-840.
5. Кадагидзе 3. Г. Цитокины // Практическая онкология. — 2003. — Т. 4, № 3. — С. 131-139.
6. Патент РФ № 2217196. — 2002 г.
7. Райхлин Н. Т., Небольсин В. Е., Желтухина Г. А. и др. Дифференцировка клеток меланомы человека под действием препарата дикарбамин (ультраструк-турное исследование) // Вопросы онкологии. — 2003.
— Т. 49, №3. —С. 351-357.
8. Райхлин Н. Т., Андронова Н. В., Седакова Л. А. и др. Действие препарата дикарбамин на дифференци-ровку опухолевых гемопоэтических клеток эритробла-стоза Френд (гистологическое и электронно-микро-скопическое исследование) // Вопросы онкологии. — 2004. — Т. 50, № 2. — С. 228-233.
9. Рафальский В. В. Клиническое применение препаратов интерферона: Справочное пособие. — Смоленская государственная медицинская академия, 1997.
10. Роит А.-М. Основы иммунологии.—М.: Мир, 1991.
11. Рукавщын О. А. Роль иммунотерапии в лечении больных заболеваниями крови // Вопросы онкологии. — 2002. — Т. 48, № 2. — С. 186-192.
12. Савченко В. Г., Паровичникова Е. Н. Лечение острых лейкозов (клиническое исследование). — М.: МЕДпресс-информ, 2000. — 224 с.
13. Сотирис К., Альпидовский В. К, Семенова Е. А. Механизмы действия интерферона при лечении хронического миелолейкоза // Вестн. Рос. у-та Дружбы народов. — Серия «Медицина». — 1999. — № 1. — С. 115-117.
14. УтешевД. Б., Коростелев С. А., Сторожаков Г. И я др. Ретиноевая кислота как фактор дифферен-
цировки клеток гемопоэза // Современная онкология.
— 2001. — Т. 3, № 2. — С. 48-51.
15. Kabat D. Molecular biology of Friend viral ery-throleukemia // Curr. Top Microbiol. Immunol. — 1989.
— Vol. 148, —P. 1-42.
16. ChabnerB. A., LongoD. L. Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice. 3rd ed. — Philadelphia: Lippincott — Raven, 2001. P. 678-699.
17. Mehta K. Retinoids as regulators of gene transcription // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. — 2003. — Vol. 17, No. 1. —C. 1-12.
18. Friend C. Cell-free transmission in adult Swiss mice: a disease having the character of leukemia // J. Exp. Med. — 1957. —Vol. 105. —P. 307-318.
