CC BY
43
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ
РЕАКЦИЙ В ПОЧВАХ
Г.Н. ФЕДОТОВ, доц. МГУЛа, канд. хим. наук,
А.Д. НЕКЛЮДОВ, зав. каф. химии и биотехнологии лесного комплекса МГУЛа, проф., д-р хим. наук,
Е.И. ПАХОМОВ, студент МГУЛа
Исследования различных авторов показали, что слабые электрические токи при непрерывном воздействии на почвы стимулируют развитие и активность почвенных микроорганизмов [1-3]. Электризация почвы и компостов способствует увеличению биомассы микробов, вносит изменение в их видовой состав, повышает аммонифицирующую, нитрифицирующую и азотофиксирующую активность почвы, усиливает образование подвижной фосфорной кислоты, активирует минерализационные процессы и продуцирование углекислоты почвой. Все это положительно сказывалось на растениях, произрастающих на электризуемой почве: повышалась всхожесть и энергия прорастания семян, ускорялся рост и развитие растений, увеличивался урожай сельскохозяйственных культур.
Можно предположить, что воздействие токов на почвы увеличивает скорость ферментативных реакций, что, возможно, и является триггером процесса увеличения биологической активности почвы. Увеличивается количество питательных веществ, за этим следует возрастание численности микроорганизмов, которые, выделяя ферменты в почву, увеличивают там их концентрацию.
В почве представлены почти все известные классы ферментов, наиболее изученные из них оксидоредуктазы и гидрола-зы, имеют, как известно, важное значение в почвенной биодинамике [4].
Существующие методики определения ферментативной активности почв, например, уреазной и каталазной активности, позволяют оценивать только концентрацию ферментов в почве. В первую очередь это связано с тем, что определения проводят в неких модельных, оптимальных для дейст-
вия ферментов условиях, например, в суспензии при избытке субстрата [5]. Подобные условия не соответствуют условиям прохождения данных реакций в почвах. Поэтому, получая информацию о ферментативной активности почв, мы ничего не можем сказать об изменении скорости ферментативных реакций под влиянием различных воздействий на почву, в частности, при пропускании через нее электрического тока.
Целью исследования была разработка методов определения скорости ферментативного разложения пероксида водорода ка-талазой в почвах и ферментативного гидролиза мочевины уреазой в почвах.
В качестве объектов исследования были выбраны тепличный субстрат, торфяная почва из поймы реки Яхрома и кубанский выщелоченный чернозем. Свойства почв определяли по стандартным методикам
[6]. Результаты представлены в таблице.
Основной сложностью при разработке методик было соблюдение условия равномерного распределения субстрата в почве. Различные попытки непосредственного введения субстратосодержащих растворов в почву положительного результата не дали. Как показал теоретический анализ и пробные эксперименты, решение лежало в области изменения фазового состояния объекта
[7] - превращения жидкостей в мелкодисперсный порошок загущением аэросилом
[8], который представляет собой частицы двуокиси кремния размером 10-40 нм, полученные газофазным синтезом. Такой порошкообразный содержащий субстрат материал обладал замедленной смачиваемостью за счет эффекта гистерезиса смачивания [9], что позволяло распределить его равномерно по всему объему почвы.
Таблица
Свойства используемых в работе почв
Тип почвы Свойства почв —— Тепличный субстрат Торфяная почва Чернозем
Влажность, % 79.7 140 23.5
Плотность, г/мл 0,76 0.65 0.99
Общая уд. поверхность по Кутилеку, м2/г 97.6 346 100
Плотность твердой фазы, г/мл 1.96 1.46 2.10
Пористость, % 78 81 62
PH водной вытяжки 6.9 6.6 7,0
PH солевой вытяжки 6.5 6.5 6.8
Содержание нитратов, мг/кг 116 371 201
Содержание фосфора на Р2 05, мг/100г 25,1 17,4 12.2
Содержание аммония, мг/кг 41 41 35
Содержание органики, потери при прокаливании. % 28,3 54.6 8,2
Содержание калия, мг/100г 164 75 84
Содержание натрия. мг/100г 74 143 32
Содержание кальция, мг/100г 1200 1750 825
Содержание магния, мг/100г 31 316 10
Сумма обменных оснований. мг-экв/100г 82,3 103,6 41,8
Гидролитическая кислотность, мг-экв/100г 1,8 2,2 < 1
Емкость катионного обмена, мг-экв/100г 84,1 105.8 42.0
Насыщенность основаниями, % 98,0 98.0 99,5
Содержание солей, мг-экв/100г 0,9 3.5 2,5
35 % 45 %
Рис.1. Микрофотографии порошкообразных смесей аэросил - пероксид водорода при различном содержании аэросила.
Для изучения скорости ферментативного разложения пероксида водорода ката-лазой в почвах аэросильную смесь готовили следующим образом: брали навески раствора пероксида водорода и аэросила, перемешивали их и тщательно перетирали в ступке. Оптимальными оказались смеси, содержащие 40 % аэросила, так как именно это соотношение позволяет получить наименьший размер частиц смеси, что можно видеть на фотографиях, полученных при помощи оптического микроскопа (рис.1.).
При определении активности катала-зы в почвах навеску аэросильной смеси вносили в стеклянную емкость, присоединяли емкость к системе и тщательно перемешивали, фиксируя выделение кислорода манометрическим методом. Ошибка измерений составляла 2-3 %.
Рис.2. Скорость разложения пероксида водорода каталазой в тепличном грунте при различной концентрации субстрата.
Как видно из представленных данных, мы получаем характерные зависимости изменения концентрации продукта от времени (рис.2.). При линеаризации полученных данных в обратных координатах по методу Лайнуивера-Берка [10] с целью определения констант Мехаэлиса-Ментен и максимальной скорости реакции удалось увидеть следующую закономерность (рис.З.).
Рис.З. Скорость разложения пероксида водорода в тепличном грунте в координатах Лайнуивера-Берка (V- мл кислорода на 1 г почвы в мин., 8 - мг пероксида водорода на 1 г почвы).
Рис 4. Скорость разложения пероксида водорода в торфяной почве в координатах Лайнуивера-Берка (У-мл кислорода на 1 г почвы в мин., Б-мг пероксида водорода на 1 г почвы).
На графике наблюдается характерный излом, который свидетельствует, что реакция протекает в диффузионной области, и лишь при высоких концентрациях субстрата наблюдается тенденция к переходу в кине-
тическую область. Полученные данные не являются неожиданными, поскольку ферменты в почвах находятся, как известно [4], в иммобилизованном состоянии, а для иммобилизованных ферментов характерно прохождение реакций в диффузионном режиме [11].
Рис.5. Скорость разложения пероксида
водорода в черноземе в координатах Лайнуивера-Берка (У-мл кислорода на 1 г почвы мин., Б-мг пероксида водорода на 1 г почвы).
Рис. 6. Скорость разложения мочевины уреазой в тепличном грунте при различных концентрациях субстрата.
Для подтверждения того, что диффузия лимитирует скорость ферментативного разложения пероксида водорода каталазой не только в тепличном грунте, были проведены эксперименты на торфяной почве и на черноземе (рис. 4. и рис. 5.). Как видно из графиков, в этих почвах ферментативная реакция также лимитируется диффузией.
В реальных условиях ферментативная реакция разложения пероксида водорода в почвах протекает при концентрациях заведомо более низких, чем мы использовали в своих экспериментах, и следовательно протекает в диффузионном режиме. Поэтому определение констант Михаэлиса-Ментен и максимальной скорости реакции классическими методами для каталазы при сравнении почв теряет смысл.
Для подтверждения общности лимитирующих факторов для ферментативных реакций в почвах мы определили скорость ферментативного гидролиза мочевины уреазой в почвах. Для чего разработали методику, основанную на тех же принципах, что и описанная выше. Однако использовать растворы мочевины не представилось возможным, так как из-за взаимодействия мочевины с аэросилом наблюдается заметное замедление скорости выхода мочевины из аэросиль-ной гранулы. Поэтому мы использовали расплав мочевины.
Аэросильную смесь на основе мочевины готовили следующим образом. Аэросил вносили в расплав мочевины при температуре 133-134 °С в количестве, соответствующем 25 % от аэросильной смеси, и тщательно перемешивали. На втором этапе полученную смесь охлаждали, добавляли аэросил до необходимого содержания и тщательно перетирали. Оптимальными также являлись аэросильные смеси, содержащие 40 % аэросила. После приготовления навеску аэросильной смеси помещали в емкость, в которой уже находился тепличный грунт и перемешивали с ним. Отбор проб из смеси проводили через 1, 2, 3, 4, 5 и 6 часов и определяли в них содержание аммония по стандартной для почв методике с реактивом Несслера [12] (рис. 6.).
Наличие индукционного периода, по нашему мнению, связано с условиями проведения экспериментов, а именно, с выходом мочевины из аэросильной гранулы. Для построения графика в координатах Лайнуи-вера-Берка мы брали максимальную эффективную скорость реакции по завершении индукционного периода, (рис. 7.).
Рис. 7. Скорость разложения мочевины в тепличном грунте в координатах Лайнуивера-Берка (С- концентрация мг аммония в 1 г почвы).
Из представленного графика видно, что реакция протекает в кинетическом режиме только при высоких концентрациях, а при низких концентрациях проходит в диффузионном режиме. Отметим, что самые низкие концентрации из используемых нами на 2 порядка превышают реальные концентрации мочевины, которые реализуются при проведении подкормок в тепличных хозяйствах. Следовательно данная ферментативная реакция в реальных условиях также может лимитироваться только диффузией
Полученные данные позволяют сделать следующие выводы.
1. Предложенный метод позволяет определять скорость ферментативных реакций разложения пероксида водорода катала-зой и гидролиза мочевины уреазой в реаль-
ных почвенных условиях, что до настоящего времени было возможно только для ферментов целлюлазы и протеазы.
2. Ферментативные реакции в почвах проходят в диффузионном режиме, поэтому определение кинетических констант и выводы, которые делаются о биологической активности почв на основе отличия этих констант в различных почвах, не вполне правомерны.
3. Предложенный метод позволяет изучать влияние различных внешних факторов, в том числе и электрических токов, на скорость ферментативных реакций в почвах.
Литература
1. Кравцов П.В., Кравцова Л.В. Действие и последействие постоянного электрического тока на развитие и активность азотофиксирующих микроорганизмов // Электронная обработка материалов. - 1975. - № 5. - С. 70-75.
2. Толчельников Ю.С., Ковш Н.В., Терешенкова И.А. Действие слабого электрического тока на агрохимические свойства торфокомпостов и их эффективность при внесении в дерново-подзолистые почвы // Агрохимия. - 1979. - № 10. -С. 101-106.
3. Шустов В.А. Электрический обогрев и воздействие электрических токов на растения в защищенном грунте: Автореф. дисс. ... к.т.н. - М.: Ленинградский с-х. ин-т, 1961. - 26 с.
4. Хазиев Ф.Х. Системно-экологический анализ ферментативной активности почв. - М.: Наука, 1982.-203 с.
5. Хазиев Ф.Х. Ферментативная активность почв. -М.: Наука, 1976.-180 с.
6. Гасанов А.М. Практикум по почвоведению. - М.: МГУ природообустройства, 2000. - 203 с.
7. Альтшуллер Г.С. Алгоритм изобретения. - М.: Московский рабочий, 1973. - 296 с.
8. Федотов Г.Н. и др. Авторское свидетельство СССР. №325634. 1991.
9. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии. -Л.: Химия, 1984. - 368 с.
10. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. - М.: Изд. МГУ, 1976.-350 с.
11. Звягинцев Д.Г. Иммобилизованные ферменты в почвах. В кн. Микробные метаболиты. - М.: МГУ, 1979.-С. 31-46.
12. Радов А.С., Пустовой И.В., Корольков А.В. Практикум по агрохимии. - М.: Колос, 1965. - 376 с.
