CC BY
40
УДК 615.2/.3.015:616-006.432:537.533.35
N. T. Rajkhlin1, N. V. Andronova1, L. A. Sedfakova1, S. Sh. Gadzhieva1, E. A. Smirnova1,
N. K. Vlasenkova1, E. M. Treschalina1, V. E. Nebolsin2
THE DRUG DICARBAMIN CAUSES DIFFERENTIATION OF ERYTHROBLASTOSIS FRIEND TUMOR CELLS WITH THE FORMATION OF LYMPHOID, MYELOID AND ERYTHROID ELEMENTS
1 N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
2 OJSC “Pharmenterprises ”, Moscow
ABSTRACT
Previous studies demonstrated that the new drug Dicarbamin, which is a pseudopeptide belonging to the aminoacyl amine derivatives, can cause differentiation of experimental mouse melanoma tumor cells and have hemoprotective effect on bone marrow cells in patients receiving chemotherapy. The present study is aimed to investigate Dicarbamin effect on hemopoetic tumor cells of erythroblastosis Friend.
Erythroblastosis Friend was obtained as solid tumors in the result of subcutaneous mouse spleen cells transplantation in DBA2 female mice from the mice bearing this disease. Dicarbamin was administrated daily 5 times starting from 3d day after cell administration. Mice were slaughtered within days 3 to 14 after the last drug administration.
Histological and electronic microscopic analysis revealed the ability of Dicarbamin to increase differentiation of non-mature hemopoetic tumor cells of erythroblastosis Friend in different directions, in particular, with the formation of lymphoid and myeloid tumor cells of different maturation level. It was also shown that Dicarbamin slightly inhibits apoptosis in hemopoetic tumor cells of erythroblastosis Friend.
Therefore, on the basis of erythroblastosis Friend model it was demonstrated that Dicarbamin is an inducer of differentiation not only in normal hemopoetic bone marrow cells, which had been shown earlier in cancer patients receiving chemotherapy, but also has the similar effect on hemopoetic tumor cells.
Key words: Dicarbamin, erythroblastosis Friend, electronic microscopic analysis, differentiation of tumor cells.
H. Т. Райхлин1, H. В. Андронова1, JJ. А. Седакова1, С. Ш. Гаджиееа1, Е. А. Смирнова1,
Н. К. Власенкова1, E. М. Трещалина1, В. Е. Небольсин2
ПРЕПАРАТ ДИКАРБАМИН ВЫЗЫВАЕТ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЭРИТРОБЛАСТОЗА ФРЕНД С ОБРАЗОВАНИЕМ ЭЛЕМЕНТОВ ЛИМФОИДНОГО МИЕЛОИДНОГО И ЭРИТРОИДНОГО РЯДА
1 ГУ РОНЦ им. H. Н. Блохина РАМН, Москва 2 ООО «Фарминтерпрайсез», Москва
РЕЗЮМЕ
В предыдущих исследованиях была установлена способность нового препарата дикарбамин, представляющего собой псевдопептид из ряда аминоацильных производных аминов, вызывать дифференцировку опухолевых клеток экспериментальной меланомы мышей и оказывать гемопротекторное действие на клетки костного мозга у больных при химиотерапии. Учитывая эти результаты, задачей данного исследования явилось изучение влияния дикарбамина на опухолевые гемопоэтические клетки эритробластоза Френд.
Материалом для исследования послужил эритробластоз Френд в виде солидных опухолей, полученных в результате подкожной прививки клеток селезенки мышей, больных этим заболеванием, мышам-самкам ДВА2. Дикарбамин вводили 5 раз, ежедневно, начиная с 3-го дня после прививки. Животных забивали в период с 3-го по 14-й день после окончания введения препарата.
Гистологическое и электронно-микроскопическое исследования позволили установить, что дикарбамин обладает способностью усиливать дифференцировку незрелых опухолевых гемопоэтических клеток эритробластоза Френд в разных направлениях, в частности с образованием опухолевых клеток лимфоидного и миелоидно-
го ряда разной степени зрелости. Дикарбамин также, как оказалось, незначительно ингибирует апоптоз в опухолевых гемопоэтических клетках эритробластоза Френд.
Таким образом, на примере изучения эритробластоза Френд установлено, что препарат дикарбамин является индуктором дифференцировки не только нормальных гемопоэтических клеток костного мозга, что было показано ранее у онкологических больных при химиотерапии, но и оказывает подобное действие на опухолевые гемопоэтические клетки.
Ключевые слова: дикарбамин, эритробластоз Френд, электронная микроскопия, дифференцировка опухолевых клеток.
ВВЕДЕНИЕ
Вирус Френд впервые был выделен в 1956 г. [13, 14] из асцитной карциномы Эрлиха мышей линии Swiss. При введении бесклеточного фильтрата, содержащего этот вирус, новорожденным мышам линии Swiss у них развивается синдром, получивший название эритробластоз или, точнее, эритролейкемия.
При этом синдроме у мышей резко увеличиваются селезенка и печень, а в периферической крови отмечается большое количество эритробластов, миелоблас-тов, анормальных лейкоцитов. Инфильтраты в селезенке и печени имеют такой же клеточный состав. Суспензия клеток или бесклеточный фильтрат селезенки больных мышей при инокуляции здоровым взрослым животным также вызывает у них этот синдром, и мыши погибают за 2-3 мес.
Важное отличие лейкемии (обычной или индуцированной, например вирусом Gross) от синдрома Френд в том, что при первой развиваются типичная бластная лимфоцитарная или миелоидная лейкемия, опухоль в тимусе, генерализация процесса в различных органах, в т. ч. в селезенке и печени, поражаются лимфатические узлы [12].
Однако следует подчеркнуть, что клеточный состав эритробластоза Френд может варьировать, в частности, от вида животных, их возраста, линии и других причин. Так, инокуляция фильтрата, содержащего вирус Френд, или клеточной суспензии селезенки больных животных мышам линии С57 BL/6 вызывает у них типичную лимфоцитарную или миелоидную лейкемию с генерализацией процесса, а не эритробластоз Френд [12]. То же самое происходит при заражении крыс: у всех животных развивается типичная бластная, лимфоцитарная или миелоидная лейкемия с поражением тимуса, различных органов, лимфатических узлов.
Следовательно, потенциальная способность вируса Френд не ограничивается только развитием синдрома эритробластоза, она значительно шире и может при определенных условиях давать начало возникновению различных вариантов типичной лейкемии.
В механизме развития эритролейкемии Френд важное значение имеет ген, кодирующий мембранный гликопротеин qp55, активирующий рецепторы к эрит-ропоэтину. qp55 экспрессируется на поверхности эритробластов и, являясь митогеном, обладает способностью вызывать поликлональную пролиферацию клеток
и оказывать влияние на их дифференцировку и иммор-тализацию, особенно при ассоциации с соответствующими хелперами [15-18].
Установлено, что первичная мишень вируса Френд — эритробласты. Лимфоидные и миелоидные клетки инфицируются позже [11]. Это одна из причин, почему острый эритробластоз может прогрессировать в эритролейкемию.
Существуют несколько вариантов вируса Френд, обладающих различной онкогенной активностью [11].
В то же время чувствительность к вирусу Френд также регулируется многими факторами хозяина. В частности, мыши С57 BL/6 и ряд других вариантов им-бредных мышей этой линии обладают резистентностью к развитию эритробластоза благодаря активности гена Fv-2 (точнее, Fhe), но они чувствительны к развитию лимфоидной или миелоидной лейкемии, что обусловлено активностью других генов (Fv-1, Fv-4, Rfv-3, Н-2, Rmcf) [18-20].
Важно подчеркнуть, что опухолевые гемопоэтические клетки эритробластоза Френд сохраняют способность дифференцироваться в различных направлениях с образованием элементов эритроидного, лимфоидного или миелоидного ряда. Это делает эритробластоз Френд удобной моделью для изучения различных индукторов дифференцировки.
Задача данной работы — исследование на примере эритробластоза Френд влияния на дифференцировку опухолевых гемопоэтических клеток нового препарата дикарбамин, впервые синтезированного на кафедре химии и технологии тонких органических соединений МИТХТ им. М. В. Ломоносова и предложенного в виде пероральной лекарственной формы в ООО «Фарминтерпрайсез» [3, 4]. Индукция дифференцировки опухолевых клеток является одним из ведущих механизмов стабилизации роста ряда новообразований, повышения эффекта химиотерапии, коррекции гемопоэтической токсичности препаратов и регуляции других клинико-биологических свойств опухолей.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Материалом для работы послужил эритробластоз Френд в виде солидных опухолей, полученных в результате подкожной прививки клеток селезенки мышей, больных этим заболеванием, мышам-самкам линии ДВА2. Дикарбамин в дозе 4,5 мг/кг вводился per os
ежедневно, всего 5 раз, начиная с 3-го дня после прививки опухоли. Материал для исследования брали для световой микроскопии на 3, 7, 10 и 14-й день после окончания введения дикарбамина или физиологического раствора, для электронной микроскопии — на 7-й и 14-й день. Было проведено две серии опытов. 1-я серия — контрольные животные без лечения, вводился физиологический раствор, 2-я серия — введение дикарбамина. В каждой серии были группы животных, забитые соответственно на 3, 7, 10 и 14-й день.
Для гистологического исследования кусочки опухоли фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин, полученные срезы окрашивали гематоксилин-эозином, на гликоген (полисахариды) с помощью ШИК-реакции, на содержание РНК по Браше, на липиды и железо. Срезы просматривали и фотографировали в световом микроскопе «Поливар» (Австрия).
Для электронно-микроскопического исследования кусочки опухоли фиксировали в 2,5% растворе глута-ральдегида и 1% четырехокиси осмия, заливали в ЭПОН-812. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультратоме ЛКБ-Ш (Швеция). Полученные полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим и просматривали в световом микроскопе. Ультратонкие срезы докрашивали уранил ацетатом и цитратом свинца, просматривали и фотографировали в электронном микроскопе «ДЖЕОЛ 1200 ЕХ-П» (Япония).
Для количественной оценки при электронно-микроскопическом исследовании просчитывали в процентах на 100 клеток число клеток различных типов диф-ференцировки (бластные клетки, лимфоциты и гранулярные лейкоциты).
При гистологическом исследовании оценивали количество митозов и апоптозно измененных клеток на 100 клеток (в %), а также площадь некрозов ко всей поверхности среза (в %).
РЕЗУЛЬТАТЫ
1-я серия. Контрольные животные
При гистологическом исследовании (рис. 1, а, б) обнаружено, что опухолевые клетки крупные, полиморфные, ядра их светлые, цитоплазма развита умеренно. Размер клеток иногда варьирует, встречаются отдельные более мелкие клетки, но основная масса клеток — крупные. Опухолевые клетки образуют сплошные разрастания. В отдельных опухолях встречаются участки некроза, окружающие сохранившиеся поля опухолевых клеток. Площадь некрозов не превышала 10-15 % поверхности среза. В большинстве опухолевых клеток реакция Браше на РНК сильно выражена (рис. 1, в), реже — слабая или отсутствует (в отдельных мелких клетках). ШИК-реакция имела диффузный характер (рис. 1, г), реакция на железо была положительной лишь в единичных клетках. В опухоли среди крупных клеток встречались митозы (до
1-1,5 %) и клетки с признаками апоптоза (до 0,5 %). По мере роста опухоли увеличивалась площадь некрозов до 20-30 % поверхности среза, повышалось количество митозов (до 1,5-2 %), активность апоптоза не
изменялась. Количество крупных полиморфных клеток значительно преобладало во все сроки.
При электронно-микроскопическом исследовании (рис. 1, д-з) в опухоли обнаружены главным образом крупные полиморфные низкодифференцированные клетки бластного типа. Ядра в этих клетках округлой или несколько неправильной формы, иногда с неровной поверхностью. Хроматин в них обычно распределен диффузно, лишь в некоторых отмечается образование расположенного маргинально гетерхроматина. Ядра занимают обычно большую часть цитоплазмы, в которой преобладают рибосомы, единичные митохондрии, иногда — структуры шероховатого эндоплаз-матического ретикулума. Бластные клетки составляют 90-95 % всей популяции опухоли. Кроме бластных клеток в опухоли встречаются лимфоциты различной степени зрелости — лимфобласты, лимфоциты (крупные, средние, мелкие). Ядра в этих клетках округлые, овальные, часто с неровной поверхностью, содержат гетерохроматин в виде крупных скоплений, встречаются ядрышки. Цитоплазма развита умеренно, в ней много рибосом, других органелл мало, иногда встречаются плотные гранулы. Гранулярные лейкоциты мелкие, в цитоплазме видны гранулы, характерные для нейтрофилов, реже — эозинофилов. Ядра в клетках сегментированные или с глубокими втяжениями. Иногда видны клетки с гранулами в цитоплазме, неправильным ядром и выпячиваниями в виде отростков плазматической мемебраны (моноциты). Встречаются свободно лежащие эритроциты. В опухоли преобладают главным образом крупные бластные клетки (до 90-95 %). Лимфоидные клетки встречаются в 4-8 % случаев, гранулярные лейкоциты составляют 1-2 %. Существенных сдвигов в соотношении клеток различных типов по мере роста опухоли после прививки не отмечалось.
2-я серия. Введение дикарбамина
При гистологическом исследовании (рис. 2, а, б) отмечается увеличение количества мелких опухолевых клеток с гиперхромными ядрами. Количество крупных полиморфных клеток значительно преобладает. Площадь некрозов существенно не изменялась по сравнению с картиной в 1-й серии. Митотическая активность также оставалась в пределах контрольных цифр. Частота апоптоза на 3-й и 7-й день несколько снижалась (до 0,1-0,5 % на 7-й день).
Электронно-микроскопическое исследование (рис. 2, в-ё) выявило, что ультраструктурное строение опухолевых клеток различных типов остается прежним. Изменяется их количественное соотношение, и несколько повышается уровень дифференцировки. Количество крупных клеток бластного типа снижается до 70-80 %, количество лимфоцитов и гранулоцитов увеличивается соответственно до 18-25 и 2-5 %. В опухоли встречаются отдельные эритроциты. Наиболее постоянно обнаруживаемые изменения наблюдаются на 7-й день после окончания лечения.
Общие результаты исследования суммированы в таблице.
йР®*
ж ^
Рис. 1. Гистологическое (а-г) и ультраструктурное (д—з) исследование клеток эритробластоза Френд. Контроль:
а — разрастание крупных полиморфных опухолевых клеток бластного типа. Видно 5-6 митозов, х400; б — в центре видна клетка с признаками апоптоза. Опухоль состоит из полиморфных клеток, х400; в — положительная реакция Браше в бластных клетках, х400, г — диффузное распределение гликогена в опухолевых клетках. ШИК-реакция, х400; д — низкодифференцированные бластные клетки с крупными ядрами и диффузным распределением хроматина. Одна клетка с тонким слоем гетерохроматина (лимфобласт). Электроннограмма, хбООО; е — бластная низкодифференцированная клетка, лимфобласт (с гетерохроматином) и эритроциты. Электроннограмма, х8000; ж — низкодифференцированные бластные клетки и один лимфобласт с гетерохроматином Виден эритроцит. Электроннограмма, хЗООО; з — низкодифференцированные бластные клетки. В центре лимфобласт. Электроннограмма, х2000
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Препарат дикарбамин представляет собой псевдопептид 4-(3[2-(имидазол)-4-ил-]-карбамоил) масляную кислоту из ряда аминоацильных производных биогенных аминов [3, 4]. В ряде предыдущих исследований [5-10] была установлена способность дикарбамина
индуцировать дифференцировку опухолевых клеток экспериментальной меланомы [7], модифицировать токсичность циклофосфамида [10], снижать активность апоптоза гемопоэтических клеток, развивающегося под воздействием химиопрепаратов [9], оказывать влияние на пролиферативную активность [2, 5, 7], а также вызывать дифференцировку гемопоэтических
Рис. 2. Гистологическое (а, 6) и ультраструктурное (е-е) исследование клеток эритробластоза Френд после введения дикарбамина:
а — участок опухоли с преобладанием крупных полиморфных клеток бластного типа, х400; б — в опухоли наряду с бластными крупными клетками много мелких округлых опухолевых клеток, х400; в — крупная недифференцированная бластная клетка, два малых лимфоцита и один лимфобласт, х5000; г — несколько опухолевых клеток лимфоидного ряда (средних лимфобластов). Ядра содержат обильно развитый гетерохроматин, х8000; д — опухолевые клетки миелоидного ряда — нейтрофил с сегментированным ядром и полиморфными гранулами в цитоплазме, х10 ООО; е — опухолевая клетка с начальными признаками апоптоза — агрегация и маргина-ция гетерохроматина в виде полулуния под ядерной мембраной. Рядом неправильной формы эритроцит, х15 ООО
Характеристика действия дикарбамина на опухолевые гемопоэтические клетки эритробластоза Френд
клеток костного мозга и оказывать гемопротекторное действие у больных при проведении цитотоксической химиотерапии [1, 6].
Гистологическое и электронно-микроскопическое изучение действия дикарбамина на опухолевые гемопоэтические клетки эритробластоза Френд показало, что этот препарат является индуктором дифференци-ровки не только нормальных гемопоэтических клеток, но и опухолевых.
У контрольных животных опухоли состояли в основном из крупных полиморфных бластных клеток (до 90-95 %) и небольшого количества клеток с признаками лимфоидной (4-8 %) и миелоидной (1-2 %) дифференцировки. В опухоли также присутствуют эритроциты.
Дикарбамин, введенный мышам с эритробласто-зом Френд per os в дозе 4,5 мг/кг ежедневно в течение 5 дней, как установлено, вызывает дифференцировку незрелых опухолевых клеток, главным образом, в направлении образования лимфоидных элементов различного уровня созревания и, в меньшей степени, в сторону образования гранулоцитов, а также клеток эритроидного ряда. По сравнению с опухолями контрольных животных количество незрелых опухолевых клеток при приеме дикарбамина снижалось с 90-95 до 70-80 %, т. е. на 15-20 %, а количество лимфоцитов увеличивалось с 4-8 до 18-25 %, т. е. в 4 раза. Менее значительно было повышение количества клеток гра-нулоцитарного ряда (соответственно с 1-2 примерно до 2-5 %).
Следует подчеркнуть, что наиболее выраженные изменения были обнаружены на 7-й день после окончания лечения, на 14-й день эти изменения стабилизировались.
Апоптоз практически оставался на уровне контрольных цифр и не усиливался, что, возможно, связано с ингибирующим влиянием дикарбамина на программированную клеточную смерть, которое было ус-
тановлено ранее при изучении костного мозга в условиях введения животным циклофосфана и дикарбамина [9] и при лечении больных на фоне дикарбамина [1, 6]. Вероятно, это также связано с генетической особенностью мышей линии ДВА2 [6], которые были использованы в данной работе.
Таким образом, установлено, что дикарбамин способен усиливать дифференцировку незрелых опухолевых гемопоэтических клеток эристобластоза Френд в разных направлениях, в частности с образованием опухолевых клеток лимфоидного и миелоидного ряда разной степени зрелости. Кроме того, дикарбамин, как оказалось, незначительно ингибирует апоптоз в опухолевых гемопоэтических клетках эритробластоза Френд.
ЛИТЕРАТУРА
1. Махонова Е. В., Гершанович М. Л. Дикарбамин как протектор лейкопоэза и гранулоцитопоэза при комбинированной химиотерапии гемзаром и препаратами платины у больных с рецидивами рака яичников // Рос. биотерап. журн. — 2003. — Т. 2, № 1, —С. 57.
2. Мещерикова В. В., Трещалина Е. М., Небольсин В. Е. Действие дикарбамина на пролиферативную активность клеток меланомы на фоне введения интерферона // Рос. биотерап. журн. — 2003. — Т. 2, № 1. — С. 33.
3. Небольсин В. Е. Синтез и изучение свойств низкомолекулярных биологически активных пептидов и их производных: Автореф. дис... канд. мед. наук. — М., 1999. — 25 с.
4. Небольсин В. Е., Гарин А. М., Горбунова В. А. и др. Патент РСТ: Способ индукции дифференцировки клетки. — МПК 7 А61 К 38/05 № 2420-30039 Я и/042 от 06.08.2001 г.
5. Николаева Т. Г., Добрынин Я. В., Брызгалов И. П. и др. Изучение действия препарата дикарбамина на кинетику популяции опухолевых клеток // Рос. биотерап. журн. — 2003. — Т. 2, № 1. — С. 34.
6. Райхлин Н. Т., Горбунова В. А., Гарин А. М. я др. Индукция дифференцировки гемопоэтических клеток дикарбамином у больных в условиях миелосупрессив-ной химиотерапии (электронно-микроскопическое исследование) // Рос. биотерап. журн. — 2003. — Т. 2, №1. —С. 34.
7. Райхлин Н Т., Небольсин В. Е., Желтухина Г. А. и др. Дифференцировка клеток меланомы человека под действием препарата дикарбамин (ультразвуковое исследование) // Вопросы онкологии. — 2003. — № 3.
— С. 231-258.
8. Райхлин Н. Т., Трещалина Е. М., Седакова Л. А. и др. Действие дикарбамина на дифференцировку клеток эритробластоза Френд (гистологическое и элек-тронно-микроскопическое исследование) // Рос. биотерап. журн. — 2003. — Т. 2, № 1. — С. 37.
9. Райхлин Н. Т., Трещалин И. Д., Бодягин Д. А. и др. Защита препаратом дикарбамин гемопоэтических клеток костного мозга от апоптоза, развивающегося в экспериментальных условиях под воздействием
Характер действия 1-я серия — контроль 2-я серия — дикарбамин
День после окончания лечения
Тип опухолевых клеток Электронная микроскопия
7-й 14-й 7-й 14-й
Властные, % 90-95 90-95 70-80 70-80
Лимфоидные, % 4-8 4-8 18-25 18-25
Гранулярные лейкоциты, % 1-2 1-2 2-5 2-5
Изменения Световая микроскопия
3-й 7-й 14-й 3-й 7-й 14-й
Митозы, % 1-1,5 1-1,5 1,5-2 1-1,5 1-1,5 1,5-2
Апоптоз, % 0,5 0,5 0,5 0,2-0,5 0,1-1,5 0,2-0,5
Площадь некрозов, % 10-15 15-20 20-30 10-15 15-20 20-30
циклофосфана (морфологическое исследование) // Рос. биотерап. журн. — 2003. — Т. 2, № 1. — С. 36.
10. Трещалин И. Д., Небольсин В. Е., Бодягин Д. А. и др. Витам — новый модификатор токсичности циклофосфамида // 2-й съезд онкологов. — Экспериментальная химиотерапия. — Киев, 1999.
— С. 289.
11. Bruland Т., Dai Y, Lavik L., Dalen A. Early dissemination rates of Friend murine leukemia virus variants correlate with late pathogenesis // APMJS. — 2002. — Dec. — Vol. 110, No. 12. — P. 899-912.
12. Gross L. The Friend Virus // Oncogenic viruses. — 1970. — Vol. 14. — P. 553-587.
13. Friend Ch. The isolation of virus causing a malignant disease of the hematopoietic systems in adult Swiss mice // Proc. Am. Assoc. Cancer Research. — 1956. — Vol. 2. —P. 106.
14. Friend Ch. Cell free transmission in adult Swiss mice of a disease having the character of leukemia // J. Exp. Med. — 1957. — Vol. 105. — P. 307-318.
15. Hoatlin M., Ferro E, Kozak S., Kabat D. A Friend virus mutant encodes a small glicoprotein that causes ery-throleukemia // J. Virol. — 1994. — Vol. 68, No. 6. — P. 4053-4056.
16. Kabat D. Molecular biology of Friend viral ery-throleukemia // Curr. Top. Microbiol. Immunol. — 1989.
— Vol. 148, —P. 1-42.
17. Kitagawa M., Yamaguchi S., Hasegawa M. et al. Friend leukemia virus, infection enhanced DNA damage-induced apoptosis of hematopoietic cells causing lethal anemia in C3H hosts // J. Virol. — 2002. — Vol. 76, No.
15. —P. 7790-7798.
18. Silver J. Role of mink cell focus-inducing virus // J. Virol. — 1984. — Vol. 50, No. 3. — P. 872-877.
19. Silver J., Fredrickson T. A new gene that controls the type of leukemia induced by Friend murine leukemia virus // J. Exp. Med. — 1983. — Vol. 158, No. 2. — P. 493-505.
20. Silver J., Fredrickson T. Susceptibility to Friend helper virus leukemia in CXB recombinant inbred mice // J. Exp. Med.— 1983. —Vol. 158, No. 5. —P. 1693-1702.
