CC BY
34
DOI: 10.23868/201912030
СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДОСТУПНЫХ ИСТОЧНИКОВ АУТОГЕННЫХ КОЛОНИЕФОРМИРУЮЩИХ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК
В.Г. Матвеева, Л.В. Антонова, Е.А. Великанова, Е.С. Сардин, О.Л. Барбараш
Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний, Кемерово, Россия
COMPARISON OF THE EFFECTIVENESS OF AVAILABLE SOURCES OF AUTOLOGOUS COLONY-FORMiNG ENDOTHELIAL CELLS
V.G. Matveeva, L.V. Antonova, E.A. Velikanova, E.S. Sardin, O.L. Barbarash
Research Institute for Complex issue of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia
e-mail: [email protected]
Колониеформирующие эндотелиальные клетки (КФЭК) являются ценным материалом для тканевой инженерии сосудов и клеточной терапии ишемизированных тканей. Основная проблема использования КФЭК касается сложности их получения. В литературе описано выделение КФЭК из периферической крови и жировой ткани. Цель настоящего исследования: сравнительная оценка эффективности получения КФЭК без использования клеточной сепарации из периферической крови, подкожной и перикардиальной жировой ткани.
КФЭК выделяли из периферической крови, подкожной и эпикардиальной жировой ткани 8 пациентов мужского пола с диагнозом ишемическая болезнь сердца, направленных на плановую операцию коронарного шунтирования. Стромально-васкулярную фракцию из подкожного (СВФ-ПЖ, n=8) и эпикардиального жира (СВФ-ЭЖ, n=8), а также мнону-клеарную фракцию крови (МНФ, n=8) культивировали в полной питательной среде EGM-2. Фенотип полученных культур определяли с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии, пролиферативную активность оценивали на анализаторе xCELLigence, способность формировать капилляроподобные структуры изучали на Матригеле in vitro.
КФЭК были выделены из 50% образцов МНФ, 12,5% образцов СВФ-ПЖ и 37,5% СВФ-ЭЖ. 75% культур КФЭК из МНФ демонстрировали высокую и среднюю пролиферативную активность, тогда как КФЭК из жировой ткани в основном обладали низким уровнем пролиферации. Пересев клеточных культур из МНФ, содержащих колонии КФЭК, позволял избавиться от гемопоэтических клеток, и к 3 пассажу получить чистые культуры КФЭК (более 99%) без использования клеточной сепарации. Клеточные культуры из жировой ткани, сформировавшие колонии КФЭК, были гетерогенны и содержали, кроме КФЭК, активно пролиферирующие мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК).
При данном способе выделения клеток периферическая кровь представляет собой более эффективный источник аутогенных КФЭК по сравнению с жировой тканью. Однако из жировой ткани могут быть получены аутогенные ММСК и смешанные культуры ММСК и эндотелиальных клеток.
Ключевые слова: колониеформирующие эндотелиальные клетки, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, периферическая кровь, жировая ткань, стромально-васкуляр-ная фракция, пролиферативная активность.
Введение
В последние годы регистрируется неуклонный рост сердечно-сосудистых заболеваний. Для лечения ишемической болезни сердца применяют различные терапевтические и хирургические тактики, каждая из них имеет свои показания, преимущества и ограничения. В качестве протезирующего материала при шунтировании коронарных артерий в основном используют аутоар-терии и вены, однако проблема такого подхода связана с ограниченным количеством подходящих для имплантации сосудов. Решением этой задачи может стать создание протезов сосудов малого диаметра с искусственно сформированной интимой, которая позволит снизить риск тромбоза протеза после трансплантации.
Endothelial Colony-forming cells (ECFCs) are valuable material for tissue vascular engineering and cell therapy of ischemic tissues. Difficult isolation is the main problem for using of ECFCs. ECFCs isolation from peripheral blood and adipose tissue has been previously described. In the presented research we compared effectiveness of peripheral blood, subcutaneous and epicardial adipose tissue for the ECFCs isolation without cell sorting.
ECFCs was isolated from peripheral blood, subcutaneous and epicardial adipose tissue obtained from coronary heart disease patients (males, n=8) undergoing elective coronary artery bypass surgery. The stromal-vascular fraction of subcutaneous (SVF-ST) and epicardial (SVF-ET) adipose tissue as well as the mononuclear blood fraction (MNF) were cultivated in the complied EGM-2 medium. Cell cultures phenotyping was performed by flow cytometry and confo-cal microscopy. Their angiogenic (Matrigel) and proliferative activity (xCELLigence analyzer) in vitro were studied.
ECFCs were isolated from MNF in 50% of cases, from SVF-ST in 12.5% and SVF-ET in 37.5%. The proliferative activity of ECFCs isolated from adipose tissue was low while cultures from MNF showed high and medium activity in 75% of cases. Pure ECFCs (more 99%) were obtained from MNF to third passage without cell sorting. Cultures from adipose tissue were contaminated by mes-enchymal-stromal cells (MSCs) and contained ECFCs and MSCs.
Thus, peripheral blood is the most effective source of autolo-gous ECFCs compared with adipose tissue for this isolation method. However, adipose tissue is a suitable source of MSC and mixed cultures of MSC and endothelial cells.
Keywords: endothelial colony forming cells, mesenchymal stromal cells, peripheral blood, adipose tissue, stromal vascular fraction, proliferative activity.
Аутогенные эндотелиальные прогениторные клетки (ЭПК) являются идеальным вариантом для заселения внутренней поверхности протеза, поскольку они обладают ангиогенным потенциалом, способны про-лиферировать и дифференцироваться в зрелые эндотелиальные клетки [1-3]. Эти уникальные свойства делают ЭПК ценным материалом для использования в регенеративной медицине, например, при прямой клеточной трансплантации в ишемизированные ткани. Трансплантация ЭПК — это потенциальная терапия, которая в настоящее время проходит клинические исследования. Показана эффективность ЭПК для лечения заболеваний, связанных с ишемией нижних конечностей [4, 5], инсультами [6, 7] диабетической
язвой [8], инфарктом миокарда [9, 10]. Описано получение ЭПК из крови пупочной вены [11-13], периферической крови [ПК] [11, 14] и жировой ткани [15]. Для получения аутогенных ЭПК в зрелом возрасте наиболее подходящими из перечисленных источников являются ПК и жировая ткань.
В организме человека содержится большое количество жира и его забор не представляет проблему. Из жировой ткани выделяют стромально-васкулярную фракцию [СВФ] в которой присутствуют мультипотент-ные мезенхимальные стромальные клетки [ММСК] [16], обладающие всеми минимальными критериями ММСК по M. Доминику [2006] [17]. Также из сВф возможно получение ЭПК, однако подходы к их выделению значительно различаются [18, 19]. Одно из направлений, связанное с дифференцировкой ММСК в ЭПК под действием факторов роста, имеет как сторонников [19, 20], так и противников, доказывающих, что таким способом невозможно получить полноценные ЭПК, но локальное введение ММСК в ишемизированный участок способствует привлечению ЭПК из циркулирующей крови или окружающих тканей [21].
Биологическая активность жировой ткани из разных депо существенно отличается [22] и может отразиться на характеристиках выделенных клеток. Большинство исследований посвящено получению ЭПК из подкожного жира [ПЖ] [23], также в качестве источника рассматриваются висцеральная, эпиди-димальная и ингвинальная жировая ткань [24, 25]. Однако в настоящее время отсутствуют публикации, касающиеся выделения и оценки ЭПК из эпикардиаль-ного жира [ЭЖ]. Причина такого невнимания, скорее всего, связана с низкой доступностью ЭЖ у здорового человека, однако у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями при ряде оперативных вмешательств открывается доступ к эпикардиальному жировому депо и, в данном случае, его можно рассматривать в качестве возможного источника ЭПК.
В литературе ЭПК, полученным in vitro, присваивают различные названия: поздние ЭПК [late endothelial progenitor cells, LEPCs], колониеформирующие эндо-телиальные клетки [endothelial colony-forming cells, ECFCs], разрастающиеся эндотелиальные клетки [outgrowth endothelial cells, OECs]. Мы считаем, что к наиболее важным характеристикам ЭПК относится способность культур in vitro формировать колонии и сохранять эндотелиальный фенотип при возможном отсутствии CD133 и снижении или потере экспрессии стволовых маркеров [CD34] в процессе культивирования [26], поэтому для обозначения данного типа клеток будет использован термин колониеформирующие эндотелиальные клетки [КФЭК]. Согласно данным литературы КФЭК идентифицируют по совокупности характерных признаков: формирование колоний с морфологией «булыжной мостовой», отсутствие на клетках лейкоцитарных и антигенпрезентирующих маркеров [CD45, CD3, CD14, HLA DR] при наличии эндоте-лиального фенотипа [CD31, CD146, CD309, vWF] и ангиогенной активности, способность поглощать ацетилированные липопротеины низкой плотности [Ac LDL] и связывать лектин [1, 2, 11].
Цель данного исследования: сравнительная оценка эффективности получения КФЭК без использования клеточной сепарации из периферической крови, подкожной и перикардиальной жировой ткани у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, поскольку именно эта категория пациентов могут стать основными реципиентами продуктов на основе КФЭК.
Таблица 1. Характеристика пациентов
Характеристики Количество
Количество пациентов Возраст Пол
Мультифокальный атеросклероз
Стенокардия
Кардиосклероз
Фракция выброса более 50%
Гипертоническая болезнь III ст
Хроническая сердечная недостаточность I
Хроническая сердечная недостаточность IIa
Дислипидемия
Церебральный атеросклероз
Ожирение 1 степени
Ожирение 2 степени
Материал и методы
Исследование было одобрено локальным этическим комитетом (протокол заседания ЛЭК № 7 от 24. 04.2019), у всех пациентов получено добровольное информированное согласие.
КФЭК выделяли из ПК, подкожной и эпикардиальной жировой ткани 8 пациентов мужского пола с диагнозом ишемическая болезнь сердца, направленных на плановую операцию коронарного шунтирования. Критерии включения: первичные вмешательства на сердце, возраст от 50 до 70 лет, подписанное добровольное информированное согласие. Критерии невключения: возраст старше 70 лет, острые ишемические процессы, сопутствующие онкологические и гематологические заболевания, активные воспалительные процессы, аутоиммунные заболевания, сахарный диабет, ожирение
3 степени. Общая характеристика пациентов представлена в табл. 1.
Получение и культивирование
мононуклеарной фракции крови
Во время операции у пациентов забирали 20 мл венозной крови в пробирки с гепарином. Мононуклеарную фракцию крови (МНФ) выделяли на градиенте плотности Histopaque 1077 (10771, Sigma, США) в соответствии с инструкцией производителя. Клетки из интерфазного кольца дважды отмывали избытком фосфатно-солевого буфера (ФСБ, 70011044, Gibco, США), ресуспендировали в полной питательной среде для роста эндотелия EGM-2 BulletKit (CC-3162, Lonza, Швеция) с 5% фетальной бычьей сыворотки (ФБС, 26140079, Gibco, США), засевали в лунки культуральных планшетов, покрытые коллагеном I типа (A1064401, Thermo Scientific, США), и культивировали в С02-инкубаторе при 37°C и 5% CO2 по протоколу с «обогащением»: для обогащения культуры или ускорения наращивания клеточной массы авторами предложено пересевать первичные колонии КФЭК через 7 сут. от начала культивирования [27]. Первые 2 сут. среду меняли ежедневно для удаления неадгезированных клеток и дебриса, далее — через 2-3 сут. Через 7 сут.
8
56 (50-64) мужской 25% 75% 12,5% 100% 87,5%
87,5%
12,5%
25% 50% 37,5% 12,5%
культивирования клетки снимали аккутазой (A6964, Sigma), отмывали ФСБ с 5% ФБС, ресуспендировали в полной питательной среде EGM-2, переносили в лунки планшета, покрытые фибронектином (F0895, Sigma, США), культивировали до формирования 70-80% субконфлюентного монослоя и пересевали. Во время пересева часть клеток отбирали на исследование.
Выделение и культивирование стромально-
васкулярной фракции из подкожного
и эпикардиального жира
Во время операции у тех же пациентов были забраны образцы ПЖ и ЭЖ размером 1,7-2 см3. Образцы ткани в стерильных условиях в транспортной среде доставляли в лабораторию. Фрагменты жировой ткани промывали в растворе Хенкса (Gibco, США), механически измельчали и обрабатывали 0,2% коллагеназой I типа (17100017, Thermo Scientific, США) в течение 30 мин. при 37°С. Ферментативную реакцию останавливали добавлением культуральной среды с 1 0% ФБС. Диссоциированную ткань пропускали через фильтр с диаметром пор 100 мкм и центрифугировали. Осадок СВФ ресуспендировали в полной питательной среде EGM-2, рассевали в чашки Петри и культивировали в С02-инкубаторе при 37°C и 5% CO2. Через 2 сут. клетки снимали раствором трипсина (R001100, Gibco, США) и пересевали в чашки Петри, покрытые фибронектином.
Иммунофенотипирование клеток
Проточная цитометрия. В работе использовали комбинации моноклональных антител фирмы Biolegend (США) (если не указано иное), конъюгированных с: флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC) — CD3 (317306), CD34 (IM1870U, BC, США), фактор фон Виллебранда (vWF) (ab8822, Abcam, Великобритания); фикоэритри-ном (PE) — CD309 (560494, BD, США), CD14 (А07764, BC, США); аллоцикоцианином (APC) — CD133 (372806), CD31 (303115); фикоэритрин-цианином 7 (PC7) — CD146 (361008); PacificBlue 450 (PB 450) — H LA DR (307633); Krome Orange (KrOr) — CD45 (A96416, BC, США).
В пробирки отбирали 0,5-1,0x105 клеток, вносили рекомендованный производителем объем антител и инкубировали 30 мин. при комнатной температуре в защищенном от света месте. В изотипический контроль вносили равный объем антител соответствующего изотипа. При окрашивании внутриклеточного белка vWF дополнительно проводили фиксацию и пер-меабилизацию клеток с применением набора IntraPrep (A07802, BC, США). Окрашенные пробы ресуспендировали в ФБС и анализировали на проточном лазерном цитометре CytoFlex (США) в программе CytExpert 2.1. Настройку прибора выполняли по изотипическому контролю. Анализ всех образцов проходил на единых настройках прибора.
Лазерная сканирующая микроскопия. Клетки культивировали на стеклах, фиксировали 4% раствором пара-формальдегида в течение 10 мин., при необходимости образцы пермеабилизировали 15 мин. 0,1% раствором Тритона X-100. Неспецифическое связывание антител блокировали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 1 ч. Далее на образцы наносили первые антитела (Abcam, Великобритания): анти-CD31 (ab119339), анти^144 (ab33168), анти^309 (ab2349), анти-виментин (ab7752), анти а-актин (ab7817), инкубировали во влажной камере 16 ч. при +4°С, отмывали, добавляли вторые антитела: осла против иммуноглобулина мыши Alexa Fluor (AF) 555 (A31 570,
Thermo Scientific, CIIA), осла против иммуноглобулина кролика AF 555 №1500У4) и AF 4ВВ (A21206, Thermo Scientific, CIA), осла против иммуноглобулина козы AF 555 (ab150130, Abcam, Великобритания), кролика против иммуноглобулина мыши FITC №В51У, Abcam, Великобритания), антитела к vWF, конъюгированные с FITC (ab8822, Abcam, Великобритания), и инкубировали 1 ч. при комнатной температуре. Ядра клеток докрашивали флуоресцентным красителем 4I, 6-диамидино-2-фенилиндол (4I, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) (D-13BB, Sigma, CIA). Пробоподготовку контрольных образцов выполняли аналогично описанной процедуре, но вместо первых антител использовали 1% БCA. Готовые стекла заключали в ProLong (P36G30, Life Technologies, CIA) и анализировали с помощью лазерного сканирующего микроскопа LSM У00 (Zeiss, Германия).
Изучение способности клеток к поглощению
ацетилированных липопротеинов низкой
плотности (Ac LDL) и связыванию лектина
Тест проводили на культурах 3 пассажа: в лунки с адге-зированными клетками вносили 2,4 мкг/мл меченного DiI Ac LDL (L34B4, Molecular Probes, CIA) в полной питательной среде EGM-2, инкубировали в течение 3 ч. при ЗУ°Ц реагент удаляли, клетки фиксировали 2% параформальдегидом 15 мин. и инкубировали 1 ч. с лек-тином Ulex Europaeus Agglutinin-1, конъюгированным с FITC (LG006, Sigma, CIA), в концентрации 1,5 мкг/ мл. Ядра клеток докрашивали DAPI. Препарат заключали в ProLong и анализировали на микроскопе LSM У00.
Исследование ангиогенной активности
клеток на Матригеле in vitro
Лунки 24-луночного планшета покрывали 200 мкл Матригеля (Matrigel Basement Membrane Matrix, 356234, Corning, CIA). В каждую лунку с Матригелем вносили по 2х104 клеток из различных источников, ресуспендированных в полной питательной среде EGM-2 с 5% ФБО Образование капилляроподобных структур наблюдали через 1 В ч. инкубации методом фазово-контрастной микроскопии на инвертированном микроскопе Carl Zeiss Observer.Z1 (Zeiss, Германия) с использованием программы AxioVisionRel.4.8 (Zeiss, Jena, Германия). Характеристику капилляроподобных структур оценивали с помощью полуколичественного анализа в программе WimTube (Wimasis Image Analysis, WIMASIS GmbH, Германия), в которой параметры рассчитываются автоматически.
Исследование пролиферативной активности
На анализаторе xCELLigence RTCA DP (ACEA Biosciences, CIA) в режиме реального времени определяли жизнеспособность и пролиферативную активность клеток по изменению клеточного индекса (КИ) и времени удвоения популяции (Population Doubling Times, PDTs) в ч. Клетки рассевали в лунки планшетов E-Plate 16 в количестве 2х104 клеток на лунку, по З параллельных пробы для каждой линии клеток из МНФ и по 1 пробе для колоний КФЭК из CBФ. Общее время эксперимента составило GB ч.
Статистический анализ
Огатистическую обработку результатов и построение графиков выполняли в программе GraphPad Prism У (CIA). Характер распределения оценивали с применением критерия Колмогорова-Cмирнова. В зависимости от характера распределения значимость различий между двумя независимыми группами проводили с помощью
Рис. 1. Клеточные культуры, полученные из различных источников: А, Г, Ж — ранние сроки культивирования до появления оформленных колоний; Б, Д, 3 — культуры, в которых не получены КФЭК; В, Е, И — формирующиеся колонии КФЭК. Световая микроскопия. Ув. х100
t-критерия Стьюдента или U-критерия Манна-Уитни. При оценке различий качественных показателей использовали критерий %2 Пирсона с поправкой Йейтса. Коррекцию результатов с учетом множественности сравнений выполняли методом средней доли ложных отклонений гипотез (FDR). Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.
Результаты
Морфология и иммунофенотип
колоний, выделенных из МНФ
В течение 9-18 сут. культивирования в отдельных образцах МНФ сформировались колонии с типичной морфологией «булыжной мостовой» (рис. 1 В), клетки имели полигональную и округлую форму, были хорошо распластаны и адгезированы к пластику.
Для доказательства эндотелиальной природы выделенных клеток и определения качественного состава полученных культур было проведено фенотипирование на различных этапах культивирования с использованием комбинации маркеров эндотелия (CD31, CD144, KDR, CD146, vWF), стволовых антигенов (CD34, CD133),
а также основных лейкоцитарных антигенов (0045, 0014, 003, Н1_А 013). Культуры с морфологией «булыжной мостовой» во всех образцах сохраняли стабильный фенотип, были однородны по составу, в них отсутствовали лейкоцитарные антигены (0045, 003, 0014, Н_А 0П) (рис. 2Ж).
Клетки обладали выраженной экспрессией эндоте-лиальных поверхностных антигенов 00146 и 0031, умеренной экспрессией 00309 и содержали фактор vWF (рис. 2Ж). При этом стволовые маркеры в культурах были представлены слабо: полностью отсутствовала экспрессия 00133 и лишь до 10% клеток были 0034-позитивны.
Данные проточной цитометрии были подтверждены результатами конфокальной микроскопии (рис. 3).
На мембране клеток детектировали рецепторы 0031 и 00309 (рис. 3В), межклеточные контакты были хорошо видны по наличию белка клеточной адгезии 00144 (рис. 3Б), характерного для эндотелия сосудов. Внутри клеток определялись тельца Вейбеля-Паладе (яркое, четко очерченное зеленое свечение), что наглядно доказывает способность синтезировать vWF (рис. 3Б). Клеточные культуры из МНФ поглощали
Рис. 2. Состав культур, выделенных из МНФ, на разных сроках культивирования: А, В, Д — культуры, в которых колонии КФЭК не получены; Б, Г, Е — культуры, в которых колонии КФЭК получены; А, Б — иммуноцитохимическая реакция с антителами к Сй45 колоний КФЭК [С045-] и лейкоцитов (С045+); В, Г — соотношение популяций Сй45- и Сй45+ в культурах; Д, Е — состав популяции Сй45+ (М± о); Ж — иммунофенотип культуры КФЭК из МНФ (проточная цитометрия); 3 — относительное содержание КФЭК (CD45-31+146+vWF+) в культуре в зависимости от пассажа (проточная цитометрия; М± о; по сравнению с 1 пассажем *р=0,036; **р=0,0002)
Ac LDL и связывали лектин (UEA) (рис. 4А), а также формировали капилляроподобные структуры на Матригеле in vitro (рис. 5A).
Характерная морфология колоний в виде «булыжной мостовой», наличие фенотипа, соответствующего зрелым эндотелиальным клеткам (CD31 +CD146+CD309+vWF+CD34-/+CD133-CD45-), способность к ангиогенезу, интернализации Ac LDL и связыванию лектина позволяют классифицировать колонии, выделенные из МНФ крови, как КФЭК.
В случае получения колоний КФЭК из МНФ результат культивирования признавали положительным (рис. 1В), при отсутствии колоний в течение 21 сут. культивирования — отрицательным (рис. 1 Б). В отрицательных образцах культура состояла из клеток округлой и изогнутой формы, слабо адгезированных к поверхности (рис. 1 Б), которые представляли собой популяции лейкоцитов (CD45+) (рис. 2А). В зависимости от сроков культивирования от 87 до 99% лейкоцитов составляли моноциты (CD45+CD14+) и небольшая часть (до 5,8%) была представлена лимфоцитами (Т-лимфоциты CD45+CD3+), которые исчезали к 20 сут. культивирования (рис. 2Д). Аналогичный состав и динамика субпопуляций CD45+ были отмечены в случае положительных результатов культивирования (рис. 2 Е).
Разрастающиеся колонии КФЭК благодаря хорошей адгезии и распластанности клеток вытесняли с поверхности менее адгезивные, неделящиеся популяции лейкоцитов (рис. 1В), что способствовало постепенному очищению культуры КФЭК (рис. 2Г). При пассировании происходило дополнительное самоочищение культур
КФЭК от лейкоцитов. К 2 и 3 пассажу удалось получить более чистую культуру по сравнению с 1 пассажем (р=0,036 и р=0,0002 соответственно): на 1 пассаже среднее относительное содержание КФЭК составило 85,7%, на 2 и 3 пассажах — 97,6% и 99,3% (рис. 23).
Морфология и иммунофенотип популяций
клеток, выделенных из жировой ткани
В течение 3-7 сут. культивирования СВФ-ПЖ и СВФ-ЭЖ отмечался полиморфизм клеток: преобладали веретеновидные клетки, присутствовали отростчатые и округлые клетки (рис. 1Г, Ж). В случае отсутствия колоний КФЭК дальнейшее культивирование сопровождалось формированием однородной популяции клеток за счет активной пролиферации веретенообразных клеток (рис. 1Д, 3), морфология которых в зависимости от источника значимо не различалась. Клетки по мере достижения конфлюентности формировали характерные звездчатые упорядоченные структуры. Независимо от источника жировой ткани клетки экспрессировали CD90, CD73 (рис. 6), виментин (рис. 33, М); не экспрессировали CD34 (данные не представлены) и маркеры эндотелиальных клеток (CD31, CD309, CD144) (рис. 3Д, И, Ж, Л; рис. 6); vWF и а-актин не визуализировались (рис. 33, М).
Выделенная популяция была определена нами как ММСК жировой ткани поскольку культура получена из «прилипающей» фракции, составляющие ее клетки обладали специфической морфологией, высокой адгезионной и пролиферативной активностью, экс-прессировали CD90 и CD73 при отсутствии стволовых,
Рис. 3. Иммунофенотип клеточных культур 3 пассажа, полученных из различных источников: красная рамка — реакция с антителами к vWF (зеленая флуоресценция), CD144 (красная флуоресценция); первый столбец — отрицательные результаты культивирования; второй столбец — положительные результаты культивирования; В, Ж, Л — экспрессия CD309 (зеленая флуоресценция), CD31 (красная флуоресценция); Г, 3, М — реакция с антителами к виментину (зеленая флуоресценция), а-актину (красная флуоресценция), ядра докрашены DAPI (синяя окраска). Конфокальная микроскопия. Ув. х200
Рис. 4. Культуры клеток 3 пассажа, выделенные из различных источников, оценка способности поглощать АсШ_ и связывать лектин (11ЕА): А, Б, В — положительный результат культивирования; Г, Д, Е — отрицательный. Конфокальная микроскопия. Ув. х200
Рис. 5. Формирование капилляроподобных структур на Матригеле в клеточных культурах 3 пассажа, выделенных из различных источников: А — КФЭК, полученные из МНФ; Б — из СВФ-ЭЖ, В — из СВФ-ПЖ (положительные результаты культивирования); образцы культур отрицательных результатов культивирования (колонии КФЭК не получены): Г — СВФ-ЭЖ, Д — СВФ-ПЖ. Световая микроскопия. Ув. А-Д х50. Е — сравнительная характеристика капилляроподобных структур, сформированных КФЭК (M±SD; *р<0,05, **р<0,0001)
Рис. 6. Иммунофенотип клеточных культур 3 пассажа, выделенных из жировой ткани (положительные и отрицательные результаты культивирования): А — СВФ-ПЖ, Б — СВФ-ЭЖ. Проточная цитофлуориметрия
лейкоцитарных и ряда эндотелиальных антигенов (CD34, CD45, CD31 и CD309), при этом тесты, подтверждающие мультипотентную дифференцировку, нами не проводились. У ММСК из различных жировых депо тесты поглощения Ac LDL и связывания лектина (UEA) (рис. 4Д, Е) были отрицательными, капилляроподобные структуры на Матригеле (рис. 5Г, Д) не образовывались, что подтверждает отсутствие у них эндотелиальных функций. Различия фенотипа между ММСК из ПЖ и ЭЖ,
в основном, касались уровня экспрессии CD146: в культуре из ПЖ 5,04% (3,56-6,07) клеток были позитивны по CD146 (рис. 6А), тогда как в культуре из ЭЖ все клетки были негативны по этому маркеру (рис. 6Б).
В отдельных образцах из ПЖ и Эж были получены колонии или кластеры (группы клеток) клеток округлой или полигональной формы, соответствующие по морфологии «булыжной мостовой» и классифицированные как КФЭК (рис. 1Е, И), что подтверждалось
рис. 7. Характеристика пролиферативной активности культур, сформировавших колонии КФЭК: А — условное разделение культур по пролиферативной активности на основе PDT (ч.) (M, upper and lower limit); Б — распределение культур из различных источников по количеству положительных результатов культивирования и уровню пролиферативной активности
наличием популяции CD31+CD146+ и увеличением экспрессии CD309 (рис. 6). Колонии и кластеры КФЭК визуализировались в виде отдельных групп клеток CD31+CD144+vWF+ на фоне вытянутых, веретеновид-ных ММСК, негативных по данным маркерам (рис. 3Е, К). КФЭК в смешанных культурах сохраняли способность поглощать Ac LDL и связывать лектин (рис. 4Б, В). Однако быстро пролиферирующие ММСК заселяли всю свободную поверхность, препятствуя экспансии КФЭК (рис. 1И). Колонии КФЭК относительно медленно пролиферировали даже в случае предпринятой попытки механической очистки поверхности от ММСК.
Заселение на Матригель положительных образцов из ПЖ и ЭЖ, показало наличие ангиогенной активности (рис. 5Б, В): капилляроподобные структуры были сформированы, но количество разветвлений, общая длина трубок и количество петель были значительно меньше, чем в культуре КФЭК, выделенной из МНФ (р<0,05) (рис. 5Е). Данный факт вполне объясним, поскольку культуры из СВФ имели смешанный состав и кроме КФЭК содержали большое количество ММСК. Характеристики трубчатых структур в культурах из ПЖ и ЭЖ значимо не различались, однако отмечалась тенденция к более низким показателям в образцах культур из ПЖ.
Результаты культивирования
образцов МНФ и СВФ
Наибольшее количество положительных результатов по выделению КФЭК было зарегистрировано в образцах из МНФ (62,5%, n=5) и СВФ-ЭЖ (50%, n=4) по сравнению со СВФ-ПЖ (25%, n=2). К сожалению, ввиду малочисленной выборки (n=8) не было получено достоверных различий по источникам.
Пролиферативная активность КФЭК
ПА культур была изучена по времени удвоения популяции (PDTs). Согласно полученным данным все выделенные образцы КФЭК по уровню ПА были условно разделены на четыре группы: с высокой ПА — PDTs=20,4 ч., средней — PDTs=63,9 (50,8-75,2) ч., низкой — PDTs=108,5 (89,1-122,5) ч., а кластеры клеток были отнесены к группе с очень низкой ПА (рис. 7).
В образцах с очень низкой ПА клетки делились крайне медленно, поэтому в их оценке мы руководствовались лишь визуальными данными без расчета PDTs (рис. 7А).
В соответствии с выбранным распределением уровня ПА, культуры КФЭК из МНФ (пересчет на 5 положительных образцов) в 20% образцов (n=1) обладали высокой, в 40% средней (n=2) и в 20% низкой ПА (n=1) (рис. 7Б). Культуры КФЭК
таблица 2. Эффективность выделения и пролиферативная активность культур КФЭК из МНФ и СВФ у различных доноров
Пациент МНФ СВФ-ПЖ СВФ-ЭЖ
А 4 0 0
Б 3 0 3
В 3 0 2
Г 2 2 0
Д 1 0 0
Е 0 0 2
Ж 0 1 1
з 0 0 0
Примечание: градация пролиферативной активности: 4 — высокая, 3 — средняя, 2 — низкая, 1 — очень низкая. 0 — отрицательный результат культивирования
из СВФ-ЭЖ в 25% продемонстрировали среднюю ПА №Тз=75,2 ч.) (1 из 4 образцов). Низкая ПА была свойственна 50% культур из СВФ-ПЖ (1 из 2 образцов) и СВФ-ЭЖ (2 из 4 образцов) для СВФ-ПЖ —
115,3 ч., для СВФ-ЭЖ — 96,3 и 107,4 ч.). По 1 образцу из каждого источника (20% для МНФ, 50% для СВФ-ПЖ и 25% для СВФ-ЭЖ) имели очень низкую ПА и представляли собой кластеры клеток.
ММСК из жировой ткани демонстрировали высокую ПА. Среднее значение PDTs для популяций ММСК из ПЖ составило 4,6 (3,78-7,95) ч., а из ЭЖ — 6,7 (4,73-9,95) ч. Достоверных различий ПА ММСК в зависимости от источника СВФ не было обнаружено.
Сравнение эффективности выделения КФЭК из МНФ и жировой ткани у каждого донора не выявило каких-либо общих закономерностей и различий: например, у пациента А были получены колонии КФЭК из МНФ с удовлетворительной ПА при отрицательном результате культивирования СВФ; у пациента Е отрицательный результат получения КФЭК из МНФ сочетался с положительным результатом выделения КФЭК из СВФ-ЭЖ (табл. 2).
обсуждение
Растущие потребности тканевой инженерии и регенеративной медицины диктуют необходимость поиска эффективных и доступных источников аутогенных ЭК. У взрослого человека такими источниками являются ПК и жировая ткань.
Наибольшее количество исследований посвящено получению ЭПК из ПК. Основными способами первичного выделения ЭПК из крови являются адгезия (выделение «прилипающей» фракции) и магнитный или флуоресцентный сортинг/сепарация — MASC (магнитно-активированный клеточный сортинг) и FASC (флуоресцентно-активированный клеточный сортинг) [1, 28]. Каждый из этих вариантов имеет свои преимущества и ограничения. Использование методов MASC и FASC весьма затратно, при этом не исключено нежелательное воздействие антител и магнитных частиц на клетки, которые в перспективе будут использованы для трансплантации человеку. Однако главная проблема получения ЭПК с помощью сепарации связана с отсутствием единых критериев и маркеров. В ранних исследованиях для детекции или выделения ЭПК использовали различные маркеры, что привело к присвоению этого термина большому количеству разнородных групп клеток [29]. В настоящее время накоплено достаточно знаний о природе ЭПК in vitro, в результате был сделан вывод, что потомками ЭПК являются КФЭК. Тем не менее, требуется серьезная стандартизация подходов к их выделению и типированию [30].
Наш выбор максимально физиологичной процедуры получения ЭПК без использования антител, магнитных частиц и генетических модификаций вызван стремлением минимизировать нежелательные воздействия на клетки и снизить вероятность клеточных повреждений. Адгезионный способ не позволяет сразу выделить чистую культуру, и на первом этапе нами была получена смешанная культура. Пересев культур способствовал удалению лейкоцитов и достижению высокой чистоты культур КФЭК (на 2 пассаже более 95%, на 3 пассаже более 99%) без привлечения дополнительных способов очистки.
Использование жирового депо в качестве источника ЭПК является более новым и менее изученным направлением по сравнению с ПК. Представлены результаты и описаны протоколы получения ЭК из подкожного и висцерального жира [31]. Однако до сих пор не проводилось исследований по выделению и изучению свойств ЭК из эпикардиального жирового депо. Нами впервые получены КФЭК из ЭЖ и даны их основные характеристики, а также проведено сравнение с аналогичными данными по ПЖ.
Описанные в литературе протоколы выделения ЭК из жировой ткани сильно различаются. В основной массе протоколов используют липоаспират после липосакции, как наиболее доступный и эффективный материал [15, 18, 32]. Однако необходимо учитывать, что липосакция весьма травматична и сопровождается разрушением подкожно-жировой ткани вместе с питающими сосудами, из которых изливается кровь, поэтому остатки поврежденных сосудов и кровь могут служить источниками ЭПК. Для чистоты эксперимента, характеризующего возможность получения ЭК/ЭПК непосредственно из данного жирового депо, нами были исследованы иссеченные кусочки жировой ткани.
Способы получения ЭК из жировой ткани можно разделить на две основные группы: получение непосредственно ЭК/ЭПК и выделение ММСК с последующей дифференцировкой в ЭК/ЭПК с помощью комбинации специфических факторов роста. Способность ММСК дифференцироваться в ЭК/ЭПК под влиянием факторов роста доказана в одних работах [19, 20], и опровергнута в других [15, 21]. В данном исследовании мы культивировали в течение 21 сут. ММСК из различных жировых депо в полной ростовой среде для
эндотелиальных клеток, содержащей факторы роста: человеческий эпидермальный фактор роста (hEGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста фибробластов основной (hFGF-B) и инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1). Однако ни в одном случае не наблюдалась дифференцировка ММСК в КФЭК, и, соответственно, колонии КФЭК не были получены в тех образцах, где они отсутствовали изначально. Поэтому мы согласны с авторами, отрицающими возможность дифференцировки ММСК в эндотелиальные клетки под действием указанных факторов роста. Успешные результаты дифференцировки ММСК в ЭК/ЭПК, вероятно, можно объяснить присутствием ЭПК в СВФ, поскольку в ряде работ использовался неселективный адгезионный способ изоляции [19, 33, 34]. В связи с выше изложенным для получения ЭК/ЭПК из жировой ткани целесообразно выбирать протоколы прямой изоляции, основанные на MACS [35], FaCS [36, 37] или других способах выделения чистой культуры ЭК [38].
В случае получения смешанных культур ЭК и ММСК предлагаются различные способы очистки (механическое удаление ненужных клеток, селективное открепление холодной трипсинизацией, бессывороточное культивирование), но они не дают полного освобождения от ММСК [39]. Мы использовали механическую очистку, холодную трипсинизацию, разницу скорости адгезии ММСК и ЭК, но также не достигли удовлетворительного результата. Поэтому для эффективного удаления нежелательной популяции клеток также следует использовать MASC и FASC [37], однако нужно учитывать, что тип выделенных клеток будет сильно зависеть от используемого сочетания антигенов.
Отсутствие единых протоколов выделения ЭПК/ ЭК из жировых депо обуславливает сложности интерпретации и сравнения опубликованных результатов. Гетерогенность культур, изолированных методом адгезии, несет определенную погрешность количественных данных о содержании ЭК/ЭПК в данном источнике. Предел точности существует и для результатов, полученных при использовании магнитной сепарации. Большинство исследований, выполненных с привлечением магнитной сепарации для выделения ЭПК из СВФ-ПЖ, опираются на сочетания двух антигенов (CD34+CD31 + [31], CD45-CD31 + [35], CD31+CD90 [37] и т. д.), что ведет к получению и описанию различных популяций клеток. Кроме того, практически невозможно выделить популяцию ЭК из жировой СВФ по двум маркерам, поскольку в большинстве случаев комбинация неспецифична и ее применение приводит к ложному обеднению или ошибочному включению нецелевых клеток. Для корректного сравнительного анализа ЭК, полученных из различных жировых депо, целесообразно использовать данные внутри одного исследования, поскольку метод выделения клеток будет единым. В работе B. Haynes и соавт. (2001) выполнено сравнение ЭПК из подкожной и висцеральной жировой ткани и показано, что их количество и основные функциональные и феноти-пические характеристики значимо не различались [31]. Из 2-3 г жировой ткани с помощью MACS были изолированы CD34+CD31 + клетки в количестве 3-5% от всех клеток СВФ, которые, по описанию авторов, не экс-прессировали CD45 и представляли собой популяцию ЭПК. Примечательно, что у одного и того же донора были отмечены значительные функциональные различия ЭПК (адипогенный потенциал), выделенных из подкожного и висцерального жира, при этом отсутствовали общие закономерности (n=7). Нам так же не удалось выявить общие тенденции и закономерности у доноров (n=8)
по уровню пролиферативной активности и эффективности получения КФЭК из различных источников (МНФ, СВФ-ПЖ и ЭЖ) (табл. 2). Причина такой неоднородности результатов не ясна и может быть связана как с особенностями источника и самой популяции ЭК, так и с методом получения и небольшой выборкой.
Учитывая разную биологическую активность ЭЖ и ПЖ, мы попытались выявить морфологические, фенотипические и функциональные отличия изолированных из них культур. Были отмечены некоторые фенотипические различия по экспрессии CD146: культуры ММСК из СВФ-ПЖ обладали умеренной экспрессией CD146, тогда как культуры из ЭЖ были CD146-негативны. Полученные результаты, вероятно, можно объяснить присутствием перицитов в СВФ-ПЖ или особенностью ММСК из данного источника. Перициты в культуре имеют много общего с ММСК, но отличаются от них высокой экспрессией CD146 [40]. Так же возможны различия по ряду других антигенов, которые не были исследованы в формате нашей работы.
Если не принимать в расчет кластеры или группы ЭК, которые практически не делятся и поэтому в перспективе бесполезны для наращивания клеточной массы (очень низкая пролиферативная активность), то из СВФ-ПЖ в 12,5%, СВФ-ЭЖ в 37,5%, а из МНФ в 50% случаев удалось выделить КФЭК. На основании этих данных можно сделать вывод, что при выбранном щадящем методе изоляции и объеме материала, кусочки подкожной жировой ткани являются малоэффективным материалом для получения КФЭК. Кроме того, культуры из жировой ткани обладали низкой ПА и были гетеро-генны с большим содержанием ММСК. Тем не менее, для выполнения задач, при которых не нужна высокая чистота КФЭК, с успехом может использоваться жировая ткань или липоаспират. В противном случае необходимо подключать дополнительные способы очистки.
ЭЖ обладает более высокой биологической и энзима-тической активностью по сравнению с ПЖ [22]. В нашем исследовании СВФ-ЭЖ показала достаточно хорошие результаты получения КФЭК по сравнению с СВФ-ПЖ, как по количеству положительных результатов (37,5%), так и по уровню ПА полученных культур. Несмотря на эти оптимистичные данные, доступ к ЭЖ открывается лишь в период выполнения открытых операций на сердце.
МНФ крови продемонстрировала самую высокую эффективность при изоляции КФЭК. Из 50% образцов МНФ были выделены гомогенные культуры КФЭК. Кроме
ЛИТЕРАТУРА:
1. Yoder M.C., Mead L.E., Prater D. et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood 2007; 109(5): 1801-9.
2. Reinisch A., Hofmann N.A., Obenauf A.C. et al. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood 2009; 113(26): 6716-25.
3. Chong M.S., Ng W.K., Chan J.K. Concise Review: Endothelial Progenitor Cells in Regenerative Medicine: Applications and Challenges. Stem Cells Transl. Med. 2016; 5(4): 530-8.
4. Flex A., Biscetti F., lachininoto M.G. et al. Human cord blood endothelial progenitors promote post-ischemic angiogenesis in immunocompetent mouse model. Thromb. Res. 2016; 141: 106-11.
5. Yu P., Li Q., Liu Y. et al. Pro-angiogenic efficacy of transplanting endothelial progenitor cells for treating hindlimb ischemia in hyperglycemic rabbits. J. Diabetes Complications 2015; 29: 13-9.
6. Bai Y.Y., Wang L., Peng X.G. et al. Non-invasive monitoring of transplanted endothelial progenitor cells in diabetic ischemic stroke models. Biomaterials 2015; 40: 43-50.
7. Li Y.F., Ren L.N., Guo G. et al. Endothelial progenitor cells in ischemic stroke: an exploration from hypothesis to therapy. J. Hematol. Oncol. 2015; 8: 33.
8. Tam J.C., Ko C.H., Lau K.M. et al. Enumeration and functional investigation of endothelial progenitor cells in neovascularization of diabetic foot ulcer rats with a Chinese 2-herb formula. J. Diabetes 2015; 7: 718-28.
того, в 60% случаев (3 из 5 образцов) ПА КФЭК из МНФ соответствовала высокой и средней, что в перспективе позволит в короткие сроки нарастить клеточную массу. Для повышения эффективности получения КФЭК из МНФ крови можно увеличить количество забранного материала (нами использовано всего 20 мл крови от каждого пациента). Также в ранее опубликованной нами работе было показано, что количество положительных результатов культивирования повышается, если кровь забрана в период проведения чрескожного коронарного вмешательства со стентированием [14].
Недостатком работы является невозможность предоставить сведения о количестве первичных колоний на единицу материала. Поскольку цель работы заключалась в получении максимального количества аутогенных КФЭК из различных источников, мы использовали протоколы с «обогащением», при которых ранний пересев первичных колоний КФЭК [15, 27] способствует росту новых колоний. Это ускоряет наращивание клеточной массы и увеличивает ее количество, однако делает невозможным подсчет первичных колоний, так как малочисленные колонии или группы клеток морфологически плохо различаются среди всей культуры. В дальнейших работах отказ от раннего пересева первичных колоний КФЭК позволит провести их точный подсчет для количественной оценки на единицу материала и выполнить количественное сравнение их содержания в различных источниках.
Заключение
ПК представляет собой наиболее эффективный источник аутогенных КФЭК по сравнению с жировой ткань, поскольку позволяет получать чистые культуры с пролиферативной активностью, достаточной для наращивания клеточной массы без использования дополнительных средств очистки. Тем не менее, жировая ткань может служить подходящим источником ММСК и смешанных культур ММСК и эндотелиальных клеток.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда. Гоант РНФ 17-75-20004 «Разработка физиологически обоснованной технологии изготовления персонифицированного тканеинженер-ного сосудистого импланта малого диаметра in vitro в условиях имитации естественного кровотока с использованием клеточных технологий».
9. Mehmood A., Ali M., Khan S.N. et al. Diazoxide preconditioning of endothelial progenitor cells improves their ability to repair the infarcted myocardium. Cell Biol. Int. 2015; 39: 1251-63.
10. Sheng Z.L., Yao Y.Y., Li Y.F. et al. Transplantation of bradykinin-preconditioned human endothelial progenitor cells improves cardiac function via enhanced Akt/eNOS phosphorylation and angiogenesis. Am. J. Transl. Res. 2015; 7: 1214-26.
11. Ingram D.A., Mead L.E., Tanaka H. et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood 2004; 104(9): 2752-60.
12. Moon S.H., Kim S.M., Park S.J. et al. Development of a xeno-free autologous culture system for endothelial progenitor cells derived from human umbilical cord blood. PLoS One 2013; 8: e75224.
13. Lin R.Z., Dreyzin A., Aamodt K. et al. Functional endothelial progenitor cells from cryopreserved umbilical cord blood. Cell Transplant. 2011; 20: 515-22.
14. Matveeva V., Khanova M., Sardin E. et al. Endovascular Interventions Permit Isolation of Endothelial Colony-Forming Cells from Peripheral Blood. Int. J. Mol. Sci. 2018; 19(11): pii: E3453.
15. Pham P.V., Vu N.B., Nguyen H.T. et al. Isolation of endothelial progenitor cells from human adipose tissue. Biomed. Res. Ther. 2016; 3(5): 645-52.
16. Francis M.P., Sachs P.C., Elmore L.W. et al. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis 2010; 6: 11-4.
17. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8: 315-7.
18. Martínez-Estrada O.M., Muñoz-Santos Y., Julve J. et al. Human adipose tissue as a source of Flk-1 + cells: new method of differentiation and expansion. Cardiovasc. Res. 2005; 65(2): 328-33.
19. Planat-Benard V., Silvestre J.S., Cousin B. et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation 2004; 109: 656-63.
20. Miranville A., Heeschen C., Sengenes C. et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation 2004; 110: 349-55.
21. Kondo K., Shintani S., Shibata R. et al. Implantation of adipose-derived regenerative cells enhances ischemia-induced angiogenesis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2009; 29: 61-6.
22. Yim J., Rabkin S.W. Differences in Gene Expression and Gene Associations in Epicardial Fat Compared to Subcutaneous Fat. Horm. Metab. Res. 2017; 49(5): 327-37.
23. Pham P., Vu N., Nguyen H. et al. Isolation of endothelial progenitor cells from human adipose tissue. Biomedical Research and Therapy 2016; 3(05): 645-52.
24. Zhou L., Xia J., Qiu X. et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One 2015; 10(2): e0117644.
25. Ramakrishnan V.M., Boyd N.L. The Adipose Stromal Vascular Fraction as a Complex Cellular Source for Tissue Engineering Applications. Tissue Eng. Part B Rev. 2018; 24(4): 289-99.
26. Sidney L.E., Branch M.J., Dunphy S.E. et al. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells 2014; 32(6): 1380-9.
27. Kolbe M., Dohle E., Katerla D. et al. Enrichment of outgrowth endo-thelial cells in high and low colony-forming cultures from peripheral blood progenitors. Tissue Eng. Part C Methods 2010; 16(5): 877-86.
28. Tura O., Skinner E.M., Barclay G.R. et al. Late outgrowth endothelial cells resemble mature endothelial cells and are not derived from bone marrow. Stem Cells 2013; 31(2): 338-48.
29. Матвеева В.Г., Антонова Л.В., Барбараш О.Л. Эндотелиальные прогениторные клетки: идентификация, свойства и возможности использования. Современное состояние проблемы. Цитология 2018;
60(4): 241-51. (Matveeva V.G., Antonova L.V., Barbarash O.L. Endothelial progenitor cells: identification, properties and possibilities of use. The current state of the problem. Cytology 2018; 60(4): 241-51).
30. Smadja D.M., Melero-Martin J.M., Eikenboom J. et al. Standardization of methods to quantify and culture endothelial colony-forming cells derived from peripheral blood: Position paper from the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC. J. Thromb. Haemost. 2019; 17(7): 1190-4.
31. Haynes B.A., Huyck R.W., James A.J. et al. Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue. J. Vis. Exp. 2008; 137: e57804.
32. Arts C.H., Heijnen-Snyder G.J., Joosten P.P. et al. A novel method for isolating pure microvascular endothelial cells from subcutaneous fat tissue ideal for direct cell seeding. Lab. Invest. 2001; 81(10): 1461-5.
33. Heydarkhan-Hagvall S., Schenke-Layland K., Yang J.Q. et al. Human adipose stem cells: a potential cell source for cardiovascular tissue engineering. Cells Tissues Organs 2008; 187(4): 263-74.
34. El-Edela R.H., Metwally H.G., Khodeer S.A. et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into vascular endothelial cells: the future revascularization therapy in ischemic tissue. Menoufia Med. J. 2017; 30: 147-50.
35. Fischer L.J., McIlhenny S., Tulenko T. et al. Endothelial differentiation of adipose-derived stem cells: effects of endothelial cell growth supplement and shear force. J. Surg. Res. 2009; 152(1): 157-66.
36. Cao Y., Sun Z., Liao L. et al. Human adipose tissue-derived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improve postnatal neovascu-larization in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 332(2): 370-9.
37. Monsuur H.N., Weijers E.M., Niessen F.B. et al. Extensive Characterization and Comparison of Endothelial Cells Derived from Dermis and Adipose Tissue: Potential Use in Tissue Engineering. PLoS One 2016; 11(11): e0167056.
38. Zhou L., Xia J., Qiu X. et al. In Vitro Evaluation of Endothelial Progenitor Cells from Adipose Tissue as Potential Angiogenic Cell Sources for Bladder Angiogenesis. PLoS One 2015; 10(2): e0117644.
39. Kisselbach L., Merges M., Bossie A. et al. CD90 Expression on human primary cells and elimination of contaminating fibroblasts from cell cultures. Cytotechnology 2009; 59(1): 31-44.
40. Lv F.J., Tuan R.S., Cheung K.M. et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells 2014; 32(6): 1408-19.
Поступила: 16.052019
