CC BY
64
УДК. 581.1
O.B. Музалевская, Л.И. Донская
СРАВНЕНИЕ СПОНТАННОГО, АСКОРБАТ-ЗАВИСИМОГО И НАДН-ЗАВИСИМОГО ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И СОДЕРЖАНИЯ ТОКОФЕРОЛОВ В ЗАРОДЫШЕ И ЭНДОСПЕРМЕ СЕМЯН ГОЛОСЕМЕННЫХ РАСТЕНИЙ
Иркутский государственный университет (Иркутск)
Исследованы процессы ПОЛ и содержание токоферолов в различных структурных элементах семян хвойных растений. Установлено, что в семенах трех изученных видов функционируют, системы, ферментативного и неферментативного ПОЛ. Уровень НАДН-зависимого ПОЛ превосходил показатели аскорбат-зависимого. Самое низкое значение ПОЛ зарегистрировано в семенах кедра, что объясняется, наличием, в них мощных антиоксидантных систем..
Ключевые слова: эндосперм, зародыш, семена кедра Pinus sibirica Du Tour, ели Picea obovata Ledeb. и сосны Pinus silvestris L., спонтанное, аскорбат-зависимое и НАДН-зависимое пере-кисное окисление липидов, токоферолы
COMPARISON OF SPONTANEOUS, ASCORBATE- AND NADH-DEPENDENT LIPID PEROXIDATION WITH TOCOPHEROL CONTENT IN EMBRYO AND ENDOSPERM OF CONIFEROUS SEEDS
O.V. Muzaleskaya, L.I. Donskaya Irkutsk State University, Irkutsk
The POL processes have been investigated, in different structural elements of Coniferous seeds. Enzyme and non-enzyme systems are functioning in the seeds of three coniferous species. Level of NADH-dependent lipid peroxidation is increased of ascorbate-dependent POL. The lowest POL value is registered, in a cedar Pinus sibirica seeds. This result can be explaining by existing of high power antioxidant systems in the cedar seeds. Key words: endosperm, embryo, seeds of Pinus sibirica Du Tour, Picea obovata Ledeb and Pinus silvestris L., spontaneous, ascorbate- and NADH-dependent lipid peroxidation, tocopherols
Ранее нами показано, что основные окисляемые компоненты липидов зародыша и эндосперма семян изучаемых видов хвойных представлены полиеновыми жирнокислотными остатками ТГ такими, как линолевая 18 : 2 (п — 6), линоленовая 18 : 3 (п — 3) А5, 9, 12 и пиноленовая 18 : 3 А5, 9, 12 кислоты [8]. Синтез липидов при созревании семян происходит в короткий период времени и для своего энергообеспечения требует значительной интенсивности дыхания.
Кислород, будучи необходимым фундаментом энергетического метаболизма и дыхания, в то же время является причиной дегенеративных состояний в растительных клетках [10]. В организме существует два пути восстановления кислорода. Один из них — оксидазный. По этому пути происходит окисление энергетических субстратов, реализуемое в митохондриальной системе электронного транспорта. Молекулярный кислород является конечным акцептором электронов и восстанавливается до воды. В нормальных условиях этот процесс сопряжен с синтезом АТФ. Другой путь
— оксигеназный — характеризуется тем, что полного четырехэлектронного восстановления кислорода не происходит, и в результате присоединения к кислороду одного, двух или трех электронов возникают активные формы кислорода. В условиях нормальной жизнедеятельности клетки, активные
формы кислорода образуются постоянно в допустимых количествах. При определенных условиях происходят нарушения регуляции синтеза АФК в клетке и, как следствие этого, образование их избытка [10, 19]. Избыточное содержание АФК часто приводит к разрушению клеточных структур и преждевременной гибели клетки, что в свою очередь на тканевом уровне вызывает потерю семенами жизнеспособности [12, 14]. Механизмы, посредством которых радикалы кислорода наносят окислительное повреждение запасным и мембранным липидам, белкам и нуклеиновым кислотам, в основном связывают с реакциями перекисного окисления [18, 20]. В классификации систем ПОЛ высших растений их выделяют три, обладающие общим способом развития — цепной радикальной реакцией. Это — неферментативная реакция, активируемая аскорбатом, и две ферментативные — НАДН- и НАДФН-зависимые реакции. В семенах растений, включая голосеменные, имеется все необходимое для протекания процессов ПОЛ: источники активного кислорода, субстраты перекисно-го окисления - ненасыщенные жирные кислоты ТГ и мембран, железо в разных формах, способные инициировать процесс ПОЛ.
В отсутствие экстремальных эндо- или экзогенных факторов процесс ПОЛ протекает в клетках сбалансировано. Постоянство концентрации
продуктов и скорости реакций ПОЛ поддерживается антиоксидантными системами [1, 2, 16]. Вышесказанное позволяет предположить наличие в семенах хвойных растений, особенно в высокомасличных Pinus sibirica Du Tour, эффективной антиоксидантной системы защиты, одним из компонентов которой являются токоферолы. Целью настоящей работы была оценка способности семян голосеменных растений к перекисному окислению и содержания суммы токоферолов в семенах Pinus sibirica Du Tour, Pinus silvestris L. и Piсеa obovatа методом ВЭЖХ.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служили эндосперм и зародыш семян кедра Pinus sibirica Du Tour, ели Picea obovata Ledeb. и сосны Pinus silvestris L., предоставленные Большереченским лесхозом.
Определение перекисного окисления липидов
В экспериментах определяли спонтанную, неферментативную и ферментативную реакции ПОЛ. При индукции системы спонтанной ПОЛ реакция происходила в среде состава 25 мМ Трис-HCl (рН 7.4), 175 мМ KCl без добавления прооксидантов. Для индукции неферментативного перекисно-го окисления в среду инкубации добавляли 1 мМ аскорбата, 1 мМ АДФ и 20 мкМ Fe3 + . Для индукции неферментативного перекисного окисления в среду инкубации добавляли 1 мМ НАДН, 1 мМ АДФ и 20 мкМ Fe3 + . Уровень перекисного окисления липидов определялся измерением первичного продукта перекисного окисления липидов — диеновой конъюгации. В ходе перекисного окисления на стадии образования свободных радикалов в молекулах ПНЖК возникает система сопряженных двойных связей, что сопровождается появлением нового максимума в спектре поглощения.
Определение диеновых конъюгатов (продуктов ПОЛ) проводили по модифицированному методу И.Д. Стальной [11].
Все полученные данные обработаны статистически [4] с использованием пакета программ «Statistica 5.0». Выводы при сопоставлении делали при р > 0,95. На диаграммах показаны средние по группам с величинами доверительного интервала.
Определение содержания токоферолов
Экстракцию общих липидов из растительных тканей осуществляли по методу Фолча [17].
Для количественного определения токоферолов в липидах семян кедра сибирского использовали микроколоночный хроматограф со спектрофотометрическим УФ-детектированием — «Ми-лихром-1» (ПО «Научприбор», г. Орел).
Условия хроматографирования витамина Е:
Колонка — размером 2 х 64 мм, заполненная сорбентом нуклеосил-5, С18;
Объем пробы — 20 мкл;
Подвижная фаза — 96% С2Н5ОН
Длина волны детектора — 290 нм;
Температура колонки — 35 °С;
Скорость потока — 100 мкл/мин;
Скорость подачи бумаги — 0,6 см/мин.
Для идентификации токоферолов применяли стандартный раствор витамина Е с концентрацией 0,9 мг/мл [15]. Предел обнаружения витамина Е составляет 10 мкг/мл. Проведена статистическая обработка результатов определения. Ошибка воспроизводимости не превышает ± 5,2 %.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Семена Pinus sibirica Du Tour, ели Picea obovata Ledeb. и сосны Pinus silvestris L. существенно различаются по содержанию липидов. Наибольшее их количество (до 60 %) присутствует в семенах кедра, но, согласно полученным данным, в них зарегистрирован наименьший уровень ПОЛ. Об этом свидетельствует низкое содержание в зародыше и эндосперме кедра продуктов ПОЛ — диеновых коньюга-тов (рис. 1, 3), между накоплением которых и интенсивностью перекисного окисления установлена прямая зависимость [3]. В зародыше и эндосперме сосны спонтанное ПОЛ значительно выше, чем в семенах кедра, но ниже по сравнению с семенами ели (рис. 1 —3), хотя в них присутствует наименьшее количество липидов (30 %). Кроме того, липиды зародышей изученных семян более устойчивы к ПОЛ, чем липиды эндосперма. Это различие можно объяснить тем, что зародыш семени имеет иную природу и дает начало новому растению.
При инициировании ПОЛ в клетках растений в итоге используются одни и те же субстраты, но существуют определенные различия в реакциях ферментативного и неферментативного ПОЛ, обусловленные особенностями начальных стадий [3, 6]. Основное отличие ферментативных систем от неферментативных состоит в использовании различных восстановителей железа [5, 9]. В первом случае — это НАДН, НАДФН, во втором случае — аскорбат.
Интересной особенностью этих систем является и различное сродство к ионам железа [7]. Ферментативное ПОЛ обладает очень высоким сродством к железу и для проявления его максимальной активности вполне хватает эндогенного железа [5]. Инициация ПОЛ в семенах изучаемых растений происходила в присутствии аскорбата натрия (система неферментативного ПОЛ). Уровень аскор-бат-зависимого (неферментативного) ПОЛ в семенах кедра превосходит его значение при спонтанном процессе, особенно в эндосперме (рис. 1). Уровень аскорбат-зависимого ПОЛ в эндосперме и зародыше семян сосны также превысил показатель спонтанного ПОЛ. В эндосперме сосны это значение интенсивности ПОЛ возросло почти в два раза (от 27,455 ± 0,076 до 46,788 ± 0,0129 нмоль/г) (рис. 1). Наиболее высокий уровень аскорбат-зави-симого ПОЛ отмечен в семенах ели (рис. 1, 2).
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что реакции ферментативного ПОЛ протекают в семенах кедра Pinus sibirica Du Tour, ели Picea obovata Ledeb. и сосны Pinus silvestris L. с другой
160
140
120
100
| 80.
° 60
Ш
| 40
X
20
0
т
і
!
і 1 і
_1
Г 1 1 ^|| кт
□ Кедр зародыш Ш Кедр эндосперм
■ Сосна зародыш
■ Сосна эндосперм
■ Ель зародыш
■ Ель эндосперм
Спонтанное ПОЛ Неферментативное ПОЛ НАДН-зависимое ПОЛ НАЛФН-зависимое ПОЛ Рис. 1. Перекисное окисление липидов в семенах голосеменных растений.
■ ель зародыш -ель эндосперм
Рис. 2. Перекисное окисление липидов в зародыше и эндосперме ели.
интенсивностью по сравнению с неферментативными. Инициация ПОЛ в семенах растений в этой серии экспериментов происходила в присутсивии НАДН или НАДФН (системы ферментативного ПОЛ). В целом, уровень НАДН-зависимого ПОЛ был выше, чем аскорбат-зависимого (рис. 1). В семенах сосны наблюдалась гораздо более значительная индукция ПОЛ, особенно в эндосперме, где она почти в 1,5 раза выше, чем в зародыше, при этом НАДН-зависимая система более эффективна. Самый высокий уровень НАДН-зависимого ПОЛ была в отмечен семенах ели (рис. 1, 2).
НАДФН-зависимый уровень индукции перекис-ного окисления липидов одинаков в эндосперме кедра и зародыше сосны и несколько выше в эндосперме сосны. Не были получены результаты ферментативного НАДФН-зависимого ПОЛ у отдельных видов
семян, что не позволяет уверенно говорить о статистической достоверности наблюдаемых изменений.
Как отмечалось выше, семена изучаемых видов голосеменных накапливают значительное количество липидов, имеющих высокую степень не-предельности. Очевидно, изменения, происходящие в клетках в результате воздействия образующихся продуктов ПОЛ, могут быть пусковыми механизмами защиты. По мнению Кения с соавторами [13] в условиях окислительного стресса более эффективной является защита с помощью низкомолекулярных антиоксидантов, к которым относятся и токоферолы. Токоферол ингибирует ПОЛ, взаимодействуя с перекисным радикалом, и связывает СЖК [1, 16]. Наибольшее количество токоферола характерно для семян кедра, накапливающих липиды в количестве до 60 % от сырого
кедр зародыш "кедр эндосперм "сосна зародыш сосна эндосперм
Рис. 3. Перекисное окисление липидов в семенах кедра и сосны.
Таблица 1
Общее содержание токоферолов в зародыше и эндосперме семян хвойных
Объект исследования Содержание витамина Е, мг на 1 г ткани
Эндосперм кедра Pinus sibirica Du Tour 0,70 ± 0,03
Зародыш кедра Pinus sibirica Du Tour 0,74 ± 0,026
Эндосперм сосны Pinus silvestris L. 0,36 ± 0,015
Зародыш сосны Pinus silvestris L. 0,50 ± 0,02
Эндосперм ели Picea obovata Ledeb 0,47 ± 0,023
Зародыш ели Picea obovata Ledeb 0,52 ± 0,03
веса, причем содержание токоферолов в зародыше (74 мг/г) выше, чем в эндосперме (70 мг/г) (табл. 1). Эта тенденция еще более выражена в семенах ели и особенно в семенах сосны, где эти показатели различаются почти в 1,5 раза. Такая разница естественна и вытекает из функции, выполняемой зародышем.
В то же время не выявлено прямой корреляции в содержании токоферола и интенсивностью пере-кисного окисления липидов. Так, в семенах ели содержание токоферолов выше (0,47 ± 0,023 и
0,52 ± 0,03, в эндосперме и зародыше соответственно), чем в семенах сосны (0,36 ± 0,015 и 0,50 ± 0,02), тогда как уровень перекисного окисления липидов значительно превосходит этот показатель в семенах сосны и особенно кедра (табл. 1, рис. 1).
Таким образом, можно с уверенностью констатировать, что семена изученных голосеменных растений различаются по способности к перекисно-му окислению. Липиды зародышей Pinus sibirica Du Tour, Picea obovata Ledeb. и Pinus silvestris L. более устойчивы к ПОЛ, чем липиды эндосперма. Наибольшее содержание токоферолов характерно для семян кедра, но не отмечается прямой зависимос-
ти между количеством токоферолов и интенсивностью ПОЛ. НАДФН-зависимый уровень индукции перекисного окисления липидов в семенах хвойных растений является вопросом дальнейших исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бурлакова Е.Б. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксидатны / Е.Б. Бурлакова, Н.Г. Храпова // Успехи химии. — 1985. - Т. ЬГУ, Вып. 9. - С. 1540- 1558.
2. Веселовский В.А. О роли биоантиоксидантов в устойчивости растений / В.А. Веселовский // Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. — М.: Наука, 1982. — С. 150-152.
3. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М.: Наука, 1972. - 252 с.
4. Гланц С.А. Медико-биологическая статистика / С.А. Гланц. - М.: Практика, 1998. - 459 с.
5. Жибоедов П.М. Белковый состав и мембранные липиды интродуцированных растений в Заполярье / П.М. Жибоедов, В.К. Жиров, С.М. Руденко. -Апатиты: Кольский филиал АН СССР, 1987. - 144 с.
6. Исследование перекисного окисления липидов в растительных митохондриях в связи с проблемой температурного стресса / Ю.М. Константинов, Г.Н. Луценко, В.А. Подсосный, В.В. Зыкова // Стрессовые белки растений. — Новосибирск: Наука, 1989а. - С. 88-113.
7. Кения М.В. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе / М.В. Кения, А.И. Лукаш, Е.Н. Гуськов // Успехи соврем. биологии. - 1993. - Т. 113, Вып. 4. - С. 456-470.
8. Музалевская О.В. Изучение состава жирных кислот липидов семян голосеменных растений / О.В. Музалевская, Л.И. Донская // Сб. тезисов докладов V съезда Общества физиологов растений России. - Пенза, 2003. - С. 414-415.
9. Рубин Б.А. Окисление липидных компонентов в изолированных хлоропластах под действием света субстрата и продукты переокисления липидов / Б.А. Рубин, М.Н. Мерзляк, С.Г. Юферова // Физиология и биохимия культурных растений.
- 1976. - Т. 23, № 2. - С. 254-261.
10. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло / В.П. Скулачев // Соросовский образовательный журнал. - 1996. - № 3. - С. 4- 10.
11. Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот / И.Д. Стальная // Современные методы биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С. 63-64.
12. Тарчевский И.А. Регуляторная роль деградации биополимеров и липидов / И.А. Тарчевский // Физиология растений. - 1992. - Т. 39, № 6. -С. 1215- 1223.
13. Участие токоферола и его аналогов в процессах перекисного окисления липидов и транспорта электронов в митохондриях печени крыс in vivo / Н.И. Куница, И.В. Кузьменко, С.М. Алексеев, Е.И. Захарова и др. // Биохимия. — 1993. — Т. 5, Вып. 11. - С. 1709- 1713.
14. Физиология и биохимия покоя и прорастания семян. — М.: Колос, 1982. — 495 с.
15. Филимонов В.Н. Определение жирорастворимых витаминов в кормовых препаратах методом ВЭЖХ / В.Н. Филимонов, И.Ф. Колосова, Л.Н. Балятинская // Ж. аналит. химии. — 1989. — Т. 44, Вып. 8. — С. 1433—1436.
16. Храпова Н.Г. О взаимодействии природных и синтетических антиоксидантов / Н.Г. Храпова / / Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. — М., 1982. — С. 59 — 73.
17. FolchJ. // J. Biol. Chem. — 1951. — Vol. 191.
— P. 833 — 841.
18. Shewfelt R.L. Role of lipid peroxidation in the mechanism of membrane-associated disorders in edible plant tissue / R.L. Shewfelt, M.E. Erickson // Trends in Food Sci. Technol. — 1991. — Vol. 2. — P. 152— 154.
19. The oxidative stress response in Enterococcus faecalis: relationship between H2O2 tolerance and H2O2 stress proteins / S. Flahaut, J.M. Laplace, J. Frure, Y. Auffray // Lett. Appl. Microbiol. — 1998.
— Vol. 26 (4). — P. 259 — 264.
20. Wilson D.O. The lipid peroxidation model of seed aging / D.O. Wilson, M.B. McDonald Jr. // Seed Sci. Tech. — 1986. — Vol. 14. — P. 269 — 300.
