CC BY
49
оригинальные исследования
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДк 578.832.1.083.2
Петрова-Бродская А.В.12, Бондаренко А.Б.1'3, Тимин А.С.2'4, Плотникова М.А.1, Афанасьев М.В.3, Семенова А.А.5, Лебедев К.И.1, Горшков А.Н.17, Горшкова М.Ю.6, Егоров В.В.1, Клотченко С.А.1, Васин А.В.12
сравнение эффективностей ингибирования вируса гриппа а
IN VITRO комплексами малых интерферирующих рнк с производными хитозана, полиэтиленимином и гибридными
микрокапсулами на основе полиаргинина с неорганическими
компонентами
1 ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России, 197376, г. Санкт-Петербург;
2 ФГАО УВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого», 195251, г. Санкт-Петербург;
3 ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет», 199034, г. Санкт-Петербург;
4 ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет», 634050, г. Томск;
5 ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России, 197376, г. Санкт-Петербург;
6 ФГБУН «Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева» РАН, 119991, г. Москва 7ФГБУН «Институт цитологии» РАН, 194064, г. Санкт-Петербург
Механизм РнК-интерференции открывает широкие возможности при создании новых препаратов для лечения гриппа. Он позволяет точечно воздействовать на консервативные участки вирусных генов и блокировать их экспрессию. Проведена сравнительная оценка различных носителей для внутриклеточной доставки малых интерферирующих РнК: метилгликольхитозана, кватернизованного хитозана, полиэтиле-нимина и гибридных микрокапсул на основе полиаргинина с неорганическими компонентами. Кроме того, оценивали противовирусную активность трех малых интерферирующих РнК, направленных на гены NP (np-717, np-1496) и pa (Pa-1630) вирусов гриппа А, в зависимости от выбранного носителя. По результатам исследования наиболее эффективные внутриклеточная доставка и противовирусная активность были показаны для гибридных микрокапсул.
Ключевые слова: вирус гриппа; противовирусная активность; малые интерферирующие РНК; системы доставки; хитозан; полиэтиленимин; гибридные микрокапсулы. Для цитирования: Петрова-Бродская А.В., Бондаренко А.Б., Тимин А.С., Плотникова М.А., Афанасьев М.В, Семенова А.А., Лебедев К.И., Горшков А.Н., Горшкова М.Ю., Егоров В.В., Клотченко С.А., Васин А.В. Сравнение эффективностей ингибирования вируса гриппа А in vitro комплексами малых интерферирующих РНК с производными хитоза-на, полиэтиленимином и гибридными микрокапсулами на основе полиаргинина с неорганическими компонентами. Вопросы вирусологии. 2017; 62(6): 259-265. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2017-62-6-259-265
Petrova-Brodskaya А.V.12, Bondarenko А.В.13, Timin А.S.24, Plotnikova М.А.1, Afanas'ev ММ13, Semenova А.А.5, Lebedev K.I.1, Gorshkov А.Ы.17, Gorshkova M.Yu.6, Egorov V.V.1, Klotchenko SM.1, Vasin А-V12 COMPARISON OF INFLUENZA A VIRUS INHIBITION IN VITRO BY siRNA COMPLEXES WITH CHITOSAN DERIVATIVES, POLYETHYLENEIMINE AND HYBRID POLYARGININE-INORGANIC
MICROCAPSULES
1 Research Institute of Influenza, St. Petersburg, 197376, Russian Federation;
2 Peter the Great St. Petersburg Polytechnic University, St. Petersburg, 195251, Russian Federation;
3 St. Petersburg State University, St. Petersburg, 199034, Russian Federation;
4 National Research Tomsk Polytechnic University, 634050, Tomsk, Russian Federation;
5 St. Petersburg State Chemical Pharmaceutical Academy, St. Petersburg, 197376, Russian Federation;
6 A.V. Topchiev Institute of Petrochemical Synthesis, Moscow, 119991, Russian Federation institute of Cytology, St.Petersburg, 194064, Russian Federation
Anti-influenza drugs and vaccines have a limited effect due to the high mutation rate of virus genome. The direct impact on the conservative virus genome regions should significantly improve therapeutic effectiveness. The RNA interference mechanism (RNAi) is one of the modern approaches used to solve this problem. In this work, we have investigated the antiviral activity of small interfering RNA (siRNA) against the influenza A/PR/8/34 (H1N1), targeting conserved regions of NP and PA. Polycations were used for intracellular siRNA delivery: chitosan's derivatives (methylglycol and quaternized chitosan), polyethyleneimine, lipofectamine, and hybrid organic/non-organic microcapsules. A comparative study of these delivery systems with fluorescent labeled
Для корреспонденции: Петрова-Бродская Александра Валерьевна, мл. науч. сотр. лаб. внутриклеточного сигналинга и транспорта «НИИ гриппа» Минздрава России, 197376, г. Санкт-Петербург. E-mail: [email protected]
ORIGINAL REsEARcH
siRNA was conducted. The antiviral activity of three small interfering RNAs targeting the NP (NP-717, NP-1496) and PA (PA-1630) influenza A viruses genes was demonstrated, depending on the chosen carrier. The most effective intracellular delivery and antiviral activity were observed for hybrid microcapsules.
K e y w o r d s: antiviral activity; NP, PA, .small interfering RNA (siRNA); delivery systems; lipofectamine; chitosan; polyeth-yleneimine; microcapsules.
For citation: Petrova-Brodskaya A.V., Bondarenko A.B., Timin A.S., Plotnikova M.A., Afanas'ev M.V., Semenova A.A., Lebedev K.I., Gorshkov A.N., Gorshkova M.Yu., Egorov V.V., Klotchenko S.A., Vasin A.V. Comparison of influenza A virus inhibition in vitro by siRNA complexes with chitosan derivatives, polyethyleneimine and hybrid polyarginine-inorganic microcapsules. Voprosy Virusologii (Problems of Virology, Russian journal). 2017; 62(6): 259-265. (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2017-62-6-259-265
For correspondence: Alexandra V. Petrova-Brodskaya, Research assistant in the Laboratory of intracellular signaling and transport, Research Institute of Influenza, St. Petersburg, 197376, Russian Federation. E-mail: [email protected] Information about authors:
Petrova-Brodskaya A.V., http://orcid.org/0000-0001-5130-3755; Timin A.S., http://orcid.org/0000-0002-0276-7892; Plotnikova M.A., https://orcid.org/0000-0001-8196-3156; Gorshkov A.N., http://orcid.org/0000-0003-2303-1144;
Gorshkova M.Yu., http://orcid.org/0000-0002-6249-1031; Egorov V.V., http://orcid.org/0000-0002-3670-8962;
Klotchenko S.A., http://orcid.org/0000-0003-0289-6560; Vasin A.V., http://orcid.org/0000-0002-1391-7139
Acknowledgment. This work was supported by the Russian Science Foundation (Grants No. 15-15-00170, No. 17-73-10023). Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Received 17 August 2017 Accepted 25 August 2017
Введение
Грипп—острая респираторная инфекция, вызывающая сезонные эпидемии и периодические пандемии. Этиологическим агентом заболевания являются одноименные (-)-РНК-содержащие вирусы семейства Orthomyxoviri-¿ае. Для вирусов гриппа характерна чрезвычайно высокая степень генетической изменчивости, приводящая к быстрому развитию устойчивости к противовирусным препаратам и вакцинам [1, 2]. Для решения этой проблемы необходимы новые подходы к разработке средств лечения гриппа, к которым относится, например, применение малых интерферирующих РНК ^РНК) [3].
РНК-интерференция — это осуществляемый малыми РНК высокоспецифичный механизм подавления экспрессии генов на уровне мРНК, приводящий к блокированию трансляции. РНК-интерференция может использоваться для выключения определенных генов в экспериментальной биологии и биотехнологии, а также в медицине для лечения инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний [4—6]. В ряде исследований была продемонстрирована эффективность siРНК для ингибирования вируса гриппа и других респираторных вирусов [7, 8]. Однако практическое применение терапевтических siРНК осложнено их низкой стабильностью, необходимостью использования эффективных и безопасных средств доставки в клетки-мишени, а также возможной иммуногенностью [9, 10]. Для преодоления подобных барьеров активно ведутся поиски новых систем доставки малых РНК, отвечающих таким параметрам, как способность связывать нуклеиновые кислоты, биосовместимость, биодеградация, низкая токсичность и высокая эффективность трансфекции клеток.
В работе приведены сравнительные исследования эффективности различных носителей (Lipofectamine® 2000, полиэтиленимин (ПЭИ), производные хитозана, гибридные микроконтейнеры на основе полиаргинина с неорганическими компонентами) для доставки противовирусных siРНК, направленных на гены вирусов гриппа А, кодирующие субъединицу полимеразы РА и нуклеопротеин К?. При обработке клеток исследуемыми препаратами ^РНК в составе комплексов с транс-фецирующим агентом) и их последующем заражении вирусом гриппа было показано существенное снижение
репродукции вирусных частиц как в самих клетках, так и во внеклеточной среде. Наименьшая токсичность, наибольшие эффективность трансфекции клеток и противовирусный эффект среди всех изученных систем доставки были показаны для гибридных микрокапсул. Полученные в работе данные могут быть использованы для последующего исследования противовирусной активности siPHK на животной модели инфекции.
Материал и методы
Материал. Трансфекционные агенты: ПЭИ (P3143, «Sigma-Aldrich»), Lipofectamine® 2000 (11668019, «In-vitrogen»), метилгликольхитозан (МГХ) (M3150, «Sigma-Aldrich»); модифицированный полимер деацетилиро-ванного хитина -кватернизованный хитозан (КХ) Mw > 200 000 (Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН, Москва) [11]. Этилендиаминтетрауксус-ная кислота, фосфатно-солевой буфер, диметилсульфок-сид (все производства «Sigma-Aldrich») были использованы без дополнительной очистки.
Гибридные микрокапсулы, пустые и с упакованной siPHK, были синтезированы и охарактеризованы по описанной ранее методике [12] в лаборатории микро-капсулирования и управляемой доставки биологически активных соединений RASA-центра (Политехнический университет Петра Великого, Санкт-Петербург).
siPHK. При подборе siPHK выбирали наиболее консервативные участки генов-мишеней и руководствовались «правилом Тушла» [13, 14]. Все РНК-нуклеотиды были синтезированы компанией «ДНК-Синтез» (Москва), последовательности приведены далее; в РНК-олигонуклеотиде NP-1496-1/2(dTdT) 2-гидроксильная группа была заменена на 2-О-метильную группу в каждом нуклеотидном остатке, РНК-олигонуклеотид PA-1630-FAM содержит карбоксифлюоресцеин (FAM) на З'-конце. Олигонуклеотиды были растворены в depcH2O (100 мкМ). Двухцепочечные siPHK получали в процессе термического отжига и гибридизации по ранее описанному протоколу [12]. Полученные РНК-дуплексы были проанализированы методом электрофоретического разделения в 15% полиакриламидном геле.
Культуры клеток. В работе использовали монослой-ные клеточные культуры Мадин-Дарби почек собак
оригинальные исследования
(Madine-Darby canine kidney, MDCK) и эпителия лёгких человека (А549), полученные из коллекции ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России (Санкт-Петербург). Клетки культивировали в среде DMEM («Биолот», Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Biowest», Франция). Все опыты проводили на суточном монослое с плотностью 105 клеток на 1 см2.
Вирусы. Использовали вирус гриппа A/PR/8/34 (H1N1) с титром 2,69^106 (50% тканевая цитопатическая доза, ТЦИД50) из коллекции ФГБУ «НИИ гриппа». Культивирование вируса проводили на 10-дневных куриных эмбрионах по методике, приведенной в работе [15]. Инфекционный титр вируса определяли на клеточной культуре MDCK в соответствии с данными в работе [15]; титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча [16] с использованием ТЦИД50.
Антитела. Для выявления вирусного белка NP использовали моноклональные мышиные антитела 6D11, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), полученные в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов ФГБУ «НИИ гриппа».
Приготовление комплексов с siPHK. Комплексы на основе катионных полимеров полиплек-сов получали в процессе смешивания эквивалентных объемов водных растворов нуклеиновых кислот и растворов поликатионов с различной концентрацией, чтобы достичь соотношения азотных групп полимера (N) к фосфатным группам РНК (P) (соотношение N/P) в расчёте на один нуклеотид и одно мономерное звено в промежутке от 1/128 до 128/1. Готовые смеси интенсивно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 30 мин. Концентрации рассчитывали по приведённой ниже формуле, для всех экспериментов определяли массовую концентрацию поликатиона, необходимого для создания комплекса с 1 мкмоль siРНК согласно табл. 1.
Mn , /x ,
N/P = - p p
Таблица 1 Концентрации поликатионов в комплексе с siPHK
Концентрация
ПЭИ
МГХ
КХ
Mnpol, г/моль 43 375 298
xpol, мг/мл, N/P = 1 на 1-10"6 моль $1РНК 0,94 8,2 6,52
Конечная концентрация полимера в добавляе- 0,48 4,1 3,8 мом растворе полиплексов (N/P = 1), мкг/мл
получали смешиванием разведений полимеров с 0,1 мкмоль siРНК. Комплексы добавляли к монослою клеток A549 с последующей инкубацией в течение 24 ч. Жизнеспособность клеток оценивали при помощи микро-тетразолиевого теста (МТТ, 3-(4,5-диметилазол-2-ил) 2,5-дифенилтетразолия бромид на PBS). Раствор МТТ в концентрации 2,5 мг/мл вносили на предварительно отмытые PBS клетки в лунках 96-луночных планшетов и инкубировали 4 ч при 37°C в атмосфере 5% CO,, затем раствор сбрасывали и использовали мкл) для разрушения клеточных мембран и растворения осадка. Оптическую плотность измеряли на план-
♦
%
г 100
- 90
- 80 ? « ® 5
- 70 5 ä
-60
О о
-50
-40 £ §
-30 I б ® О
-20 о Е CL О
с
-10
- 0
15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Концентрация поликатиона в среде, мкг/мл
Mnmr/ y„.r.
RNA s RNA
где МпрЫ — молекулярная масса мономерного звена поликатиона (в г/моль); MnRNA = 320 г/моль; хрЫ — концентрация поликатиона (в г/мл); yRNA — концентрация siPHK (~0,7 мг/мл).
Комплексы siPHK с липофектамином были получены путём смешивания реагента Lipofectamine® 2000 и siPHK в соотношениях, указанных в протоколе производителя. Комплексы siPHK с поликатионами в различных соотношениях разбавляли не содержащей сыворотку средой и вносили в лунки планшета. siPHK с Lipofectamine® 2000 вносили согласно протоколу производителя. Микрокапсулы в водном растворе добавляли в среду, доводя до нужной концентрации по siPHK, и вносили к клеткам в соотношении приблизительно 2—5 микрокапсул на клетку.
Оценка жизнеспособности клеток. Kомплексы с siPHK с поликатионами
i
I
%
- 100
- 90 -80 -70 -60 -50 -40
- 30 -20
- 10 - 0
£ Е
i °
0 о
1 5 £ | S §
ф О
о t
CL о
с
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,51010,511 Концентрация поликатиона в среде, мкг/мл
♦ ПЭИ
КХ
О МГХ
Рис. 1. Токсическое действие комплексов поликатионов ПЭИ, МГХ и КХ с siРНК (1 иМ) с различными концентрациями по поликатиону на клеточный монослой
А549 (50 000 клеток).
problems of virology. 2017; 62 (6)
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2017-62-6-259-265 ORIGINAL REsEARcH
шетном ридере CLARIOstar («BMG LABTECH», Германия) в режиме снятия тотального поглощения с лунки на длине волны 570 нм.
Определение эффективности внутриклеточной доставки siPHK. Для оценки эффективности проникновения siPHK в клетки была использована FAM-меченая siPHK. Исследовали комплексы поликатионов в следующих соотношениях N/P: 32:1; 16:1; 8:1; 4:1, 2:1; 1:1. Полиплексы, siPHK с липофек-тамином, а также микрокапсулы с FAM-меченой siPHK, растворённые в не содержащей сыворотки среде, вносили в лунки 96-луночного планшета в трех повторах (концентрация siPHK в лунке 1 мкМ). Через 24 ч клетки отмывали PBS, чтобы избавиться от не вошедших в клетку комплексов, фиксировали ацетоном, окрашивали DAPI. Изображения, качественно подтверждающие наличие FAM-меченой siPHK в цитоплазме клеток, а также полуколичественный расчет эффективности доставки siPHK с учётом отрицательного контроля (сигнал фона) и нормировки на количество клеток были получены с помощью системы формирования изображений Cytell Cell Imaging System(«GE», США) (настраиваемое приложение MyBioApp).
Определение противовирусной активности siPHK. Противовирусную активность препаратов siPHK оценивали по профилактической схеме на клеточной культуре A549.
Препараты siPHK добавляли к клеткам в лунки планшетов, инкубировали 24 ч (37°C, 5% CO2), отмывали PBS и заражали вирусом в разведениях на поддерживающей среде (DMEM + L-глутамин, 0,1 мкг/мл трипсина и 0,1 мг/мл стрептомицина). Через 30 мин инкубации (8°C) сменяли среду на поддерживающую.
^етки инкубировали 24 и 72 ч (37°C, 5% CO2), после чего оценивали вирусную репродукцию в клетках и вирус-содержащей культуральной жидкости (ВKЖ), полученной от них.
Быстрый скрининг действия siPHK, доставляемой в клетки с помощью ли-пофектамина, проводили на двух клеточных культурах А549 и MDCK по профилактической схеме. Препараты siPHK (50 пмоль/105 клеток) вносили за 1 ч до заражения вирусом в множественности инфекции (MOI) 0,1, выбранной в соответствии с данными в работе [17]. Противовирусную активность оценивали по реакции гемагглютинации (PrA) через сутки.
РГА. Pепродукцию вируса в ВKЖ оценивали методом PrA с 0,5% куриными эритроцитами для двукратно рас-титрованных BK®, полученных от клеток через 24 и 73 ч после заражения, согласно данным в работе [15]. Титр вируса выражали в единицах ГА, обратных максимальному
б
% 100-1
80-
60-
40
20-
0
Микрокапсулы Lipofectamine 2000 Микро капсулы
МГХ
ПЭИ
КХ
Ц Lipofectamine 2000
Соотношение N/P
32/1
16/1
8/1 И 4/1
2/1
1/1
Рис. 2. Эффективность внутриклеточной доставки siPHK. а — визуальное сравнение поликатионной доставки FAM-PA-1630 для наиболее эффективных и наименее токсичных соотношений N/P. Изображения получены с помощью системы формирования изображений Cytell Cell Imaging System («GE», США); б — относительная эффективность (по оси ординат) доставки FAM-PA-1630 различными системами, нормированная на количество клеток.
разведению вызывающих агглютинацию эритроцитов.
Иммуноферментный анализ (ИФА). Накопление вирусного белка КР в инфицированных клетках и ВКЖ, полученных от них, определяли методом прямого ИФА с использованием антител 6D11-HRP по методике, описанной в [12].
Результаты
Эффективность доставки в клетки siРНК, обладающих противовирусной активностью в отношении вируса гриппа А, оценивали с использованием следующих
оригинальные исследования
Последовательности siРНK-олигонуклеотидов
Название siPHK
5' ->3' 3p-seq
5' ->3' 5p-seq
PA-1630 UgAgCCACACAAAUgggAA
NP-717* UUAUgAgAgAAUgUgCAACAU
NP-1496** ggAUCUUAUUUCUUCggAg(dTdT)
Negative siPHK CAUgACCAACAAgAUgAAgAg
UCCCAUUUgUgUggCUCgU gUUgCACAUUCUCUCAUAAgC CUCCgAAgAAAUAAgAUCC(dTdT) CUUCUgCUUgUUggUCAUgCg
Примечание. * — siPHK, описанная в работе [12]; ** — siPHK, описанная в работе [17]
носителей: МГХ, КХ, ПЭИ и гибридных микрокапсул. Характеристика носителей и источники их получения приведены в разделе «Материал и методы». На первом этапе определяли минимальные соотношения N/P, необходимые для полного связывания siРНК с поликатионами. Для этого использовали метод электрофоретическо-го разделения комплексов siРНК с носителями в агароз-ном геле с детекцией нуклеиновых кислот бромистым этидием. Для МГХ комплексы приобретают положительный заряд и экранируют siРНК при значениях N/P свыше 1:2, для КХ — при N/P свыше 2, для ПЭИ — при N/P свыше 1:4. Емкость микрокапсул и предельные значения концентрации образующих их полимеров и органических компонентов для длительной защиты siРНК от эндонуклеаз и их эффективной доставки внутрь клетки описаны ранее в работах [12, 18].
Далее определяли максимально допустимые дозы препаратов, образованных поликатионами и siРНК в соотношениях N/P > 1, которые вызывают гибель 50% клеток in vitro. Они составили 6,5 мкг/мл для ПЭИ, 60 мкг/ мл для МГХ и 24,5 мкг/мл для КХ (рис. 1).
Ранее было показано, что доставка siРНК, находящихся в комплексах с поликатионами МГХ, КХ и ПЭИ при N/P больше или равном 2, внутрь клетки начинается уже через 5 мин инкубации [19]. Согласно протоколу использования Lipofectamine® 2000, являющегося «золотым стандартом» внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот, рекомендуемое время экспозиции siРНК составляет не менее 4 ч. При использовании системы доставки на основе микрокапсул показано, что их захват эндосомами происходит в течение первых 15 мин после введения, начало высвобождения siРНК в клетке в процессе разрушения капсул начинается через 4 ч и полностью завершается через 24 ч [12].
Учитывая различающиеся данные о времени доставки siРНК для разных носителей, провели их сравнительное исследование с использованием флюоресцентно-меченой двунитевой РНК PA-1630, содержащей карбоксифлюоресцеин (FAM) на 3'-конце (FAM-PA-1630). В случае исследуемых поликатионов подготовили несколько вариантов комплексов с FAM-PA-1630 с соотношениями N/P 16, 8, 4, 2 и 1, которые находятся в диапазоне концентраций, вызывающих менее 30% гибели клеток в монослое. Помимо поликатионов для доставки FAM-PA-1630 в клетки использовали гибридные микрокапсулы, а также Lipofectamine® 2000. Через 24 ч после внесения препаратов максимально эффективную доставку FAM-PA-1630 наблюдали для микрокапсул. При использовании поликатионов МГХ, КХ и ПЭИ наблюдали прямую зависимость интенсивности флюоресценции в клетках от соотношения N/P (рис. 2).
На следующем этапе работы определяли функ-
Таблица 2 циональную эффективность комплексов исследуемых носителей с siPHK относительно ингиби-рования вирусной инфекции на культивируемых клетках A549. Для этого использовали siPHK, направленные на гены PA и NP ви-русов гриппа А (табл. 2). Применяли как ранее охарактеризованные siPHK NP-1496 [17] и NP-717 [12], для которых была показана противовирусная активность, так и новую siPHK PA-1630, противовирусная активность которой была обнаружена в процессе выполнения работы. В качестве отрицательного контроля использовали siPHK, последовательность которой была случайным образом подобрана так, чтобы не иметь комплементарных участков в генах человека и вирусов гриппа А. В качестве препарата положительного контроля противовирусной активности использовали озельтамивир.
В лунки 24-луночного планшета к монослою клеток А549 вносили в бессывороточную среду препараты siPHK, находящиеся в комплексах с изучаемыми поликатионами (в соотношении N/P 16), микрокапсулами и Lipofectamine® 2000. После инкубации в течение 24 ч отмывали клетки от не вошедших внутрь препаратов siPHK, затем проводили оценку противовирусной активности методом PrA (табл. 3). Установили, что метод PrA не может быть использован для оценки противовирусной активности препаратов, содержащих МГХ и KX. Причиной этого, вероятно, является способность хитозана связываться с гемагглютинином вируса гриппа за счет наличия большого количества активных положительно заряженных NHj-групп. При этом для исследуемых проб наблюдали цитопатическое действие вируса и определяли вирусный белок NP методом ИФА (рис. 3). В случае ПЭИ и Lipofectamine® 2000 методом PrA продемонстрировали снижение вирусной репродукции с помощью siPHK, однако такой же эффект наблюдали и для неспецифической siPHK. При использовании микрокапсул с вирусспецифическими siPHK наблюдалось достоверное снижение вирусной репродукции, в то время как контрольные препараты такого снижения не вызывали.
Помимо метода PrA для определения вирусной нагрузки использовали метод ИФА с моноклональными антителами 6D11 к NP вирусов гриппа А (рис. 4). В этом случае для заражения клеток А549 использовали мень-
Таблица 3
Результаты РГА Вкж, полученных от клеток А549, зараженных А/ PR/8/34 1 MOI, через 72 ч после заражения; внесение препаратов siРНK (0,125 мкМ/лунка)
Показатель Lipofectamine® 2000 ПЭИ Микрокапсулы МГХ KX
Контроль заражения 16
Носитель без siPHK 16 16 16 н/о н/о
Неспецифическая siPHK 8 8 16 н/о н/о
PA-1630 8 4 4 н/о н/о
NP-717 4 8 2 н/о н/о
NP-1496 8 8 8 н/о н/о
Озельтамивир
Примечание.
н/о —
невозможно определить.
2
original research
о x
о S
100 -|
80 -
60 -
40
20 -
i
ä
jr
Js®
Контроль заражения
Носитель без siPHK
РА-1630
Неспецифическая siPHK
Рис. 3. Уровень белка NP в клетках A549, заражённых A/PR/8/34 1 MOI, через 72 ч после заражения. Внесение препаратов siPHK (0,125 мкМ/лунка) с поликатионами N/P 16 по профилактической схеме.
О !С
100 П
80 -
60 -
40 -
20 -
rll
i
I
I
i
✓
s
#
J
*
f
пэи
Рис. 4. Результаты ИФА определения уровня белка NP в клетках A549, заражённых A/PR/8/34 0,1 MOI, через 24 ч после заражения. Внесение препаратов siPHK (0,5 мкМ/лунка) c ПЭИ (N/P 16) и в виде микрокапсул по профилактической схеме.
шую дозу вируса (0,01 MOI). В качестве препарата сравнения вновь использовали озельтамивир (10 мкг/мл). В случае комплексов siPHK с МГХ и КХ наблюдали лишь незначительное снижение уровня NP, сопоставимое с эффектом действия как контрольной неспецифической siPHK, так и самого хитозана. Для ПЭИ достоверное снижение уровня NP произошло только в случае
siPHK NP-717. В остальных пробах снижение относительного уровня NP в клетках было сопоставимо с контрольным. В клетках, в которые siPHK доставляли с помощью микрокапсул, наблюдали достоверное снижение уровня NP методом ИФА для всех трех исследуемых препаратов. Эти данные хорошо согласуются с ранее полученными для препаратов NP-717 и NP-1496 [12, 17].
Обсуждение
В работе изучали противовирусную активность in vitro в отношении вируса гриппа А трех препаратов siPHK (PA-1630, NP-717, NP-1496), доставляемых в клетки различными системами невирусной доставки. Носители сравнивали по трансфекционной способности, токсическому эффекту и противовирусной активности доставляемых в клетки siPHK. Использовали поликатионные носители МГХ, КХ и ПЭИ, а также гибридные микрокапсулы на основе полиаргинина с неорганическими компонентами [11, 12, 19, 20].
Поликатионная доставка лекарственных средств считается наиболее перспективным подходом к терапии инфекционных заболеваний, развивающихся в верхних дыхательных путях [21, 22]. В частности, в литературе уделялось большое внимание хитозану как потенциальному агенту для доставки терапевтических siPHK в клетки легких [23]. Однако сложность в использовании хитоза-на состоит в том, что он является природным полимером, и препараты, получаемые из разного природного сырья (хитиновые панцири креветок и другие), различаются по степени деацетилирования, содержанию аминогрупп и молекулярной массе, в то время как синтезированные в лаборатории производные хитозана обладают различными физико-химическими свойствами. В связи с этим невозможно однозначно допустить, что разные препараты хитозанов характеризуются одинаковой доставляющей способностью, поэтому различные синтезированные модификации требуют сравнительного изучения.
Ш предварительном этапе работы определяли условия комплексообразования и пороги токсичности для двух модифицированных хитозанов МГХ, KX, а также ПЭИ. ^нцен-трации МГХ, KX и ПЭИ в комплексах с siPHK (для соотношений N/P > 1), которые не вызывают явного токсического действия и вызывают гибель не более 30% клеток, составили 7,5, 4,5 и 5 мкг/мл соответственно (см. рис. 1). В предыдущих исследованиях оценивали эффективность трансфекции siPHK внутрь клеток хитозанами МГХ и KK [20], а также микрокапсулами [12]. В представленной работе провели сравнение этих систем доставки, которое показало, что микрокапсулы позволяют осуществлять наиболее эффективную трансфекцию клеток максимально возможным количеством siPHK, не вызывая их гибели. Исследованные поликатионы, а также препарат сравнения Lipofectamine®
£
/
Микрокапсулы
оригинальные исследования
2000 имеют ограничения по количеству доставляемой siPHK, так как с ее увеличением возрастает и количество носителя, что приводит к повышению токсичности препарата и возможному превышению концентрации «полулетальной дозы». Токсичность препарата в микрокапсулах в свою очередь определяется только большим количеством (больше 25) капсул, приходящихся на одну клетку, при этом в одну капсулу может быть заключено гораздо больше siPHK, чем можно доставить в клетку с помощью Lipofectamine® 2000 по стандартному протоколу. Таким образом, если эффективность трансфекции с помощью микрокапсул принять за 100%, доставка с помощью Lipofectamine® 2000 обладает эффективностью на уровне 80%, а доставка поликатионами не превышает 60% в пределах нетоксичных концентраций.
Мы использовали все системы доставки, чтобы изучить ингибирующее действие siPHK на вирус гриппа А (ВГА) на клетках А549 методами РГА и ИФА. Наибольший противовирусный эффект исследуемые siPHK показали в случае доставки с помощью микрокапсул.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности использования микрокапсул для безопасной и эффективной доставки терапевтических siPHK против ВГА in vitro и, возможно, in vivo. Преимуществом такого подхода может также являться возможность упаковки в одну капсулу большого количества сразу нескольких специфичных siPHK, имеющих мишени в разных генах ВГА и/или одновременно для клеточных генов. Также капсулы можно модифицировать, добавляя в них компоненты для оптимизации транспорта и снижения токсичности на уровне организма, без потери их основных свойств и функциональности.
Финансирование. Данная работа выполнена при финансовой поддержке PHФ грант № 15-15-00170; грант № 17-73-10023.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 3—6, 8—18, 20—23
см. references)
1. Всемирная организация здравоохранения. Информационный бюллетень о гриппе № 211. Available at: http://www.who.int/me-diacentre/factsheets/fs211/ru
2. ^селёв О.И., Цыбалова Л.М., Покровский В.И., ред. Грипп: эпидемиология, диагностика, лечение, профилактика. М.: Медицинское информационное агентство; 2012.
7. Горшков А.И, Петрова А.В., Васин А.В. PHK-интерференция и
патогенез вируса гриппа А. Цитология. 2017; 59(8): 517—33. 19. Петрова А.В., Горшков АЛ., Егоров В.В., Бондаренко А.Б., Шу-рыгина А.П.С., Грудинина HA. и др. Оценка трансфекционной способности производных хитозана в качестве носителей для доставки коротких интерферирующих PHK. Естественные и математические науки в современном мире. 2015; (36-37): 142—8.
references
1. World Health Organization. Influenza bulletin № 211. Available at: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/
2. Kiselev O.I., Tsybalova L.M., Pokrovskiy V.I., eds. Influenza: Epidemiology, Diagnosis, Treatment, Prevention [Gripp: epidemiologiya,
diagnostika, lechenie, profilaktika]. Moscow: Meditsinskoe infor-matsionnoe agentstvo; 2012. (in Russian)
3. Kurreck J. RNA interference: from basic research to therapeutic applications. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 2009; 48(8): 1378—98.
4. Castel S.E., Martienssen R.A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat. Rev. Genet. 2013; 14(2): 100—12.
5. Ballarin-Gonzalez B., Thomsen T.B., Howard K.A. Clinical translation of RNAi-based treatments for respiratory diseases. Drug Deliv. Transl. Res. 2013; 3(1): 84—99.
6. Haussecker D. Current issues of RNAi therapeutics delivery and development. J. Control. Release. 2014; 195: 49—54.
7. Gorshkov A.N., Petrova A.V., Vasin A.V. RNA-interference and Influenz A pathogenesis. Tsitologiya. 2017; 59(8): 517—33. (in Russian)
8. Maillard P.V, Ciaudo C., Marchais A., Li Y., Jay F., Ding S.W., et al. Antiviral RNA interference in mammalian cells. Science. 2013; 342(6155): 235—8.
9. Wang J., Lu Z., Wientjes M.G., Au J.L. Delivery of siRNA therapeutics: barriers and carriers. AAPS J. 2010; 12(4): 492—503.
10. Whitehead K.A., Langer R., Anderson D.G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug. Discov. 2009; 8(2):129—38.
11. Faizuloev E., Marova A., Nikonova A., Volkova I., Gorshkova M., Izumrudov V. Water-soluble N-[(2-hydroxy-3-trimethylammonium) propyl]chitosan chloride as a nucleic acids vector for cell transfec-tion. Carbohydr. Polym. 2012; 89(4): 1088—94.
12. Timin A.S., Muslimov A.R., Petrova A.V., Lepik K.V., Okilova M.V., Vasin A.V., et al. Hybrid inorganic-organic capsules for efficient in-tracellular delivery of novel siRNAs against influenza A (H1N1) virus infection. Sci. Rep. 2017; 7(1): 102.
13. Elbashir S.M., Lendeckel W., Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes. Dev. 2001; 15(2): 188—200.
14. Reynolds A., Leake D., Boese Q., Scaringe S., Marshall W.S., Khvo-rova A. Rational siRNA design for RNA interference. Nat. Biotech-nol. 2004; 22(3): 326—30.
15. WHO. Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza. Available at: http://www.who.int/influenza/gisrs_ laboratory/manual_diagnosis_surveillance_influenza/en/
16. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. Am. J. Epidemiol. 1938; 27(3): 493—7.
17. Ge Q., McManus M.T., Nguyen T., Shen C.H., Sharp P.A., Eisen H.N., et al. RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100(5): 2718—23.
18. Ganas C., Weiß A., Nazarenus M., Rösler S., Kissel T., Rivera Gil P., et al. Biodegradable capsules as non-viral vectors for in vitro delivery of PEI/siRNA polyplexes for efficient gene silencing. J. Control. Release. 2014; 196: 132—8.
19. Petrova A.V., Gorshkov A.N., Egorov V.V., Bondarenko A.B., Shury-gina A.P.S., Grudinina N.A., et al. Evaluation of the chitosan derivatives transfection capacity as carriers for the delivery of small interfering RNAs. Estestvennye i matematicheskie nauki v sovremennom mire. 2015; (36-37): 142—8. (in Russian)
20. Pack D.W., Hoffman A.S., Pun S., Stayton P.S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 2005; 4(7): 581—93.
21. Höbel S., Aigner A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. WileyInterdiscip. Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 2013; 5(5): 484—501.
22. Kumar M. A review of chitin and chitosan applications. React. Funct. Polym. 2000; 46(1): 1—27.
23. Ramsey J.M., Hibbitts A., Barlow J., Kelly C., Sivadas N., Cryan S.A. 'Smart' non-viral delivery systems for targeted delivery of RNAi to the lungs. Ther. Deliv. 2013; 4(1): 59—76.
Поступила 17.08.17 Принята в печать 25.08.17
