CC BY
60
УДК 630*181.324
ЛИПИДЫ МЕРИСТЕМ ЛЕСООБРАЗУЮЩИХ ХВОЙНЫХ ПОРОД ЦЕНТРАЛЬНОЙ СИБИРИ В УСЛОВИЯХ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ АДАПТАЦИИ. 1. ХАРАКТЕРИСТИКА СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ФОСФОЛИПИДОВ ЗИМУЮЩИХ МЕРИСТЕМ LARIX SIBIRICA LEDEB., PICEA OBOVATA L. И PINUS SYLVESTRIS L.
© Е.В. Алаудинова , П.В. Миронов
Сибирский государственный технологический университет, пр. Мира, 82, Красноярск, 660049 (Россия) E-mail: [email protected]
Приведены результаты исследования состава жирных кислот фосфолипидов меристем почек основных хвойных лесообразующих пород Центральной Сибири: Larix sibirica Ledeb., Picea obovata L. и Pinus sylvestris L. зимой (в состоянии низкотемпературной устойчивости меристем) и весной (при утрате низкотемпературной устойчивости). Показано, что смена фенологического состояния дерева при переходе от покоя к вегетации сопровождается значительной трансформацией жирнокислотного состава фосфолипидов живых тканей, выражающейся не только в изменении содержания индивидуальных жирных кислот, соотношения компонентов одного или различных типов, но и в исчезновении некоторых жирных кислот, присутствующих в зимующих почках.
Ключевые слова: Larix sibirica Ledeb., Picea obovata L., Pinus sylvestris L., меристемы, фосфолипиды, жирные кислоты, сезонные изменения.
Введение
Большое экономическое значение хвойных определяется широким использованием их древесины, представляющей по ряду физических и химических свойств ценнейший объект для переработки. Среди хвойных по богатству видов и занимаемой ими территории выделяется семейство сосновых (Pinaceae). Очевидно, что хвойные не получили бы столь широкого распространения в регионах с суровым климатом, если бы их фо-тосинтетический аппарат был не приспособлен к гипотермии. Деятельность фотосинтетического аппарата во многом обусловливает продуктивность ксилогенеза древесных растений, поскольку для образования высокомолекулярных компонентов древесины необходимы первичные продукты фотосинтеза.
В Центральной Сибири морфо- и органогенез фотосинтетического аппарата начинается с заложения почек более чем за 10 месяцев до их распускания. Осень, суровую сибирскую зиму и большую часть весны меристемы почек переносят во внутрипочечном состоянии, успешно сохраняют жизнеспособность и создают потенциал для роста молодой хвои следующего года. Особенностью сибирского климата являются низкие зимние температуры, представляющие собой основной абиотический нерегулируемый сезонный стрессор. Поскольку меристематические ткани почек обладают большой чувствительностью к условиям перезимовки, они, в конечном итоге, и определяют выживание дерева в целом. В этой связи актуальность изучения метаболизма меристем почек хвойных пород несомненна.
В метаболизме живых растительных клеток ведущая роль, наравне с белками и нуклеиновыми кислотами, принадлежит липидам. Однако вопросы липидного обмена у хвойных остаются недостаточно изученными. Приведенная в литературе информация о метаболизме липидов, касающаяся количественных изменений об-
* Автор, с которым следует вести переписку.
щих липидов либо их отдельных групп, жирнокислотного состава, обнаруживает, что за редким исключением [1-4] изучались ткани с относительно малым и неопределенным содержанием живых клеток. Липиды мери-стематических тканей почек хвойных практически не исследованы. Способность меристем переносить низкие зимние температуры напрямую зависит от состояния мембранных компонентов, в первую очередь липидов, что полностью согласуется с современными представлениями о строении мембран как о липидном бислое с погруженными в него белками [5]. Учитывая, что для реализации основных функций липидный бислой мембран должен находиться в жидком фазовом состоянии, обусловленном составом и структурой жирных кислот мембранных липидов, исследование метаболизма полярных липидов, в частности изменений состава их жирных кислот в условиях естественного сезонного снижения температур, представляет интерес.
В этой связи для выяснения особенностей липидного обмена хвойных древесных растений в условиях Центральной Сибири была поставлена задача исследования состава жирных кислот фосфолипидов меристем почек основных лесообразующих хвойных пород лесных экосистем Красноярского края в состоянии низкотемпературной устойчивости меристем в зимний период и его изменений в набухших почках весной.
Экспериментальная часть
Объектами исследования являлись меристематические ткани, выделенные из вегетативных почек наиболее распространенных аборигенных хвойных пород Красноярского края: лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.), ели сибирской (Picea obovata L.) и сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), произрастающих в естественных древостоях. Постоянные пробные площади расположены в окрестностях г. Красноярска на территории Мининского лесничества. Отбор образцов для исследования производился в разные периоды годового цикла (зимой в состоянии низкотемпературной устойчивости меристем и весной при утрате низкотемпературной устойчивости), в соответствии с различными фенологическими фазам развития почек. Побеги последнего года отбирали с деревьев II-III класса возраста. После удаления коры вместе с почечными чешуями меристематические ткани вегетативных почек срезали скальпелем по границе с ксилемой побега.
Чтобы свести к минимуму возможные автолитические изменения, гомогенизацию зачаточных тканей проводили при температуре 0 - минус 2 °С. Кроме того, для работы использовались охлажденная лабораторная посуда и материалы.
Общую липидную фракцию извлекали смесью растворителей хлороформ-изопропанол в соотношении 1 : 2 по объему [6, 7] в присутствии 1%-го ионола. Очистку липидов от примесей нелипидной природы проводили гель-фильтрацией через колонку с сефадексом G-25 [8]. Очищенный липидный экстракт упаривали на ротационном вакуумном испарителе (РВИ) при температуре 36-38 °С и разделяли на фракции на хроматографической колонке. В качестве адсорбента использовали силикагель Bio-Sil А 100-200 mech. Колонку с нанесенным липидным экстрактом последовательно промывали хлороформом, ацетоном, изопропанолом. Скорость элюирования составляла около 3 мл/мин. При этом последовательно вымывались вещества нейтрального характера, гликолипиды и фосфолипиды (ФЛ).
Изопропанольный экстракт, содержащий ФЛ, упаривали на РВИ при температуре 36-38 °С, растворяли в 1%-ном метанольном растворе NaOH и нагревали на водяной бане при 55 °С в течение 30 мин. Смесь охлаждали, подкисляли 5%-ным метанольным раствором HCl и вновь инкубировали при 55 °С [9]. После охлаждения добавляли 0,5 объема дистиллированной воды и экстрагировали метиловые эфиры жирных кислот (ЖК) гексаном. Гексановый экстракт концентрировали на РВИ, а затем очищали метиловые эфиры жирных кислот методом ТСХ, используя стеклянные пластинки с силикагелем марки КСК Воскресенского химкомбината с размером частиц 100-200 меш. В качестве проявителя применяли бензол.
Анализ метиловых эфиров жирных кислот ФЛ проводили на газожидкостном хроматографе «Agilent Technologies» фирмы «Хьюлетт-Паккард» (США) с масс-селективным детектором, работающим в режиме электронного удара и регистрацией разделенных компонентов по полному ионному току. Колонка кварцевая капиллярная HP-5MC (длина 30 м, диаметр 0,25 мм, толщина слоя пленки фазы 0,33 мкм); начальная температура термостата колонок - 150 °С в изотермическом режиме 3 мин, затем температура термостата колонок увеличивалась со скоростью 20 °С/мин; конечная температура термостата колонок 280 °С; газ-носитель - гелий. Идентификацию жирных кислот осуществляли по масс-спектрам (библиотека масс-спектров NIST 02.L) и индексам удерживания.
Обсуждаются средние арифметические значения трех биологических и трех аналитических повторностей. В качестве биологической повторности были взяты побеги с 10 деревьев в каждом эксперименте. Оценка значимости различий проведена методом сравнения средних значений по критерию Стьюдента. Различия считались существенными при уровне значимости Р < 0,05.
Обсуждение результатов
Как видно из приведенных в таблице 1 данных, в структуре ФЛ лиственницы сибирской обнаружено 20, ели сибирской - 17, сосны обыкновенной - 16 жирных кислот, разнообразных по числу углеродных атомов и двойных связей. Исследование сезонной и межвидовой изменчивости хвойных по жирнокислотному составу ФЛ меристем почек, в условиях Центральной Сибири, выявило высокий уровень ЖК с 18 атомами углерода (рис. 1). Однако соотношение между различными индивидуальными кислотами этой группы отличалось не только у разных пород, но и в различных фенофазах развития почек. Кроме того, в меристемах зимующих и набухших почек постоянно присутствовали миристиновая (С14:0), пальмитиновая (С16:0), гепта-декановая (С17:0) и длинноцепочечные жирные кислоты с числом углеродных атомов больше 18 (С> 20). Следует отметить, что гексадекадиеновая кислота (С16:2) обнаружена у всех исследованных пород только зимой в состоянии низкотемпературной устойчивости. В зимующих почках содержание пальмитиновой кислоты (С16:0) в 2-3 раза превосходило стеариновую (С18:0), в набухших почках пальмитиновая кислота (С16:0) накапливалась еще интенсивнее. Этот факт свидетельствует о том, что с пробуждением почек синтазы жирных кислот, конечный продукт действия которых - пальмитиновая кислота (С16:0), активизируются.
У лиственницы сибирской в зимний период содержание линолевой (С18:2) и линоленовой (С18:3) кислот очень близко - около 20% от суммы ЖК. Также в зимний период отмечалось сравнительно высокое содержание кислот с 16 атомами углерода - около 20%, при этом содержание пальмитиновой (С16:0) и пальмитоолеи-новой (С16:1) примерно одинаково - около 9% от суммы ЖК. Для фосфолипидов лиственницы характерно повышенное содержание длинноцепочечных (С> 20) ЖК, среди которых преобладали компоненты с 20 атомами углерода. Именно эта группа кислот (рис. 2) представлена самым широким спектром: одной насыщенной и четырьмя ненасыщенными ЖК, с числом двойных связей от одной до четырех. Их содержание в зимующих почках достигало 80% от суммы кислот С> 20. Наиболее высокий уровень зимой отмечен у эйкозатриеновой кислоты (С20:3). Особенно интересно обнаружение в структуре ФЛ у лиственницы кислоты с нечетным числом атомов углерода - гептадекановой (С17:0) и значительных количеств короткоцепочечных кислот (С<16), среди которых также идентифицированы ундекановая (С11:0), тридекановая (С13:0) и пентадекановая (С15:0) кислоты. До недавнего времени считалось, что ЖК, входящие в состав липидов высших растений, содержат только четное число атомов углерода [10, 11]. Широкое использование в последние годы для анализа ЖК современных газожидкостных хроматографов с пламенно-ионизационными и масс-селективными детекторами позволило совершенно точно установить структуру неидентифицированных ранее соединений. Сегодня в научной литературе все чаще говорится о том, что в структуре растительных липидов обнаружены ЖК с нечетным числом атомов углерода [12, 13]. Нами установлено, что в зимующих почках лиственницы содержание этих кислот составляло около 6,5% от суммы ЖК. Перед распусканием в набухших почках менялось не только содержание, но и состав ЖК. Исчезали некоторые короткоцепочечные кислоты (С11:0, С13:0, С15:0). В результате содержание короткоцепочечных компонентов снижалось почти в четыре раза. Изменялось соотношение главных в количественном отношении кислот с 18 атомами углерода: содержание линолевой кислоты (С18:2) становилось в 5-6 раз выше, чем линоленовой (С18:3), при этом содержание остальных кислот этой группы, стеариновой (С18:0) и олеиновой (Сх8:а), изменялось не так значительно. Весной в структуре ФЛ существенно возрастал уровень пальмитиновой кислоты (С16:0) - до 22% от суммы ЖК. Наравне с линолевой кислотой (С18:2), пальмитиновая (С16:0) становилась преобладающей, ее содержание в этот период в 16 раз выше миристиновой (С14:0) и в 7 раз выше стеариновой (С18:0). Одновременно уровень пальмитолеиновой кислоты (С16:1) снижался в четыре раза, а гексадекадиеновая (С16:2) исчезала совсем. Несмотря на то, что уровень кислот с 20 атомами углерода в набухших почках несколько возрастал, их доля от суммы длинноцепочечных ЖК снижалась с 79 до 72%. Общее же содержание длинноцепочечных кислот (С> 20) возрастало в 1,3 раза (рис. 1), главным образом, за счет арахиновой (С20:0) и лигноцериновой (С24:0) кислот.
Состав жирных кислот фосфолипидов некоторых хвойных пород (в процентах от суммы жирных кислот)
Жирная кислота Лиственница сибирская Ель сибирская Сосна обыкновенная
зимующие почки набухшие почки зимующие почки набухшие почки зимующие почки набухшие почки
Ундекановая 1,25 - - - - -
Лауриновая 1,26 0,26 - - - -
Тридекановая 1,88 - - - - -
Миристиновая 0,42 1,37 0,65 5,26 1,52 6,83
Пентадекановая 1,28 - 0,48 - 0,81 -
Гексадекадиеновая 2,33 - 2,01 - 1,45 -
Пальмитоолеиновая 8,55 2,01 1,03 - - -
Пальмитиновая 9,10 22,18 10,20 19,32 8,72 14,90
Гептадекановая 2, 07 1,71 9,50 4,91 6,16 2,52
Линоленовая 20,78 5,31 19,40 7,72 9,43 8,29
Линолевая 20,33 29,74 35,27 15,14 47,58 17,37
Олеиновая 4,03 2,81 1,39 22,67 1,26 24,17
Стеариновая 2,81 3,10 3,17 4,13 2,60 3,37
Арахидоновая 1,91 2,25 2,29 2,02 2,34 1,52
Эйкозатриеновая 6,73 1,18 2,22 - 5,16 -
Эйкозадиеновая 2,52 2,08 6,23 1,03 2,88 -
Эйкозеновая 3,17 2,44 1,17 - 2,93 1,43
Арахиновая 4,45 14,90 1,04 2,94 1,48 1,63
Бегеновая 4,06 2,66 2,14 10,84 3,01 13,88
Лигноцериновая 1,07 6,00 1,81 4,02 2,67 4,09
зима весна чша весна зима весна
I короткоцепочечные В сумма С1б □ сумма С18 □длинноцепочечные
Рис. 1. Содержание основных типов жирных кислот фосфолипидов в меристемах почек хвойных пород
зима весна зима весна зіма весна
□ арахиновая Пэйкозеновая □ эко задиенов ая □ экозатриеновая ■ арахидоновая
Рис. 2. Состав жирных кислот типа С20 в фосфолипидах меристем почек хвойных пород
Анализ жирных кислот ФЛ ели сибирской (табл.) выявил существенные отличия между елью и лиственницей как по составу, так и по содержанию жирных кислот в различных фазах развития почек. У ели ни в зимующих, ни в набухших почках не были обнаружены короткоцепочечные ЖК: ундекановая (С11:0), лауриновая (С12:0), тридекановая (С13:0). Содержание пентадекановой (С15:0) и миристиновой (С14:0) в зимний период в сумме составляло чуть более 1%. Содержание ЖК с 18 атомами углерода у ели было выше, чем у лиственницы, примерно на 12% от суммы ЖК. В зимующих почках преобладала линолевая кислота (около 35%). В значительных количествах содержались пальмитиновая (С16:0), гептадекановая (С17:0), линоленовая (С18:3) кислоты. Состав ЖК с 20 атомами углерода в фосфолипидах ели такой же, что и у лиственницы. Среди них в количественном отношении в зимующих почках преобладала эйкозадиеновая (С20:2) кислота - 6,23% от суммы ЖК. Весной в набухших почках у ели резко увеличивалось содержание олеиновой (С18:1) кислоты. Одновременно почти в 2,5 раза падал уровень линолевой (С18:2) и линоленовой (С18:3) кислот. Содержание насыщенных ЖК возрастало, в первую очередь, за счет пальмитиновой (С16:0), а также миристиновой (С14:0) и бегеновой (С22:0) кислот. Состав ЖК с 20 атомами углерода сокращался, так как исчезали эйкозеновая (С20:1) и эйкозатриеновая (С20:3) кислоты, а содержание эйкозадиеновой (С20:2) кислоты снижалось в 6 раз. Одновременно общее содержание длинноцепочечных ЖК немного увеличивалось в основном за счет бегеновой кислоты.
Жирнокислотный состав ФЛ сосны обыкновенной, по сравнению с лиственницей сибирской и елью сибирской, представлен наименьшим числом индивидуальных соединений (табл.). В зимний период группу ЖК с 18 атомами углерода на 80% составляли линолевая (С18:2) и линоленовая (С18:3) кислоты, причем содержание линолевой было в пять раз выше, чем линоленовой, и достигало 48% от суммы ЖК. Как и у ели, у сосны не были обнаружены короткоцепочечные ЖК: ундекановая (С11:0), лауриновая (С12:0), тридекановая (С13:0), а содержание пентадекановой (С15:0) и миристиновой (С14:0) в зимний период в сумме составляло чуть более 2%. Кроме того, зимой в почках сосны в значительных количествах присутствовали пальмитиновая (С16:0), гептадекановая (С17:0), линоленовая (С18:3) кислоты. Состав ЖК с 20 атомами углерода у сосны аналогичен с лиственницей и елью. В количественном отношении среди кислот этой группы в зимующих почках, как и у лиственницы, преобладала эйкозатриеновая кислота (С20:3). Весной в набухших почках сосны, как и у ели, резко увеличивалось содержание олеиновой (С18:1) кислоты. При этом почти в три раза падал уровень линолевой. Содержание насыщенных ЖК возрастало, в первую очередь, за счет бегеновой (С22:0), а также миристиновой (С14:0) и пальмитиновой (С16:0). Исчезали пентадекановая (С15:0), гексадекадиеновая (С16:2), эйкозадиеновая (С20:2) и эйкозатриеновая (С20:3) кислоты.
Выводы
Исследование сезонной и межвидовой изменчивости основных лесообразующих хвойных пород - лиственницы, ели и сосны - по составу ЖК фосфолипидов меристем показало, что в условиях Центральной Сибири смена фенологического состояния дерева при переходе от покоя к вегетации сопровождается значительной трансформацией жирнокислотного состава: исчезают некоторые ЖК, присутствующие в зимующих почках, изменяются содержания и соотношения между индивидуальными ЖК одного или различных типов.
Установлены как сходства, так и существенные различия между породами по исследованному признаку:
- у всех пород в составе ФЛ выявлен высокий уровень ЖК с 18 атомами углерода, а также широкий набор индивидуальных компонентов с 20 атомами углерода, представленных одной насыщенной и четырьмя ненасыщенными ЖК, с числом двойных связей от одной до четырех. Кроме того, постоянно присутствуют миристиновая (С14:0), пальмитиновая (С16:0), гептадекановая (С17:0) и длинноцепочечные жирные кислоты с числом углеродных атомов больше 18 (С>20). Гексадекадиеновая кислота (С16:2) обнаружена только зимой - в состоянии низкотемпературной устойчивости меристематических тканей;
- наибольшим разнообразием жирнокислотного состава выделяется лиственница: только у этой породы в структуре ФЛ меристем в зимний период присутствуют короткоцепочечные (С<16) ЖК с нечетным числом атомов углерода, исчезающие весной при набухании почек;
- в набухших почках изменения соотношений между индивидуальными компонентами количественно преобладающей группы кислот с 18 атомами углерода носят индивидуальный характер: у лиственницы содержание линолевой кислоты (С18:2) становится в 5-6 раз выше, чем линоленовой (С18:3), при этом содержание остальных кислот этой группы, стеариновой (С18:0) и олеиновой (С18:1), изменяется не так значительно. У ели и сосны, напротив, резко увеличивается содержание олеиновой (С18:1) кислоты, а уровень линолевой (С18:2), снижается почти в 2,5 раза;
- у ели и сосны весной существенно сужается спектр ЖК с 20 атомами углерода за счет исчезновения некоторых ненасыщенных компонентов.
Список литературы
1. Левин Э.Д., Рубчевская Л.П., Вол Е.В. Глицериды и фосфолипиды камбиальной зоны лиственницы сибирской // Химия древесины. 1983. №4. С. 97-100.
2. Левин Э. Д., Рубчевская Л.П. Состав триглицеридов камбиальной зоны лиственницы сибирской // Химия древесины. 1985. №1. С. 104-109.
3. Рубчевская Л.П., Игнатова Е.В., Репях С.М. Фосфолипиды камбиальной зоны Larix sibirica // Химия природных соединений. 1998. №4. С. 549-550.
4. Алаудинова Е.В., Миронов П.В., Репях С.М. Характеристика липидов меристем почек Larix sibirica // Химия природных соединений. 2002. №4. С. 259-262.
5. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений: В 2-х т.: Пер. с англ. М., 1986. Т. 1. 393 с.
6. Folch J., Lees M., Stanley G.H. A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues // J.
Biol. Chem. 1957. V. 226. №1. P. 497-509.
7. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. Physiology. 1959. V. 37. P. 911-917.
8. Кейтс М. Техника липидологии. М., 1975. 322 с.
9. Carreau V.P., Dubaeq J.P. Adaptation of a Macro-Scale Method to the Micro-Scale for Fatty Acid Methyl Trans-
estherification of Biological Lipid Extracts // J. Chromatogr. V. 151. P. 384-390.
10. Кретович В.Л. Биохимия растений: Учебник для биол. факультетов ун-тов. М., 1980. 445 с.
11. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х т.: Пер. с англ. М., 1985. Т. 1. 367 с.
12. Сущик Н.Н. и др. Влияние температуры на состав внутри- и внеклеточных жирных кислот зеленых водорослей и цианобактерий // Физиология растений. 2003. Т. 50. №3. С. 420-427.
13. Макаренко С.П. и др. Характеристика жирнокислотного состава липидов митохондриальных мембран некоторых видов злаков, различающихся устойчивостью к низким температурам // Биологические мембраны. 2003. Т. 20. №4. С. 301-306.
Поступило в редакцию 1 ноября 2008 г.
