CC BY
57
УДК 630*181.324
ЛИПИДЫ МЕРИСТЕМ ЛЕСООБРАЗУЮЩИХ ХВОЙНЫХ ПОРОД ЦЕНТРАЛЬНОЙ СИБИРИ В УСЛОВИЯХ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ АДАПТАЦИИ. 2. ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ФОСФОЛИПИДОВ МЕРИСТЕМ LARIX SIBIRICA LEDEB., PICEA OBOVATA L. И PINUS SYLVESTRIS L.
© Е.В. Алаудинова , П.В. Миронов
Сибирский государственный технологический университет, пр. Мира, 82, Красноярск, 660049 (Россия) E-mail: [email protected]
Установлено, что в зимний период преобладающими группами ненасыщенных жирных кислот (ЖК) фосфолипидов (ФЛ) являются у Larix sibirica Ledeb. триеновые, у Picea obovata L. и Pinus sylvestris L. - диеновые. Набухание почек весной сопровождается снижением содержания ненасыщенных ЖК примерно на 30%. Анализ изменения содержания в структуре ФЛ индивидуальных ЖК типа С18 при переходе дерева от зимнего покоя к вегетации обнаружил важную функциональная роль в формировании криозащищенного состояния клеточных мембран меристем Larix sibirica Ledeb., Picea obovata L. и Pinus sylvestris L. ацил-липидной юб десатуразы, ответственной за синтез линолевой (С18:2) кислоты. Кроме того, выявлена особая значимость в криоадаптации клеток меристем Larix sibirica Ledeb. ацил-липидной ю3 десатуразы, в зимний период катализирующей превращение линолевой (С18:2) кислоты в линоленовую (С18:3) в ФЛ лиственницы в 1,5-3 раза интенсивнее, чем у ели и сосны.
Ключевые слова: Larix sibirica Ledeb., Picea obovata L., Pinus sylvestris L., жирные кислоты, активность ацил-липидных дисатураз, низкотемпературная устойчивость.
Введение
У высших растений устойчивость к низкотемпературному воздействию коррелирует с наличием в структуре мембранных липидов полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК). известно, что повышение вязкости мембран при снижении температуры сопровождается индукцией экспрессии десатуразных генов, повышающих в клетке уровень ферментов - десатураз жирных кислот [1]. Функция жирнокислотных десатураз заключается в регуляции текучести липидного бислоя мембран посредством ускорения синтеза ПНЖК в мембранных липидах. Рассматривая текучесть мембран в качестве основного параметра, обеспечивающего их нормальное функционирование при низких зимних температурах, возникает необходимость оценивать активность жирнокислотных десатураз. На сегодняшний день существует практика косвенной оценки активности этих ферментов на основании состава жирных кислот мембранных липидов [2, 3].
исходя из этого, в данной работе предпринята попытка проанализировать результаты исследования состава жирных кислот (ЖК) фосфолипидов меристем почек лиственницы, ели и сосны в криозащищенном состоянии в период зимнего покоя и его трансформирование при переходе к активной вегетации посредством вычисляемых показателей: индекса двойных связей (иДС), коэффициента ненасыщенности жирных кислот (К). А также оценить активности жирнокислотных ацил-липидных мембранных ю9, юб и ю3 десатураз, катализирующих введение двойных связей в углеводородные цепи олеиновой (С18:1), линолевой (С18:2) и линоленовой (С18:3) кислот, посредством стеароил- (SRD), олеил- (ORD) и линолеил- (LDR) десатуразных отношений.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Для удобства анализа хроматограмм все жирные кислоты в зависимости от степени их ненасыщенности распределили на пять групп: насыщенные (Н) - двойные связи отсутствуют, моноеновые (М) - одна двойная связь, диеновые (Д) - две двойные связи, триеновые (Тр) - три двойные связи, тетраеновые (Тетр) - четыре двойные связи.
Индекс двойной связи (ИДС), характеризующий степень ненасыщенности липидов, вычислили по методу [4]:
С = М + 2 х Д + 3 х Тр + 4 х Тетр Д 100 ’ ( )
где М - моноеновые, Д - диеновые, Тр - триеновые, Тетр - тетраеновые кислоты, % от суммы жирных кислот.
Коэффициент ненасыщенности (К) жирных кислот определяли как отношение £ ненасыщенных ЖК / £ насыщенных ЖК.
Активности ацил-липидных мембранных ю9, ю6 и ю3 десатураз, катализирующих введение двойных связей в углеводородные цепи олеиновой (С18:1), линолевой (С18:2) и линоленовой (С18:3) кислот как стеароил-(8КЭ), олеил- (ОКО) и линолеил- (ЬБЯ) десатуразные отношения, рассчитывали на основании содержания (процентного от суммы ЖК) компонентов типа С18, как это описано в работе [5]:
= (С1И)/(С1М + С1И), (2)
ОКО - (С18.2 + С183)/(С18:1 + С18:1 + С183)
(3)
ЬИБ = (СШз)/(С18:з + С182) (4)
где С18:0, С18:2, С18:2 и С18:3 - процентное от суммы кислот содержание стеариновой, олеиновой, линолевой и линоленовой кислот соответственно.
Обсуждение результатов
Динамика содержания основных групп ЖК фосфолипидов и активность ацил-липидных десатураз представлены на рисунке 1 и в таблице. Сравнение жирнокислотного состава фосфолипидов меристем почек лиственницы сибирской, ели сибирской и сосны обыкновенной позволяет установить как сходства, так и существенные различия между видами хвойных. В зимующих почках у всех пород содержание ненасыщенных жирных кислот составляло 70-73%.
Динамика основные группы жирных кислот фосфолипидов некоторых хвойных пород (в процентах от суммы жирных кислот)
Лиственница сибирская Ель сибирская Сосна обыкновенная
Показатель зимующие набухшие зимующие набухшие зимующие набухшие
почки почки почки почки почки почки
X С<16 ЖК б,09 1,63 1,13 5,26 2,33 6,83
X насыщенных ЖК 29,65 52,18 28,99 51,42 26,97 47,22
X ненасыщенных ЖК 70,35 47,82 71,01 48,58 73,03 52,78
К 2,37 0,92 2,45 1,06 2,71 1,12
ИДС 1,56 1,18 1,65 0,95 1,61 0,91
БКО 0,59 0,48 0,30 0,85 0,33 0,88
ОКО 0,91 0,93 0,98 0,50 0,98 0,51
ЬКО 0,51 0,14 0,35 0,34 0,17 0,32
Примечание: ИДС - индекс двойной связи; К - коэффициент ненасыщенности ЖК; БКЭ - стеароил-десатуразное отношение; ОКО - олеил-десатуразное отношение; ЬКЭ - линолеил-десатуразное отношение.
Лиственница сибирская Ель сибирская Сосна обыкновенная
60
зима весна зима весна зима весна
■ моноеновые @ диеновые Птриеновые Птетраеновые
Рис. 1. Соотношения моно-, ди-, три- и тетраеновых жирных кислот в фосфолипидах меристематических тканей почек хвойных пород
Повышение температуры весной вызывало гидрогенизацию двойных связей жирных кислот и, как следствие, набухание почек сопровождалось снижением содержания ненасыщенных ЖК в структуре фосфолипидов примерно на 30%. Максимальное содержание насыщенных жирных кислот перед распусканием почек отмечено у лиственницы и ели - около 52%. Коэффициент ненасыщенности жирных кислот (К) в зимний период у всех исследованных пород был в 2-2,5 выше, чем в набухших почках весной.
Наиболее полно степень ненасыщенности липидов может быть охарактеризована с помощью индекса двойных связей (ИДС), поскольку этот показатель учитывает не только содержание ненасыщенных кислот, но и количество двойных связей в них (уравнение 1). По этой причине ИДС не всегда совпадает с К. В нашем случае самый высокий ИДС зимой у ели (1,65), а самый высокий К в это же время у сосны (2,71). В целом же зимующие почки хвойных характеризуются большими значениями ИДС и К, чем набухшие.
Зимой для всех пород было характерно повышенное содержание в фосфолипидах ПНЖК. Доминирование полиненасыщенных (с несколькими двойными связями) жирных кислот меняет конформацию мембранных липидов и позволяет, таким образом, сохранять текучесть мембран в условиях низких температур на физиологически необходимом уровне. Преобладающими группами ПНЖК в этот период являлись: у лиственницы триеновые - 27,51%, у ели и сосны диеновые - 43,51 и 51,91% соответственно (рис. 1). При этом у лиственницы в составе ПНЖК доминировали линолевая (С:8:2) и линоленовая (С:8:3) кислоты, их содержание равнозначно, у ели и сосны - линолевая (С:8:2). Весной картина менялась: в набухших почках у сосны и ели преобладающей ненасыщенной ЖК становилась моноеновая олеиновая (С^О, у лиственницы ПНЖК - линолевая (С18:2).
Биосинтез олеиновой (Сх8:а), линолевой (С:8:2) и линоленовой (С:8:3) кислот у большинства видов высших растений осуществляется с участием ацил-липидных десатураз, обеспечивающих образование двойных связей в углеводородных цепях ЖК типа С:8 [6, 7]. В этой связи оценка активности жирнокислотных десатураз с помощью стеароил- (8КЭ), олеил- (ОКО) и линолеил- (ЬБЯ) десатуразных отношений (уравнения 2-4) позволяет в определенной мере судить о механизмах синтеза и роли ненасыщенных ЖК, доминирующих в структуре фосфолипидов, как в состоянии низкотемпературной устойчивости меристем, так и при ее утрате в период вегетации.
Мембраны, фосфолипиды которых содержат только насыщенные («прямые») ЖК, находятся в состоянии геля и по этой причине работа биологической системы невозможна. Для жидкокристаллического (нормального рабочего) состояния ЖК мембранных липидов должны иметь хотя бы одну двойную связь. Вследствие этого гены ацил-липидной ю9 десатуразы, обеспечивающей введение первой двойной связи, всегда работают на одном постоянном уровне [8]. Так у лиственницы стеароил - (8КЭ) десатуразные отношения в зимующих и набухших почках близки и находятся в пределах 0,5-0,6. У ели и сосны этот показатель существенно (в 2,5 раза) возрастает в набухших почках (табл. 1). Такая динамика 8КЭ подтверждает, что экспрессия генов ацил-липидной ю9 десатуразы у хвойных практически не зависит от температуры. Можно предположить, что ацил-липидная ю9 десатураза, участвующая в биосинтезе олеиновой (Са8:х) кислоты, не влияет на мембранные механизмы низкотемпературной устойчивости исследованных хвойных пород.
Дополнительные двойные связи, обеспечивающие более высокую степень ненасыщенности ЖК, необходимы только при низких температурах для восстановления текучести мембран. Поскольку почти все гены, кодирующие десатуразы, активизируются низкими температурами, ненасыщенные жирные кислоты типа С:8 в зимний период характеризуются высокими олеил-десатуразными отношениями (ОКО) в пределах 0,91-
0,98 (табл.). Это указывает на важную функциональную роль при формировании криозащищенного состояния клеточных мембран исследованных хвойных пород ацил-липидной ю6 десатуразы, ответственной за синтез линолевой (С:8:2) кислоты.
Аккумуляция олеиновой кислоты (Са8:х) весной в набухших почках ели и сосны свидетельствует о снижении активности ацил-липидных ю6 и ю3 мембранных десатураз, ответственных за введение в углеводородную цепь ЖК второй и третьей двойной связи. Как следствие, ОКО у ели и сосны с наступлением вегетационного периода снижается вдвое, а 8КЭ, соответственно, возрастает. У лиственницы при набухании почек весной ОКО не снижается, олеиновая кислота (С^О не накапливается, так как по-прежнему превращается в линолевую (С:8:2). Вероятно, это дало возможность лиственнице расширить ареал своего обитания дальше на Север, где нередки весенние заморозки. Сохранение в этих условиях определенного количества двойных связей в ЖК фосфолипидов позволяет поддерживать параметры текучести клеточных мембран живых тканей на рабочем уровне.
Линолеил-десатуразные отношения (ЬБЯ) в зимующих почках исследованных пород находятся в пределах 0,17-0,51 (табл.). Самая высокая величина ЬБЯ в состоянии низкотемпературной устойчивости у лиственницы. Весной этот показатель понижается втрое, что может свидетельствовать как о снижении активности ацил-липидной ю3 десатуразы и, как следствие, скорости введения третьей двойной связи в линолевую (С18:2) кислоту, так и о гидрогенизации уже имеющихся двойных связей. При повышении температуры аккумуляция в мембранах значительных количеств ЖК с тремя двойными связями представляет опасность для клетки. Поскольку возрастающая в этих условиях подвижность мембранных липидов может привести к разрушению липидного бислоя, клетка избавляется от «лишних» двойных связей, тем самым повышает структурную прочность мембран, регулируя их текучесть.
У ели в зимующих почках ЬБЯ находится на среднем уровне (0,35) и весной в набухших почках практически не меняется, т.е. соотношение между линолевой (С18:2) и линоленовой (С18:з) кислотами в различных фенофазах развития почек стабильно. У сосны ЬБЯ весной, наоборот, возрастает с 0,17 до 0,32. Десатурация линолевой кислоты (С18:2) в линоленовую (С18:3) протекает интенсивнее, чем в зимний период. Однако необходимо помнить, что самой линолевой кислоты (С18:2) образуется намного меньше, чем зимой, на это указывает снижение ОКО весной у ели и сосны вдвое. В результате уровень линоленовой кислоты (С18:3) в фосфолипидах набухших почек у всех пород невысокий (в пределах 5,3-8,3%). Следовательно, ацил-липидная ю3 жирнокислотная десатураза, ответственная за введение в углеводородную цепь ЖК третьей двойной связи, в зимний период катализирует превращение линолевой кислоты в линоленовую (С18:3) в фосфолипидах лиственницы в 1,5-3 раза интенсивнее, чем у ели и у сосны, таким образом, принимая активное участие в криоадаптации меристематических клеток лиственницы. Это может свидетельствовать об адаптивной экспрессии ацил-липидной ю3 десатуразы, катализирующей в этих условиях превращение линолевой (С18:2) кислоты в линоленовую (С18:3).
Как уже говорилось, наибольшим разнообразием состава жирных кислот выделяется лиственница сибирская. Только для нее характерно наличие в зимний период значительных количеств (около 6% от суммы ЖК) короткоцепочечных (С<16) ЖК, исчезающих из жирнокислотного спектра весной. Известно, что короткоцепочечные (низкомолекулярные) ЖК, как и высоконенасыщенные, могут способствовать поддержанию текучести мембран на оптимальном уровне, смещая точку перехода мембранных липидов в состояние геля в низкотемпературную область, поскольку длина углеродной цепи ЖК влияет на температуру ее плавления [9, 10]. Восприятие низкотемпературного сигнала мембранами живых клеток лиственницы сибирской влечет уменьшение их жидкостности, а изменение физических свойств мембран, как известно, сопровождается индукцией экспрессии десатуразных генов [11, 12]. Вместе с тем у лиственницы в ходе эволюции выработался и наследственно закрепился механизм оптимизации текучести мембран, предусматривающий, помимо привычной активации ацил-липидных десатураз, роль которых заключается в образовании двойных углеводородных связей в цепях ЖК, синтез низкомолекулярных короткоцепочечных жирных кислот. Таким образом, эти независимые биохимические механизмы позволили лиственнице увеличить диапазон пластичности и расширить ареал своего обитания на Север, до границ распространения древесной растительности [13, 14].
Рис. 2. Соотношение (в %) олеиновой (С18:1), линолевой (С18:2), линоленовой (С18:3) кислот в фосфолипидах меристем почек хвойных пород
Ель сибирская и сосна обыкновенная - менее морозостойкие породы. Ареал их обитания значительно южнее, чем у лиственницы сибирской. Вероятно, им для восстановления текучести мембран живых клеток при снижении температуры, вполне достаточно десатурации углеводородных связей в ацильных цепях жирных кислот мембранных липидов.
Выводы
Анализ исследования состава ЖК фосфолипидов зимующих меристем лиственницы, ели и сосны и его трансформирования при переходе к активной вегетации позволил провести оценку степени ненасыщенности ЖК. Результаты дают основание полагать, что различная морозоустойчивость хвойных [13] связана с биосинтезом ПНЖК.
Показано, что на мембранные механизмы низкотемпературной устойчивости меристем исследованных хвойных пород ацил-липидная ю9 десатураза, участвующая в биосинтезе олеиновой (С18:1) кислоты, существенного влияния не оказывает. Ацил-липидная ю6 десатураза, ответственная за синтез линолевой (С18:2) кислоты, напротив, выполняет важную функциональную роль в формировании криозащищенного состояния клеточных мембран. Кроме того, в криоадаптации меристематических клеток лиственницы принимает активное участие ацил-липидная ю3 десатураза, ответственная за введение в углеводородную цепь ЖК третьей двойной связи. В зимний период она катализирует превращение линолевой (С18:2) кислоты в линоленовую (С18:3) в фосфолипидах лиственницы в 1,5-3 раза интенсивнее, чем у ели и у сосны. Тем не менее в целом зимующие почки всех пород характеризуются большими значениями ИДС и К, чем набухшие.
Результаты анализа ненасыщенности ЖК и величины стеароил- (SRD), олеил- (ORD) и линолеил- (LDR) десатуразных отношений позволяют предположить, что особенности биохимической трансформации состава ЖК фосфолипидов меристематических тканей почек, установленные в ходе исследований, связаны с существованием у хвойных, по крайней мере, двух различных механизмов низкотемпературной адаптации липидного мембранного матрикса. У ели и сосны восприятие низкотемпературного сигнала живыми клетками, приводящее к изменению физических свойств мембран, индуцирует экспрессию десатуразных генов и, таким образом, жидкостные свойства мембран восстанавливаются. У лиственницы восстановление жидкостных свойств мембранного бислоя, контролируется двумя механизмами: активации ацил-липидных деса-тураз и синтеза низкомолекулярных короткоцепочечных (С<16) ЖК преимущественно с нечетным числом атомов углерода. Вероятно, у более древней по происхождению лиственницы данный признак сформирован в более суровых условиях, чем у ели и сосны, и поэтому лучше защищает от низкотемпературного стресса, позволяя лиственнице демонстрировать более высокую устойчивость к действию низких отрицательных температур.
Список литературы
1. Лось Д.А. Молекулярные механизмы холодоустойчивости растений // Вестник РАН. 2005. Т. 75. №4. С. 338-345.
2. Макаренко С.П., Коненкина Т.А., Хотимченко С.В. Жирнокислотный состав липидов вакуолярных мембран корнеплодов // Физиология растений. 2007. Т. 54. №2. С. 223-228.
3. Cartea M.E., Migdal M., Galle A.M., Pelleiter G., Guerche P. Comparison of sense and antisense methodologies for
modifying the fatty acid composition of Arabidopsis thaliana oilseed // Plant Science. 1998. V. 136. P. 181-194.
4. Lyons J.M., Wheaton T.A., Pratt H.R. Relationship between the physical nature of mitochondrial membranes and chilling sensitivity in plants // Plant Physiol. 1964. V. 39. №2. P. 262-268.
5. Jaworski J.G. Stumpf P.K. Fat metabolism in higher plants. Properties of a soluble stearyl-acyl carrier protein desatu-
rase from maturing Carthamus tinctorius // Arch. Biochem. Biophys. 1974. V. 162. P. 158-165.
6. Nishida I., Murata N. Chilling Sensitivity in Plants and Cyanobacteria: the Crucial Contribution of Membrane Lipids // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996. V. 47. P. 541-568.
7. Лось Д.А. Структура, регуляция экспрессии и функционирование десатураз жирных кислот // Успехи биологической химии. 2001. Т. 41. С. 163-198.
8. Los D.A., Murata N. Structure and Expression of Fatty Acid Desaturases // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1394. P. 3-15.
9. Актуальные проблемы криобиологии / Под общ. ред. Н.С. Пушкаря и А.М. Белоуса. Киев, 1981. 608 с.
10. Кагава Ясуо. Биомембраны: Пер. с япон. М., 1985. 303 с.
11. Hamada T., Kodama H., Nakeshita K., Utsumi H., Iba K. Characterization of Transgenic Tobacco with an Increased -
Linolenic Acid Level // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 591-598.
12. Лось Д.А. Десатуразы жирных кислот: Адаптивная экспрессия и принципы регуляции // Физиология растений. 1997. Т. 44. С. 528-540.
13. Хлебникова Н.А., Гирс Г.И., Коловский Р.А. Физиологическая характеристика хвойных растений Сибири в зимний период // Труды ИлиД СО АН СССР. Красноярск, 1963. Т. 60. С. 5-16.
14. Дылис Н.В. Лиственница. М., 1981. 96 с.
Посутпило в редакцию 1 ноября 2008 г.
