CC BY
33
БИОХИМИЯ
© коллектив авторов, 2018
УДК 616.36-07:616.152-073.537.9
Сажина Н.Н.1, Попов И.Н.2, Титов в.Н.3
СРАВНЕНИЕ ДВУХ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ МОДЕЛЕЙ ДЛЯ ОЦЕНКИ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ С ПАТОЛОГИЕЙ ПЕЧЕНИ
1ФГБУН Институт биохимической физи ки им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334, Москва; 2НИИ антиокислительной терапии, Берлин, Германия;
3ФГБУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ, 121552, Москва
Проведена сравнительная оценка антиокислительной активности (АОА) сыворотки крови больных с патологией печени двумя хемилюминесцентными методами с разными моделями свободнорадикального окисления: «Hb-H2O2-люминал» и «АБАП-люминол». Выявлена достоверная, но не высокая корреляция результатов (r = 0,798), что связано, главным образом, с различием механизмов инициирования свободных радикалов и влиянием компонент сыворотки крови на процесс инициирования. Сильней это влияние проявляется в модели «Hb-H2O -люминол». Расхождение результатов измерений более выражено у пациентов с аномально высоким содержанием в крови билирубина. В этой связи, более предпочтительной в клинической практике для оценки АОА следует считать модель окисления «АБАП-люминол».
Ключевые слова: антиоксидантная активность, хемилюминесценция, свободнорадикальное окисление, люминол, сыворотка крови.
Для цитирования: СажинаН.Н., Попов И.Н., Титов В.Н. Сравнение двух хемилюминесцентных моделей для оценки антиокислительной активности сыворотки крови больных с патологией печени. Клиническая лабораторная диагностика. 2018; 63(1): 16-21. DOI: http://dx.doi.org/10.1882im69-2084-2018-63-l-16-21
SazhinaN.N.1, Popov I.N.2, Titov V.N.3
THE COMPARISON OF TWO CHEMILUMINESCENT MODELS FOR ASSESSING ANTI-OXIDATIVE ACTIVITY OF BLOOD SERUM OF PATIENTS WITH LIVER PATHOLOGY
1The Federal state budget institution of science "The N.M. Emanuel institute of biochemical physics" of the Russian academy of sciences, 119334 Moscow, Russia
2the research institute of anti-oxidation therapy, Berlin, Germany
3the Federal state budget scientific institution "the Russian cardiologic R&D production complex" of minzdrav of Russia, 121552 Moscow, Russia
The comparative assessment was carried out concerning anti-oxidation activity of blood .serum of patients with liver pathology using two chemiluminescent techniques with different models of free radical oxidation: «Hb-H202-luminol» и «ABAP-luminol». The reliable but low correlation of results was established (r=0,798) related mainly to difference in mechanisms of initiation of free radicals and effect of blood serum on initiation process. This effect is stronger manifested in model «Hb-H202-luminol». The discrepancy of results of measurement is more expressed in patients with anomalous higher content of bilirubin in blood. Thereupon, oxidation model «ABAP-luminol» is to be considered as a more preferable for clinical practice.
Keywords: anti-oxidant activity; chemiluminescence; free radical oxidation; luminol; blood serum.
For citation: Sazhina N.N., Popov I.N., Titov V.N. The comparison of two chemiluminescent models for assessing anti-oxidative activity of blood serum of patients with liver pathology. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2018; 63 (1): 16-21. (inRuss.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821m69-2084-2018-63-1-16-21
For correspondence: Sazhina N.N., candidate of physical mathematical sciences, senior researcher of the Federal state budget institution of science "The N.M. Emanuel institute of biochemical physics". e-mail: Natnik48s@yandex.ru
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests.
Acknowledgment. The study had no sponsor support.
Received 01.02.2017 Accepted 20.02.2017
Введение. Определение антиоксидантной активности (АОА) сыворотки крови человека является важной задачей для медико-биологических исследований, поскольку АОА определяет защитную систему организма для борьбы с окислительным стрессом, как результатом нарушения равновесия между образующимися свободными радикалами и соответствующими защитными механизмами в организме. Сыворотка крови представ-
Для корреспонденции: Сажина Наталья Николаевна, канд. физ.-мат. наук, ст. науч. сотр. ФГБУ Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН: e-mail: Natnik48s@yandex.ru
ляется сложной субстанцией для исследований, АО состав которой обусловлен, прежде всего, наличием в ней аминокислот, мочевой кислоты, витаминов Е, А, С, гормонов, ферментов, а также промежуточных и конечных продуктов метаболизма [1]. При этом суммарная АОА есть некая интегральная величина, характеризующая потенциальную возможность АО действия всех компонент сыворотки крови с учетом их потенциального синергизма. Печень - один из главных органов в антиокислительной системе организма, поэтому изучение АОА сыворотки крови больных с патологией печени является важным аспектом понимания in vivo
Russian clinical laboratory diagnostics. 2018; 63(1)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-1-16-21
biochemistry
окислительных превращений. На протяжении многих лет предпринимаются попытки создания методик для определения суммарной АОА одновременно всех, присутствующих в плазме крови, ингибиторов свободно-радикальных реакций, однако роль каждого из АО может существенно отличаться при различных способах активации окислительных процессов. Поэтому выбор адекватных систем оценки АОА имеет первостепенное значение для правильной интерпретации полученных результатов в рамках клинической лабораторной диагностики. Определение АОА предполагает не только обнаружение одного или нескольких веществ, а выявление их «функциональной» АОА, что может быть воспроизведено в подходящей окислительной системе. Основными компонентами любой тест-системы для определения АОА являются: система генерации радикалов и субстрат или молекула-мишень, которая подвергаясь окислению, меняет свои регистрируемые физико-химические свойства. От выбора этих объектов и зависит информативность полученных результатов. В настоящее время всё большее распространение получают хемилюминесцент-ные (ХЛ) методы определения АОА сыворотки крови и других биологических жидкостей [1]. Они достаточно чувствительны, оперативны и позволяют непосредственно контролировать кинетику окисления. Одним из главных различий ХЛ методов является способ генерации свободных радикалов. Он может осуществляться по разным принципам: химическому (например, в ферментативной реакции ксантиноксидаз, при взаимодействии гемсодержащих производных с перекисью водорода) или физико-химическому (при термоинициированном распаде азо-соединений, облучении фотосенсибилизаторов).
Цель настоящей работы - сравнительный анализ определения суммарной АОА сыворотки крови пациентов с патологией печени, проведенный на двух хемилю-минесцентных приборах с различными моделями сво-боднорадикального окисления.
Материал и методы. Пробы сыворотки крови 26 больных с патологией печени (атрофический цирроз, новообразования и др.) и 8 доноров с необходимыми клиническими показателями крови были предоставлены для исследования Институтом клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова Российского кардиологического научно-производственного комплекса. Измерения суммарной АОА параллельно на двух ХЛ приборах были выполнены в ИБХФ им. Н.М. Эмануэля РАН.
В первой модели свободнорадикального окисления использовалась система «гемоглобин (Hb)— (H202)—люминол», в которой образование радикалов-инициаторов происходит при взаимодействии Hb и H202, а люминол играет роль хемилюминогенного субстрата окисления. Эта модель, хотя и не до конца изучена, представляет интерес своей «физиологичностью», поскольку взаимодействие Hb и Н202 может происходить in vivo. Подробная методика использования этой модели для изучения АОА сыворотки крови и ее отдельных компонентов изложена в [2]. Кинетика и конкретная схема протекающих при взаимодействии Hb и H2o2 реакций очень сложные. Авторами [3] было обнаружено, что в результате реакции оксиНЬ с Н202 происходит быстрое образование метНЬ (Hb-Fe3 +). Взаимодействие метНЬ с избытком Н202 ([гем]:[Н202] = 1:10, моль:моль) сопровождается разрушением гема и освобождением ионов железа, которые реагируют с Н202, образуя реактив-
Hb-Fe3
Hb( •+)-Fe4+=O
H2O2
LO2- -J-* (AP2-)* -> AP2- + hv (425 нм)
N2
Рис. 1. Предполагаемая схема реакций в системе «НЬ— Н202—люминол», приводящих к генерации квантов ХЛ (пояснения в тексте).
ную форму, окисляющую деоксирибозу. Поскольку это окисление ингибируется хелаторами ионов железа и перехватчиками О№-радикала, был сделан вывод, что он и является этой реактивной формой [3, 4]. Однако при взаимодействии оксиНЬ и метНЬ с эквимолярными концентрациями Н2О2 (гем]:[Н2О2] = 1:1) разрушения гема не наблюдается, а происходит образование другой реактивной частицы, которая также окисляет деоксири-бозу, но ее окислительная деградация меньше ингиби-руется перехватчиками ОН но более чувствительна к таким ингибиторам, как 4-(2-гидроксиэтил) пиперазин-1-этансульфоновая кислота. Этой частицей является радикал феррил НЬ (НЬС+)-Бе4+ = О) [5, 6], обладающий высокой реакционной способностью [7, 8]. Добавление в реакционную систему вместо НЬ солей двухвалентного (FeSО4) и трехвалентного железа (БеС13) не дает свечения [2], что указывает на необходимость наличия гемовой структуры у радикалов-инициаторов. В методике [2] для предотвращения разложения Н2О2 металлами переменной валентности, присутствующими в следовых количествах в воде и химических реактивах, в состав буфера добавляли 100 мкМ ЭДТА (этилендиа-минтетраацетат). Обнаруженная при этом способность церулоплазмина и трансферрина уменьшать интенсивность ХЛ системы «НЬ—Н2О2—люминол», обусловлена антирадикальными свойствами этих белков [9], а не их ферроксидазной (церулоплазмин) или хелатирующей (трансферрин) активностью [9]. Наиболее вероятными инициаторами окислительных превращений люминола в рассматриваемой модельной системе являются радикалы феррилНЬ. Однако это не исключает участия в них и ОН\ который может также образоваться при взаимодействии О и Н2О2 с комплексами ЭДТА и железа [10]: ЭДТА-Fe3 + + О2- ^ ЭДТА-Fe2++ О2, ЭДТА-Fe2 + + Н2О2 ^ ЭДТА^е3 + + ОН- + ОН\ На рис. 1 приведена предполагаемая схема реакций, приводящих к образованию радикалов-инициаторов окисления люминола [11]. Взаимодействие Н2О2 с метНЬ, с одной стороны, сопровождается разрушением гема и выходом из него ионов железа, участвующего в образовании ОН\ а, с другой стороны, приводит к возникновению радикалов феррилНЬ (НЬС+)^е4 + = О). Указанные радикалы-инициаторы вызывают одноэлек-тронное окисление люминола, в процессе которого образуется Ь^-радикал, О2"-радикал, эндопероксид люми-
БИОХИМИЯ
R-N=N-R
-> 2R + N2
R'+O2-> ROO'-> (+HO-) ->- ROH + O2
ROOH + L'-, L'- +O
ROO'+ LH-
(эндопероксид люминола)
R.+ LHOO (эндопероксид люминола)
N2 + AP* (аминофталатанион в возбужденном состоянии
AP + hv (хемилюминесценция
Рис. 2. Схема предполагаемых реакций в модели «АБАП-люминол».
нола Ь022- и 3-аминофталат дианион в возбужденном состоянии (АР2)*, при переходе которого в основное состояние высвечивается квант света Ку (425 нм). Преимуществом этой модели, помимо «физиологичности», является доступность и не токсичность используемых реактивов, недостатком - нестабильность Н202 и необходимость контроля ее концентрации.
ХЛ этой модельной системы регистрировали на приборе «Ьит-5773»; www.chemilum.ru по методике [2].
Во второй модели (термо-ХЛ) субстратом окисления тоже служит люминол, а инициирование свободных радикалов происходит при термическом распаде водорастворимого азо-соединения 2.2'-азо-бис (2-амидинопропан) дигидрохлорида (АБАП). Возникшие радикалы детектируются в реакции с люминолом (ЬН"), сопровождающейся ХЛ. На рис. 2 приведена соответствующая схема реакций [12].
Эндопероксид люминола, образующийся в реакциях, существует в двух формах, одна из которых трансформируется в ЬН_ и 02 без излучения (верхняя реакция на рис. 3 [13]), в то время, как другая форма, после промежуточных превращений, теряя азот, переходит в молекулу 3-аминофталат дианиона в возбужденном состоянии (АР2)*, в результате чего испускается квант света (нижняя реакция на рис. 3 [14]). Скорости этих реакций примерно одинаковы, но точный механизм второй реакции не ясен [14]. В работе [12] установлено, что в ней дол-
жен участвовать супероксид О', поскольку суперокси-
NH2O-
OOH
nh2oh
OO-
LH-+ O,
^O
o O- N=NH OH
Рис. 3. Реакции превращения эндопероксида люминола.
дисмутаза (СОД) тушит хемилю-минесценцию.
Количество пероксидных радикалов, образующихся при термическом распаде АБАП равно: N = R. • t = к[АБАП^, где R — скорость генерации радикалов, k — константа скорости, t — продолжительность реакции [15]. В водной среде с pH = 7,4 и температуре 37°С, R, (моль/л)/с = 1,36 • 10-6 • [АБАП]. Для антиоксиданта с концентрацией [АО] время ин-гибирования генерации пероксид-ных радикалов tinh = п[АО]/К, где п — соответствующий стехиоме-трический коэффициент. Преимуществом модели термо-ХЛ (ТХЛ) является постоянство скорости инициирования радикалов при стабильной температуре в течение длительного времени (период полураспада 175 часов). Регистрация ТХЛ осуществлялась на приборе minilum® при температуре (37 ± 0,01)°С (www.minilum.de).
В обеих ХЛ системах основным измеряемым параметром при определении суммарной АОА водорастворимых компонентов плазмы крови (ACW — «integral antiradical capacity of water soluble compounds») являлся латентный период. Он определялся как время от момента инициирования окисления до точки пересечения с временной осью касательной, приложенной к ХЛ кривой в точке её перегиба, соответствующей максимуму первой производной. Калибровка приборов проводилась по аскорбиновой кислоте (АК), и суммарная АОА водорастворимых субстратов (ACW) выражалась в эквивалентном содержании АК в 1л сыворотки крови (^mol/l). Ошибка измерений этого параметра для первого прибора с учетом повторяемости результатов составила не более 15%, для второго не превышала 5%.
Результаты и обсуждение. На рис. 4 приведены кинетические ХЛ кривые, полученные при использовании обеих моделей окисления для проб пациентов: №1 — с самым низким значением АОА (ACW), №2 — со средним, №3 — с самым высоким. Видно, что в первом случае (рис. 4, а) для разных проб характерно не только изменение латентного периода, но и значительное изменение интенсивности свечения, в то время как во второй модели (рис. 4, б) существенно изменяется только
латентный период. Особенно это характерно для больных с повышенным содержанием билирубина (проба №3). Для первой модели окисления особенно сильно выражено влияние белковых состав -ляющих плазмы крови, которые, в основном, и подавляют амплитуду ХЛ [2].
На рис. 5 представлена корреляционная зависимость суммарной АОА (ACW) водорастворимых компонентов сыворотки крови исследованных пациентов, полученная с по-
CO„
hv (425 nm)
CO2H
Russian clinical laboratory diagnostics. 2018; 63(1)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-1-16-21
biochemistry
а б
I, y.e. ИЬ-Н202-люминол |, y.e. АБАП-люминол
Рис. 4. Интенсивность ХЛ-свечения от времени для модели «НЬ—Н2О2—люминол» (а) и модели «АБАП-люминол» (б). Объем сыворотки крови V = 2 мкл (№1), 1,5 мкл (№2, 3) для (а) и V = 2 мкл (№1, 2, 3) для (б). №1 — проба с самым низким значением АСМ', полученная от донора, №2 и №3 — пробы реципиентов со средним и с самым высоким АСЖ
ACW, цто!/! (АВАР)
1000 800 600 400 200 0
о
r=0,7977 о
О
О , о« X о
1 1 <о о 1 ACW, цто!/! (Hb) 1 1 1
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Рис. 5. Корреляция результатов измерений суммарной АОА сыворотки крови всех пациентов (ACW—«integral antiradical capacity of water soluble compounds») для модели окисления с гемоглобином (ACW, pmol/l (Hb)) и с АБАП (ACW, pmol/l (ABAP)).
мощью обоих методов. Результаты демонстрируют большой разброс значений АС^ от 300 до 2400 цто1/1 для первой модели, и от 15 до 940 цто1/1 для второй. Аномально высокие значения АСW наблюдались у больных с повышенным содержанием в сыворотке общего билирубина (до 600 цто1/1 и выше, при норме 1,7—20,5 цто1/1). Корреляционный коэффициент для использованных моделей составил г = 0,7977. Относительно низкая корреляция связана, главным образом, с различием механизмов инициирования свободных радикалов и возможностью влияния некоторых компонентов сыворотки крови (особенно белковых) на скорость инициирования, что может значительно изменить наблюдаемый латентный период. Особенно это касается первой модели, в которой одним из радикалов-инициаторов является очень активный ОН^-радикал, реагирующий со многими составляющими сыворотки
3000 2500 2000 1500 1000 500 0
ACW, цто!/! (Hb)
1000
800
600
400
200
ACW, цто!/! (АВАР)
Т-1-1-1-1-Г
0 100 200 300 400 500 600
700
-1-1-1-1-1-1
100 200 300 400 500 600 700
б
а
0
0
Рис. 6. Зависимости суммарной АОА (АСW) сыворотки крови доноров и больных с патологией печени от содержания мочевой кислоты для модели окисления с НЬ (а) и с АВАР (б). АСW в ^то1/1 АК.
БИОХИМИЯ
40
35
30
25
I
s 2 20
>
\o .0 15
10
0 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 29 29 31
Рис. 7. Содержание альбумина в исследованных пробах сыворотки крови (биохимический анализ).
крови, в особенности с протеинами, которые «отвлекают» его от реакции с люминолом.
Подобные аргументы можно привести и для объяснения различий для двух моделей зависимостей ACW от содержания в сыворотке крови мочевой кислоты (биохимический анализ) (рис. 6). Эквивалентное количество АК, определяемое латентным периодом при одном и том же количестве мочевой кислоты, в 3—4 раза больше в первой модели, чем во второй. Взаимодействуя с различными радикальными интермедиатами, мочевая кислота влияет в первой модели не только на латентный период, но в значительной степени и на интенсивность ХЛ. Корреляция ACW с содержанием мочевой кислоты значительно хуже для первой модели (r = 0,5831), чем для второй (r = 0,7447). Значения подобных корреляционных коэффициентов, определенные с мочевой кислотой на модели с АБАП в других работах [16, 17], достаточно близки к коэффициентам, полученным в настоящих экспериментах. В [12, 18] на основании измерений плазмы крови 45 доноров показано, что AOA мочевой кислоты составляет 64% от общей ACW, а белков — 5% (www.minilum.de).
Было показано, что в системах фотосенсибилизиро-ванной и термоинициированной ХЛ нативные аминокислоты и альбумин не обладают антирадикальной активностью, но приобретают её в процессе окислительной модификации [18]. В системе «НЬ-Н202-люминол» на их долю приходится около 50% ACW [2, 11]. Поэтому результаты измерений подвержены влиянию содержания альбумина в сыворотке, которое у печёночных больных занижено из-за нарушения синтезирующей способности печени (рис. 7). Среднее значение альбумина составило 25,21 ± 5,33 г/л (min = 14,4 г/л, max = 37,1 г/л) при норме 34—48 г/л. Как видно из диаграммы, разница значений альбумина у разных пациентов достигает 100% и выше, что является существенной помехой при определении параметра ACW и ставит под сомнение его информативность. Единственной возможностью использовать метод «НЬ-Н202-люминол» в клинических целях, по-видимому, является депротеинизация сыворотки крови. Однако при этом теряется возможность полной количественной оценки степени окислительного стресса, как это показано в системе ТХЛ путём сравнения антиокислительной защиты со степенью окислительного повреждения белков сыворотки крови [12].
Выводы. Таким образом, сравнительный анализ суммарной АОА водорастворимых компонентов сыворотки крови больных с патологией печени (ACW), проведенный на разных моделях свободнорадикального окисления, показал значительное расхождение результатов из-
мерений и относительно низкую корреляцию (r = 0,798). Это связано, главным образом, с различием механизмов инициирования свободных радикалов и возможностью влияния некоторых компонентов сыворотки крови (особенно белковых) на процесс и скорость инициирования. Сильней это влияние проявляется в модели с «НЬ-Н202-люминол», где одним из радикалов-инициаторов является активный Off радикал, который реагирует со многими составляющими сыворотки крови. Расхождение в результатах измерений заметнее для больных с аномально высоким содержанием некоторых компонентов сыворотки крови, которые по-разному ингибируют окисление люминола из-за побочных реакций. В этой связи, более предпочтительной для клинического применения с целью оценки АОА, как способности противостоять активным радикалам, следует считать модель окисления люминола с АБАП-инициатором.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1, 3, 5—10, 12, 14—18 см. REFERENCES)
2. Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Любицкий О.Б., Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А.: Ингибирование сывороточными антиок-сидантами окисления люминола в присутствии гемоглобина и пероксида водорода. Вопросы медицинской химии. 1997; 43(2): 87—93.
4. Якутова Э.Ш., Осипов А.Н., Костенко О.В. и др. Взаимодействие гипохлорита с оксигемоглобином приводит к освобождению железа в каталитически активной форме. Биофизика. 1992; 37(6): 1021—8.
11. Теселкин Ю.О. Антиоксидантная активность сыворотки крови как критерий оценки функционального состояния антиок-сидантной системы организма и эффективности применения экзогенных антиоксидантов. Дисс. д-ра биол. наук. М.; 2003. 13. Русин Б.А. Хемилюминесценция фталгидразидов. Биохемилюми-несценция. Труды московского общества испытателей природы. М.: Наука; 1983.
REFERENCES
1. Bartosz G. Total antioxidant capacity. Adv. Clin. Chem. 2003; 37: 219—92.
2. Teselkin Yu.O., Babenkova I.V., Lyubitsky O.B., Klebanov G.I, Vladimirov Yu.A. Inhibition by serum antioxidants oxidation of luminol in the presence of hydrogen peroxide and hemoglobin. Voprosy meditsinskoy khimii. 1997; 43(2): 87—93. (in Russian)
3. Puppo A, ^l^eU B. Formation of hydroxyl radicals from hydrogen peroxide in the presence of iron. Is haemoglobin a biological Fenton reagent? Biochem. J. 1988; 249(1): 185—90.
4. Yakutova E.Sh., OsipovA.N., Kostenko O.V. Interaction ofhypochlorite with oxyhemoglobin leads to release of iron in catalystically active form. Biofizika. 1992; 37(6): 1021—8. (in Russian)
5. Giulivi C., Davies K.J. A novel antioxidant role for hemoglobin. The comproportionation of ferrylhemoglobin with oxyhemoglobin. J. Biol. Chem. 1990; 265(32): 19453—60.
6. Lissi E.A., Escobar J., Pascual C. Visible chemiluminescence associated with the reaction between methemoglobin or oxyhemoglobin with hydrogen peroxide. Photochem. Photobiol. 1994; 60(5): 405—11.
7. Everse J., №ia N. The toxicities of native and modified hemoglobins. Free Radic. Biol. Med. 1997; 22(6): 1075—99.
8. Yamana T., Volkmer, Grishan M.B. The effects of sulfasalazine metabolites on hemoglobin-catalyzed lipid peroxidation. Free Radic. Biol. Med. 1991; 10(1): 41—9.
9. Wayner D.D.M., Burton G.W., Ingold K.U., Locke S.J. FEBS Lett. 1985; 187(1): 33.
10. ^l^eH B., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine. Oxford: Clarendon Press. 1985; 1—332.
5
Russian clinical laboratory diagnostics. 2018; 63(1)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-1-21-27
hematology
11. Teselkin Yu.O. The antioxidant activity of blood .serum as a criterion for evaluating the functional state of the antioxidant system and the efficacy of exogenous antioxidants. [Antioksidanthaya aktivnost ' syvorotki krovi kak kriteriy otsenki funktsional'nogo sostoyaniya antioksidantnoy sistemy organizma i effektivnost'primeneniya ekzo-gennykh antiorsidantov]. Diss. Moscow; 2003. (in Russian)
12. Popov I., Lewin G., eds. Antioxidative homeostasis, its evaluation by means of chemiluminescent methods. In: Handbook of chemiluminescent methods in oxidative stress assessment. Transworld Research Network. Kerala, 2008, 361—91.
13. Rusin B.A. Chemiluminescence ftalgidrazidov. Biohemilyumi-cence. Proceedings of the Moscow Society of Naturalists. [Hemiluminest-sentsiya ftalgidrazidov. Biohemiluminestsentsiya. Trudy moskovskogo obschestva ishytateley prirody]. Moscow: Nauka; 1983. (in Russian)
14. Merenyi G., Lind J., Eriksen Т.Е. Nucleophilic addition to diazaqui-nones. Formation and breakdown of tetrahedral intermediates in relation to luminol chemiluminescence. J. Amer. Chem. Soc. 1986; 108: 1716—26.
15. Niki E. Free Radical Initiators as Source of Water- or Lipid-Soluble PeroxylRadicals. Methods in enzimilogy. L. Packer & A.N. Glazer., eds. New-York: Academic Press; 1990.
16. Uotila J.T., Kirkkola A.L., Rorarius M. et al. The total peroxyl radical-trapping ability of plasma and cerebrospinal fluid in normal and preeclamptic parturients. Free Radic. Biol. Med. 1994; 16(5): 581—90.
17. Lissi E.A., Salim-Hanna M., Pascual С., Castillo M.D. Evaluation of total antioxidant potencial (TRAP) and total antioxidant reactivity from luminol-enchaned chemiluminescence measurement. Free Radic. Biol. Med. 1995; 18(2): 153—8.
18. Popov I., Lewin G. Photochemiluminescent detection of antiradical activity. VI. Antioxidant characteristics of human blood plasma, low density lipoprotein, serum albumin and aminoacids during in vitro oxidation. Luminescence. 1999; 14: 169—74.
Поступила 01.02.17 Принята к печати 20.02.17
ГЕМАТОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2018 УДК 616-092:612.112.3]-074
Потапенко в.Г.1, Первакова М.Ю.2, Лапин С.в.2, Титов А.К.3, Суркова Е.А.2, Петрова Н.Н.1, Черноокая Н.Ю.1, Миронова О.П.1, Потихонова Н.А.4, Узденова Е.И.1, Афанасьев Б.в.2
РОЛЬ ФРАКЦИОННОГО АНАЛИЗА ФЕРРИТИНА В ДИАГНОСТИКЕ ВТОРИЧНОГО ГЕМОФАГОЦИТАРНОГО СИНДРОМА
1СПб ГБУЗ «Городская клиническая больница № 31», 197110, Санкт-Петербург;
2ФГБОУ во «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава РФ, 197022, Санкт-Петербург;
3ФГБУ «Северо-Западный федеральный медицинский исследовательский центр им. в.А. Алмазова» Минздрава РФ, Санкт-Петербург;
4ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» ФМБА РФ, 191024, Санкт-Петербург
Вторичный гемофагоцитарный синдром (ВГФС) представляет собой жизнеугрожающее состояние, характеризующееся неспецифическими проявлениями: системной воспалительной реакцией, цитопениями, поражением печени и высоким содержанием ферритина в сыворотке крови. Одним из проявлений ВГФС является снижение уровня гликозилированного ферритина (ГФ) в сыворотке крови, выраженного в процентах от общего уровня. Определение ГФ может быть использовано для дифференциального диагноза с другими схожими по клинической картине критическими состояниями, прежде всего, с септическим процессом. Целью данного исследования было определение клинической ценности измерения ГФ для диагностики и дифференциальной диагностики ВГФС. Проанализированы образцы сыворотки крови и клинические данные пациентов с диагнозами ВГФС (n = 40), тяжелого сепсиса (n = 24), цитолитического синдрома (n = 36) и здоровых доноров (n = 40). Определено общее содержание ферритина турбидиметрическим методом («BioSystems», Испания) и рассчитан ГФ. Для определения уровня ГФ гликозилированную фракцию ферритина осаждали с помощью конканавалина А, полимери-зованного с сефарозой 4B («GEHealthcare», США). Нормальные значения ГФ составили 78,3—87,1%. При ВГФС снижение содержания ГФ составило 25,0 ± 18,4% и было значительно ниже, чем при сепсисе — 47,0 ± 17,7%% (p < 0,001) и цитоли-тическом синдроме — 63,5 ± 18,7% (p < 0,001). По результатам ROC-анализа площадь под кривой ГФ была наибольшей по сравнению с другими маркерами ВГФС, в частности, общим ферритином, триглицеридами, фибриногеном. При уменьшении уровня ГФ ниже 30,4% используемый нами метод обеспечивает клиническую чувствительность 69%, специфичность 94,3%% и точность 86,9% в проведении дифференциального диагноза ВГФС. При расчете абсолютного содержания неглико-зилированного ферритина было обнаружено, что его значения коррелируют с концентрацией триглицеридов, международным нормализованным отношением, аспартатаминотрансферазой, аланинаминотрансферазой и общим билирубином у больных ВГФС (p < 0,05). Таким образом, снижение уровня ГФ позволяет с высокой точностью диагностировать ВГФС.
Ключевые слова: гемофагоцитарный синдром; сепсис; ферритин; гиперферритинемия; гликозилированный фер-ритин.
Для корреспонденции: Первакова Маргарита Юрьевна, врач КЛД клинико-диагностической лаборатории НМЦ молекулярной медицины ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава РФ; e-mail: margaritalerner@gmail.com
