CC BY
5
и проводили гибридизацию на микрочипах Human-Ref-12 (Illumina, США). Данные анализировали с помощью программного обеспечения GenomeStudio (Gene Expression Module v1.5.4, Illumina). Для оценки экспрессии генов, участвующих в эпигенетической регуляции, использовали базу данных www.epifactors.autosome.org.
Наибольший эффект гипоксического культивирования наблюдался при 3% О2: из 34686 генов изменялась экспрессия 4707 генов, при 1% — 3423 генов, при 5% — 2971 генов. Наиболее количество генов, участвующих в эпигенетической регуляции функций клетки, изменяло транскрипционную активность также при 3% О2 — 180 генов; при 1% — 101 ген; при 5% — 79 генов. Наибольшую долю среди них составляли гены, мишенями которых являются гистоны. В меньшем количестве были представлены гены, взаимодействующие с хроматином/ДНК. Самую малую группу составляли гены, воздействующие на РНК.
В условиях 3% О2 по сравнению с нормоксией снижалась представленность генов, участвующих в регуляции гистонов, и увеличивалась — для генов, регулирующих хроматин/ДНК, а также РНК. Культивирование при 1% и 5% О2 наоборот снижало по сравнению с 20% О2 представленность генов, регулирующих РНК; для генов, регулирующих хроматин/ДНК — представленность снижалась (при 1 % О2) либо не изменялась (при 5% О2); для генов, регулирующих гистоны — повышалась (при 1% О2) или не изменялась (при 5% О2).
Таким образом, при 3% О2 МСК отвечают изменением экспрессии большего количества генов по сравнению с 1% и 5% О2, при этом задействовано больше генов, участвующих в эпигенетической регуляции. Представленность генов, воздействующих на различные мишени в эпигенетическом ответе МСК на разный уровень гипоксии, может отличаться в зависимости от уровня О2.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 22-25-00749
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПРОИЗВОДНЫХ ИПСК К АУТОЛОГИЧНЫМ NK-КЛЕТКАМ ОБУСЛОВЛЕНА ДИСБАЛАНСОМ ЭКСПРЕССИИ ЛИГАНДОВ К АКТИВИРУЮЩИМ И ИНГИБИРУЮЩИМ РЕЦЕПТОРАМ NK-КЛЕТОК
М.Е. Богомякова1, 2, Е.К. Секретова1, 2, К.С. Ануфриева1, П.О. Хабарова2, А.Н. Казакова1, П.А. Бобровский1, Т.В. Григорьева3, А.Н. Богомазова1, М.А. Лагарькова1, 2
1 ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА России, Москва, Россия
2 МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
3 Казанский федеральный университет, Казань, Россия
e-mail: margbog@rcpcm.org
Ключевые слова: аутологичные ИПСК, дифференцировка, HLA-I, бета-2-микроглобулин, иммуногенность, иммунотоле-рантность, NK-клетки
Клеточная терапия на основе индуцированных плюри-потентных стволовых клеток (ИПСК) в настоящее время проходит стадию клинической апробации. Использование пациент-специфических ИПСК теоретически может обеспечить персонализированную терапию благодаря их главному преимуществу — иммунотолерантности.
Однако некоторые группы исследователей сообщают, что аберрантная экспрессия генов, сопровождаемая изменениями протеома и образованием неоантигенов, может приводить к распознаванию производных ИПСК ау-тологичными Т-клетками [1,2]. Между тем, возможность активации NK-клеток ранее не рассматривалась.
Наше исследование посвящено изучению NK-клеточного ответа при сокультивировании с различными производными ИПСК. Используя изогенную клеточную модель, состоящую из исходных фибробластов и фибробластоподобных производных (iPS-fibro), мы показали, что клетки, дифференцированные из ИПСК, вызывают высокий уровень дегрануляции и цитоток-сичности NK-клеток. В то же время производные ИПСК с нокаутом гена B2M, лишенные молекул HLA-I, не вызывали дополнительного увеличения активации NK-клеток. С помощью транскриптомного анализа мы выявили значительный дисбаланс NK-клеточных лигандов в iPS-fibro. По сравнению с исходными соматическими клетками в производных ИПСК повышена экспрессия лигандов к семейству активирующих рецепторов DNAM-1 и NKG2D и снижена экспрессия молекул HLA-I, основных ингибирующих лигандов NK-клеточных рецепторов. Причиной недостатка ингибирующих сигналов в iPS-fibro может быть недостаточная зрелость клеток, дифференцированных из ИПСК. Длительное культивирование и пассирование iPS-fibro или предварительная обработка клеток IFNy повышает экспрессию HLA I класса, что возвращает баланс лигандов в равновесное состояние и снижает дегрануляцию и цитотоксичность NK-клеток. В этой связи неполная иммунологическая толерантность к аутологичным клеткам, полученным из ИПСК, должна приниматься во внимание при использовании клеточных продуктов, дифференцированного из ИПСК, в целях регенеративной медицины. Работа поддержана грантами РФФИ #20-315-90041 и #19-29-04113-мк.
Литература:
1. Zhao T., Zhang Z.N., Rong Z., Xu Y. Nature. 2011. V. 474(7350).
P. 212-215.
2. Zhao T., Zhang Z.N., Westenskow P.D. et al. Cell Stem Cell.
2015. V. 17(3). P. 353-359.
СРАВНЕНИЕ СПОСОБОВ МОДИФИКАЦИИ КУЛЬТУРЫ МСК ДЛЯ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ ГИАЛИНОВОГО ХРЯЩА
М.С. Божокин1 2, С.А. Божкова2, Ю.В. Сопова1, 3, М.Г. Хотин1
1 Институт цитологиии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 НМИЦ травматологии и ортопедии
им. Р.Р. Вредена, Санкт-Петербург, Россия
3 Центр трансгенеза и редактирования генома Института трансляционной биомедицины, Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: writeback@mail.ru
Ключевые слова: гиалиновый хрящ, клеточно-инженерная конструкция, невирусная модификация клеток, фотобиости-муляция, TGF-p3, трансфекция
Гиалиновый хрящ обладает ограниченными регенеративными способностями [1]. Применение клеточно-инженерных конструкций (КИК) с модифицированными клетками является одним из перспективных методов его восстановления [2]. Ключевой этап разработки
подобной технологии состоит в выборе метода модификации клеточной культуры [3]. В работе проведено сравнение эффективности применения принципиально различных невирусных методов модификации первичной культуры мезенхимных стромальных клеток (МСК) крысы по их влиянию на дифференцировку МСК в хондро-генном направлении.
В качестве агентов для модификации МСК использовали: рекомбинантный белок TGF-ß3, фотобиости-муляцию низкоинтенсивным лазерным излучением 632,8 нм, а также экспрессионную плазмиду с геном tgfß3. Трансфекцию проводили при помощи препарата Lipofectamin3000. При помощи проточной цитометрии на приборе BD FACS Aria III определяли: эффективность трансфекции и % жизнеспособных клеток, из чего делали вывод о цитотоксичности различных методов. Анализ эффективности модификации клеточной культуры проводили: по изменению экспрессии генов, ассоциированных с дифференцировкой в хондрогенном направлении — sox9, tgfß3, acan, coi2a1.
Эффективность трансфекции МСК плазмидой была <5%, а цитотоксичность высокой >75%. Не наблюдали цитостатического при использовании фотобиостимуля-ции или добавлении к культуре рекомбинантного белка. При этом, модификация этими методами оказывала выраженное действие на хондрогенную дифференцировку МСК, значительно увеличивая экспрессию основных генов хондрогенеза (col2a1>60х, sox9>80x, tgfß3>1000x).
Таким образом, использование белка TGF-ß3 или фо-тобиостимуляции являются наиболее перспективными методами для модификации МСК при клеточной инженерии гиалинового хряща ввиду своей эффективности и отсутствия цитотоксичности.
Литература:
1. Carballo C.B., Nakagawa Y., Sekiya I., Rodeo S.A. Clin. Sports Med. 2017, 36, p.413-425.
2. Roseti L., Desando G., Cavallo C., et al. Cells, 2019, 8, p.1305.
3. Shestovskaya M.V., Bozhkova S.A., Sopova J.V. et al. Biomedi-cines, 2021, 9, p 1666.
МЕХАНИЗМЫ УЧАСТИЯ УРОКИНАЗНОГО РЕЦЕПТОРА В РЕПРОГРАММИРОВАНИИ КЛЕТОК ОПУХОЛЕВОЙ СТРОМЫ
В.С. Бойченко1, П.С. Климович1, 2, А.А. Щипова1, К.А. Рубина1, Е.В. Семина1
1 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Институт экспериментальной кардиологии, НМИЦК им. Е.И. Чазова, Москва, Россия
e-mail: beroniko99@gmail.com
Ключевые слова: урокиназный рецептор, урокиназная система, система активаторов плазминогена, опухолевая строма, внеклеточные везикулы, экзосомы, нейробластома
Высокий уровень экспрессии урокиназы и ее рецептора (uPAR) связан c опухолевой прогрессией и риском развития метастаз, что позволяет рассматривать уро-киназную систему как перспективную мишень для подавления роста опухоли [1]. Клетки опухоли способны изменять свое микроокружение за счёт образования внеклеточных везикул, содержащих сигнальные белки, микроРНК и транскрипционные факторы, вызывающие ее химиорезистентность и метастазирование. Высокие уровни экспрессии белков урокиназной системы
в экзосомах опухолевых клеток позволяют предполагать их роль в перерождении окружающей стромы и активации метастазирования, опосредованной внеклеточными везикулами [2].
В работе изучали влияние везикул опухолевых клеток на изменение транскрипционной активности фибробла-стов. Собирали везикулы с клеток мышиной нейробла-стомы Neuro 2A дикого типа (N2A WT) и N2A с подавленной экспрессией uPAR (N2A-Plaur-/-), сокультивировали с фибробластами 48 часов, после чего проводили оценку уровня экспрессии мРНК маркеров активированной стромы (MMP2, MMP9, IL6, MCP1, mTOR, p53).
Было обнаружено, что добавление везикул от N2A WT достоверно повышает экспрессию мРНК mTOR, MMP2 и p53 в мышиных фибробластах по сравнению с контрольной средой (р<0,05), тогда как сокультиви-рование с везикулами от N2A-Plaur-/- такого эффекта не вызывает. В тоже время везикулы от N2A-Plaur-/-подавляли экспрессию MMP9 по сравнению с контрольной средой (р<0,05), везикулы же дикого типа не оказывали такого влияния. Оба типа везикул повышали экспрессию генов IL6 и MCP1 и достоверно не отличались.
Таким образом, можно предположить, что нокаут гена Plaur приводит к изменению состава везикул, что влияет на транскрипционную программу фибробластов и понижает проопухолевое действие везикул. Это открытие привлекает внимание к дальнейшему изучению механизмов участия урокиназной системы в перепрограммировании клеток стромы опухоли. Работа выполнена за счет средств гранта РФФИ No 20-015-00186\20.
Литература:
1. Montuori N., Pesapane A., Rossi F. et al. Translational Medicine at UniSa. 2016. № 15. P. 15-21.
2. Porcelli R., Guida M., De Summa S., Fonte R. et al. Immunother Cancer. 2021. № 9. Art. № e002372
УСТРОЙСТВО ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ
ТЕРМИЧЕСКОГО ОЖОГА
В.В. Болтовская1, В.А. Болтовский2,
А.В. Болтовский3
1 Биотехнологический центр «БиоТех» СамГМУ, Самара, Россия
2 Кафедра педиатрии ИПО СамГМУ, Самара, Россия
3 Самарский областной клинический онкологический диспансер, Самара, Россия
e-mail: violetta.boltovskaya@vandex.ru
Ключевые слова: термический ожог, лабораторные животные, полезная модель, моделирование термического ожога.
Целью создания полезной модели является моделирование стандартизированного термического ожога необходимой глубины с заранее заданной площадью, с точным ее вычислением, а также возможностью дозирования повреждающего фактора по времени и по температуре.
Эта цель достигается тем, что корпус выполнен в виде цилиндрической емкости, заполняемой водой, плоское дно которой выполняет функции контактного ожогового элемента, а нагреватель выполнен в виде трубчатого электронагревательного элемента, причем корпус выполнен из термостойкого светопрозрачного материала, корпус снабжен рукояткой. Контроль за температурой осуществляется при помощи термометра, а время
