CC BY
58
Рациональное природопользование
УДК 502.55:622.276
ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННОГО ПОЧВОГРУНТА ПОСЛЕ ПРИМЕНЕНИЯ БИОАКТИВНОГО СОРБЕНТА
Фомина Наталья Валентиновна
к.б.н., доцент кафедры Ландшафтной архитектуры, ботаники, агроэкологии
ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ Россия, г. Красноярск [email protected]
Аннотация. В статье представлены результаты исследования эффективности действия биологически активного сорбента «Унисорб-био», участвующего в очищении почвогрунта от нефтяного загрязнения по показателям ферментативной активности. В лабораторных условиях изучено влияние нефти на уровень активности окислительных и гидролитических ферментов до и после применения сорбента. Определена безопасная концентрация нефти, при которой не происходит нарушения состояния ферментной системы.
Ключевые слова. Нефть, загрязнение, сорбент, активность, ферменты, почвогрунт.
ENZYMATIC ACTIVITY OF PETROPOLLUTED SOIL AFTER APPLICATION OF THE BIOFISSILE SORBENT
Fomina Natalia V.
PhD, assistant professor of landscape architecture, botany, agroecology FGBOU IN Krasnoyarsk GAU Russia, Krasnoyarsk [email protected]
Abstract: Results of a research of effectiveness of action of the biologically fissile sorbent of "Unisorb-bio" participating in clarification of soil from oil pollution on indexes of enzymatic activity are presented in article. Influence of naphtha on the level of activity oxidizing and hydrolases before application of a sorbent is in vitro studied. Safe concentration of naphtha at which there is no violation of a condition of ferment system is defined.
Keywords. Mineral oil, pollution, sorbent, activity, enzymes, soil.
Основные принципы восстановления загрязненных экосистем основаны на максимальной мобилизации внутренних ресурсов загрязненной экосистемы, или в
36
использовании современных средств очистки, в частности сорбентов. На современном уровне развития нефтяной промышленности не представляется возможным полностью исключить ее негативное воздействие на окружающую среду, возникает необходимость разработки методов и технологий восстановления почв, загрязненных нефтяными углеводородами [3, 4, 10]. Экологически перспективными являются микробиологические способы очистки от нефтезагрязнений, основанные на стимулировании роста и активности природных микроорганизмов (биостимуляция) или внесении в почву селекционированных микроорганизмов-деструкторов (биоаугментация) [6, 7]. Действие нефтяных компонентов особенно сказывается в изменении экологической обстановки: пропитывая почву, обволакивая корни, листья, стебли растений и проникая сквозь мембраны клеток, нефть нарушает водно-воздушный баланс среды и организмов, обмен веществ и трофические связи. Существующие механические, физические и химические методы очистки не обеспечивают необходимого уровня очистки воды и грунта, поэтому большое внимание уделяется биологическим методам очистки [ 1, 2].
В связи с тем, что деструкция нефти в окружающей среде - сложный многофакторный процесс, на который оказывают влияние физико-химический состав, концентрация и срок действия загрязнителя, почвенно-климатические и биологические особенности экосистемы и другие факторы, сведения по этой проблеме нередко противоречивы.
Применение аборигенных видов микроорганизмов-нефтедеструкторов усиливает эффективность использования указанных видов сорбентов. Внесение сорбентов используется для увеличения поглощения порога нефтяного загрязнения, при котором могут применяться растения в биоремедиации [10].
При разработке приемов микробной ремедиации нефтезагрязненных почв, выборе оптимального способа очистки необходим комплексный подход. Анализ изменений, происходящих в микробных сообществах нефтезагрязненных почв, путем определения численности микроорганизмов различных физиологических групп, выделения и идентификации микроорганизмов-деструкторов углеводородов, изучения почвенной биодинамики на основании оценки активности ферментов в почве и определения интенсивности почвенного «дыхания», исследования динамики агрохимических показателей почвы с параллельным химическим анализом остаточного содержания в ней нефтяного загрязнителя и оценкой степени ее токсичности, позволит разработать параметры микробиологических процессов в нефтезагрязненных почвах, при которых нарушенные почвы возвращаются в устойчивое состояние.
Использование сорбентов является одним из наиболее экономически и экологически целесообразных методов рекультивации нефтезагрязненных почв [3, 4].
Для изучения экологической безопасности сорбентов и для оценки их эффективности необходимы критерии или показатели, которые позволили бы определять функциональное состояние почвы и ее токсичность. В качестве такого комплексного критерия может быть использован уровень биологической активности почвы.
Биологические свойства почвы реагируют на нефтяное загрязнение первыми: изменяется общая численность микроорганизмов, их качественный состав, структура микробоценозов, интенсивность микробиологических процессов и активность почвенных ферментов, продуктивность почв и т.д., нарушаются экологические и сельскохозяйственные функции почв. Ферментативная активность почв - один из показателей потенциальной биологической активности почв, при участии экзо- и эндоферментов почвенных микроорганизмов, фауны и растений в почве осуществляются важнейшие биохимические процессы. Активность почвенных ферментов аналитически определяется с высокой точностью и является устойчивым и адекватным биологическим показателем состояния почвы. Исследование изменений активности почвенных ферментов
в результате техногенного загрязнения почвы может внести вклад в разработку мероприятий по их восстановлению [16, 18, 20].
Исследование трансформации нефти, проникающей в почву в результате разливов или утечек в местах хранения или транспортировки, необходимо для понимания механизмов самоочищения и восстановления почв, нарушенных техногенезом. Знание стадий трансформации нефти позволит определить давность загрязнения и сроки восстановления почв, повысить эффективность контроля за загрязнением среды нефтью и нефтепродуктами [15]. Ликвидация аварийных разливов нефти путем сорбционной очистки почвы или воды на сегодняшний день является одним из самых эффективных методов.
Цель исследования - оценка ферментативной активности нефтезагрязненного почвогрунта после применения сорбента «Унисорб-био».
Объектом исследования являлся нефтезагрязненный почвогрунт до и после внесения сорбента «Унисорб-био». Для решения поставленных задач был заложен ряд модельных опытов. В процессе работы изучали действие разных концентраций нефти - 1; 2,5; 5 и 10 % от массы почвы. ПДК нефти в почве не разработаны, поэтому для выражения концентрации нефти в почве использовали ее процентное содержание. Загрязнение почвы нефтью в исследованном диапазоне до 10 % от массы почвы наиболее часто встречается в районах нефтедобычи, транспортировки и переработки нефти [15]. Исследовали равномерное загрязнение нефтью всего объема почв. Для этого после внесения загрязняющего вещества почву в сосуде перемешивали. Почвогрунт компостировали при комнатной температуре (20-22°С) и оптимальном увлажнении (60% от полевой влагоемкости) в трехкратной повторности в течение 1 недели, 1 месяца, и 2 месяцев. При оценке химического воздействия на почву этот срок является наиболее информативным
[5].
Через указанный срок всю массу почвы извлекали из вегетационного сосуда и перемешивали, тем самым получали «средний образец», из которого отбирали пробы на определение биологических показателей.
В ходе анализа использовался грунт «Универсальный». Торфяной питательный грунт из верхового торфа с добавлением песка, известковых материалов, макро и микроэлементов. Все образцы установлены в лаборатории при естественном освещении в вегетационных сосудах массой 1 кг и влажностью грунта 60 %. При искусственном загрязнении использовали нефть, отобранную из магистрального нефтепровода ОАО «Трансибнефть». Нефть сырая Сургутского месторождения, имеющая плотность d420 0,871-0,873, кг/см3; содержание солей, мг/л - 15,2; содержание воды, мг/л - 0,09; содержание серы, мас. % - 1,5 [10].
Побор концентрации нефти проводили в соответствие с градацией степени загрязнения от легкой до очень высокой. Данное исследование проводилось в связи с необходимостью определения той границы, где техногенное воздействие еще не нарушает состояние ферментной системы, стимулирует или угнетает активность ферментов.
Схема опыта:
1. Контроль (грунт без обработки).
2. Грунт+сорбент «Унисорб-био»;
3. 1% загрязнение нефтью;
4. 1% загрязнение нефтью+сорбент «Унисорб-био»;
5. 2,5 % загрязнение нефтью;
6. 2,5 % загрязнение нефтью+сорбент «Унисорб-био»;
7. 5% загрязнение нефтью;
8. 5% загрязнение нефтью+сорбент «Унисорб-био»;
9. 10% загрязнение нефтью;
10. 10% загрязнение нефтью +сорбент «Унисорб-био».
Сорбент серии «Унисорб-био» представляет собой мезопористый полимерный материал с открытой ячеистой высокоразвитой структурой и удельной поверхностью и относится к классу сорбентов искусственного происхождения и получен путем иммобилизации ассоциированных нефтеокисляющих микроорганизмов и адаптированных биокультур на полимерный носитель пороаминопласт.
«Унисорб-Био» легко внедряется в толщу нефтяного слоя, существенно снижает продолжительность детоксикации нефти, предотвращает вымывание микроорганизмов из мест обработки, поддерживает водный баланс и улучшает структуру почв. Количество вносимого сорбента рассчитывали в зависимости от уровня загрязнения. Все показатели изучали в динамике через 1 неделю, 1 месяц и 2 месяца инкубации грунта.
Лабораторно-аналитические исследования выполнены с использованием общепринятых в почвоведении и биологии методов [11]. Определение каталазы проводили по методу Джонсона и Темпле (1964) титрованием 0,1 н раствором КМп04, активность выражали в мл 0,1н КМп04 / г сух.почвы за 20 минут. Активность протеазы определяли по методу Гоффманна и Тейхера (1957) при длине волны 650 нм и выражали в мг аминного азота / 10 г почвы за 20 часов. Активность уреазы устанавливали по методике Щербаковой (1983) колориметрированием при длине волны 400 нм и выражали в мг аммонийного азота /10 г сух. почвы за 4 часа Определение аскорбатоксидазы методом титрования по Галстяну и Марукяну (1973). Активность липазы устанавливали по методу К.А. Козлова, Ю.А. Марковой, Э.Н. Михайловой (1968) [19].
Все показатели активности почвенных ферментов пересчитаны с учетом влажности почвогрунта на 1 г почвы.
Ферменты, в отличие от неорганических катализаторов, обладают избирательностью действия. Специфичность действия ферментов выражается в том, что каждый фермент действует лишь на определенное вещество, или же на определенный тип химической связи в молекуле. Наиболее полно экологические аспекты трансформации ферментного пула почвы при нефтяном загрязнении представлены в работе Е.И. Новоселовой [15], где проведены исследования активности основных групп почвенных ферментов.
Почвенные ферменты имеют, преимущественно, микробиологическое происхождение, являясь продуктами метаболических процессов микрофлоры, они также частично выделяются и корнями растений. При их определении учитывается образующийся продукт реакции или количество трансформированного исходного субстрата при оптимальных условиях для реакции [15, 18].
Каталаза относится к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, направляющие синтез и распад гумусовых веществ в почве. Прямое действие каталазы - это участие в реакции разложения перекиси водорода на воду и молекулярный кислород. Образуемая в результате дыхания и при окислении органического вещества перекись водорода является вредным для живых организмов веществом. Каталазу синтезируют все живые организмы, и поэтому она всегда обнаруживается в почве, но при низком значении рН и высокой температуре быстро инактивируется [11, 19].
Анализ полученных данных по каталитической активности показал, что в контрольном варианте уровень активности фермента за период исследования достоверно не различался -0,20-0,21 мл 0,1 н р-ра КМпО4 на 1 г почвы за 20 минут. В свою очередь в варианте с добавлением сорбента в течение времени активность грунта увеличилась до 0,25-0,28 мл 0,1 н р-ра КМпО4 на 1 г почвы за 20 минут, что связано с увеличением активности микроорганизмов, содержащихся в сорбенте, которые достигают пика своего развития к концу периода инкубации (рис.1).
||||||||||
а 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
■ 1 нед 0,21 0,25 0,24 0,19 0,24 0,24 0,18 0,22 0,12 0,19
■ 1 мес 0,2 0,27 0,23 0,2 0,23 0,24 0,17 0,23 0,12 0,21
2 мес 0,21 0,28 0,24 0,19 0,24 0,25 0,15 0,22 0,12 0,24
Рисунок 2- Динамика активности каталазы загрязненного почвогрунта (нумерация 1 -10 согласно схеме опыта) В вариантах с минимальным загрязнением (1 %) происходит незначительное увеличение активности каталазы по сравнению с контролем - 0,23-0,24 мл 0,1 н р-ра КМпО4 на 1 г почвы за 20 минут. Сорбент «Унисорб-био» с данным уровнем загрязнения почвогрунта способствовал стабилизации уровня до 0,19-0,20 мл и достоверно не различающегося с контролем. Аналогично этим значениям при 2,5 % уровне загрязнения происходит увеличение активности каталазы до 0,23-0,24 мл 0,1 н р-ра КМпО4 на 1 г почвы за 20 минут, в том числе и в варианте с сорбентом (рис.1).
Следовательно, данные уровни загрязнения (1 % и 2,5 %) стимулируют работу каталазы. Однако концентрации нефти 5 и 10 % загрязнение уже снижают каталитическую активность до 0,15 и 0,12 мл 0,1 н р-ра КМпО4 на 1 г почвы за 20 минут в первом и во втором случае. Использование «Унисорб-био» в вариантах с высоким уровнем загрязнения по сравнению с загрязненным почвогрунтом увеличивает каталитическую активность в 1,5-2 раза до 0,22-0,23 и 0,19-0,24 мл соответственно, что характеризует его как эффективное средство, действие которого направлено на снижение уровня нефтяного загрязнения. Уменьшая концентрацию нефти - восстанавливается микробиологическая активность почвогрунта и, следовательно, активность ферментов.
В целом необходимо отметить, что опыт по исследованию техногенного загрязнения необходимо проводить при разных концентрациях загрязнителя, так как существует возможность определить ту концентрацию, при которой еще не нарушается состояние экосистемы.
Установлено, что эффективность действия сорбента «Унисорб-био» проявляется при высоких концентрациях загрязнения почвогрунта - 5 и 10 % соответственно. Сорбент приводит уровень каталитической активности в состояние исходного контрольного варианта (незагрязненный почвогрунт). Нефть, попадая в почву в небольших дозах, является дополнительным источником углеводородов, в результате чего стимулирует активность микроорганизмов и, как следствие, ферментативную активность почв. Деградация нефти и нефтепродуктов в почве происходит преимущественно за счет окислительно-восстановительных реакций, осуществляемых оксидоредуктазами, поэтому при внесении небольших доз нефти активность ферментов возрастает. Однако высокие дозы загрязнителя ухудшают физические свойства почвы, влияют на газовый состав
почвенного воздуха, оказывают прямое токсическое действие на почвенную микрофлору, нарушая тем самым условия протекания ферментативных реакций, что в итоге приводит к снижению ферментативной активности.
Изучение другого окислительного фермента - аскорбатоксидазы показало, что в контроле уровень активности составляет 2,5 мг дегидроаскорбиновой кислоты на 1 г почвы за 1 час, аналогично минимальному загрязнению почвогрунта (1 %) (рис.2).
Рисунок 2- Динамика активности фермента аскорбатоксидазы загрязненного почвогрунта
В данной работе подтвердились данные о том, что с увеличением степени загрязнения увеличивается активность аскорбатоксидазы (рис.3). Объясняется это тем, что при загрязнении нефтью в почву поступают фенольные компоненты, которые косвенно, через образование хинонов и других окисленных продуктов, вызывали в почве окисление ряда веществ, в том числе и аскорбиновой кислоты. Окисление ее может проходить и при участии аскорбатоксидазы, активность которой возрастала пропорционально увеличению концентрации нефти [15].
С окислительно-восстановительными процессами в почве, происходящими при участии каталазы, аскорбатоксидазы связан распад нефтяных углеводородов [6, 7, 14, 15, 18], поэтому с увеличением концентрации поллютанта происходит и увеличение их активности, однако активность каталазы при 5 и 10 %-м уровне была ингибирована, тогда как активность аскорбатоксидазы увеличивалась в соответствие с уровнем загрязнения, и в вариантах с применением сорбента «Унисорб-био».
Учитывая то, что окислительно-восстановительные и гидролитические процессы в почве протекают одновременно и часть энергии образованной в одних реакциях используется в других, при биодиагностике загрязнения почв необходимо проводить определение активности данной группы ферментов. Исследуемые ферменты: протеаза, уреаза и липаза - относятся к классу гидролаз, широко распространенных в почвах и катализирующих реакцию гидролитического расщепления органических соединений, то есть определяющих интенсивность мобилизационных процессов и участвующих в обогащении почвы доступными для растений и микроорганизмов питательных веществами.
Протеазы (пептид - гидролазы), как и уреаза, относятся к группе пептид- и амидогидролаз, которая осуществляет последовательно распад белковых веществ в почве с выделением аммиака. Средняя протеолитическая активность незагрязненного почвогрунта составляет 0,79 мг аминного азота на 1г почвогрунта, тогда как при внесении сорбента происходит незначительное снижение активности до 0,63 мг аминного
азота на 1г почвогрунта. Уровень минимального загрязнения (1 %) не способствовал снижению, а наоборот привел к незначительному увеличению показателей активности протеазы, причем в течение периода наблюдения менялся в пределах от 0,77 до 0,80 мг, постепенно увеличиваясь к концу инкубации. Применение сорбента при данной концентрации нефти снизило активность до 0,54 мг (рис.3).
мг амминного азота на 1 г почвогрунта за 20 часов Рисунок 3- Динамика активности фермента протеазы загрязненного
почвогрунта
Следующий уровень загрязнения (2,5 %) по сравнению с контролем способствовал снижению активности до 0,67 мг, а варианте с сорбентом до 0,55 мг. Аналогичный уровень активности протеазы отмечался и в почвогрунте, загрязненном нефтью в концентрации 5 %, однако, при добавлении сорбента активность увеличилась и достигла значений достоверно не различающихся с контролем - 0,73 мг аминного азота на 1 г почвогрунта. Максимальное же загрязнение почвогрунта (10 %) привело к достоверному снижению протеолитической активности до 0,56 мг, тогда как в варианте с сорбентом, наоборот, активность увеличилась до 0,70 мг аминного азота на 1 г почвогрунта.
Известно, что при нефтяном загрязнении почвогрунта в связи с гидрофобной способностью нефти ухудшается кислородный режим, что приводит к снижению активности аэробных почвенных микроорганизмов, в частности аммонификаторов, которые являются основными продуцентами протеазы [16-18; 20].
Определенной тенденции изменения за период исследования не установлено, активность протеазы то увеличивалась после 1 -го месяца инкубации, а в некоторых вариантах увеличение показателей отмечалось на 2- месяц.
Таким образом, установлено, что чем выше уровень загрязнения, тем более интенсивно происходит восстановление показателей активности протеазы в вариантах с применением сорбента. Только при высоких концентрациях, проявляется эффективность действия сорбента, показатели возвращаются к контрольным.
Уреаза (карбамид - амидогидролаза) - это фермент способствующий преобразованию органического азота в почве, это узкоспециализированный фермент,
катализирующий гидролиз мочевины (карбамид) до аммиака и углекислоты. В почве мочевина находится в составе растительных остатков, навоза, азотных удобрений, а также образуется как промежуточный продукт превращения белков и нуклеиновых кислот. Обнаруживается она во всех почвах и, по некоторым данным, коррелирует с активностью других ферментов азотного обмена [5, 8, 9].
Активность уреазы исследуемого почвогрунта определена как низкая - 0,16 мг аммонийного азота/ г почвы за 4 часа (шкала Гапонюк, Малахов, 1985), а при добавлении сорбента «Унисорб-био» данные достоверно не различались с контролем - 0,18 мг.
Следует отметить, что при 1 % уровне загрязнения изменения показателей активности уреазы не происходит, при этом значения колебались за период наблюдения от 0,15 до 0,16 мг аммонийного азота/ г почвы за 4 часа, а при добавлении сорбента снизились в среднем до 0,12 мг аммонийного азота / г почвы за 4 часа. Однако уже в вариантах с концентрацией нефти 2,5 % активность уреазы увеличилась и достигла в среднем 0,21 мг, причем максимум отмечался в 1 месяц инкубации (рис.4).
Рисунок 4- Динамика активности фермента уреазы загрязненного
почвогрунта
В случае с применением сорбента активность при данном уровне загрязнения активность снизилась до 0,18 мг, а в течение периода исследования постепенно увеличивалась с 0,17 до 0,19 мг соответственно. Аналогичные данные получены и при 5 % концентрации нефти, а именно, достоверного отличия в варианте с сорбентом не установлено. Необходимо, так же отметить, что при максимальной концентрации нефти (10 %) происходит увеличение активности уреазы в среднем в 1,5 раза по сравнению с контролем, тогда как сорбент снижает показатели до 0,23-0.25 мг аммонийного азота/ г почвы за 4 часа (рис.4).
Таким образом, сам фермент уреаза реагирует на загрязнение увеличением активности, поэтому может использоваться как диагностический критерий, а «Унисорб-био» приводит ее значения к исходному уровню.
Данный факт отмечают и другие ученые [5; 6-9; 13] объясняя это тем, что за счет поступления нефти происходит увеличение содержания органического углерода в почве, который активизирует азотный обмен. Нефтяное загрязнение снижает рН почвенного раствора, что является условием увеличения активности уреазы при увеличении загрязнения почвы.
В качестве показателя степени загрязнения и активности процессов восстановления в данной работе была использована активность липазы. Установлено, что липолитическая активность незагрязненного почвогрунта составила 9,7 мл 0,1 н р-ра КОН на 5 г почвы, тогда как сорбент «Унисорб-био» снижает активность до 8,3 мл 0,1 н р-ра КОН на 5 г почвы, т.е. проявляются его сорбционные свойства (рис.5).
-
1Г) =
И
о
*
ез
Н =
& -
о а т
о С
1 нед
1 мес
2 мес
Рисунок 5- Динамика активности фермента липазы загрязненного
почвогрунта
Загрязнение почвогрунта 1 % и 2,5 % способствовало увеличению активности липазы до 13,1 и 10,9 мл соответственно, а в данных вариантах с применением сорбента значения снизились и приблизились к 11,8 и 11,3 мл 0,1 н раствора KOH на 5 г почвы соответственно (рис.5).
Исследования показали, что при низких концентрациях нефти происходит стимуляция активности липазы, а при высоких наоборот ее снижение. Повышение интенсивности процессов липолиза в данном случае при минимальном загрязнении связано и с тем, что в деградации липидов участвуют ферментные системы аналогичные системам, участвующим в биодеградации нефти Гидролитические ферменты, такие как протеаза, реагируют на загрязнение почвы нефтью снижением своей активности, тогда как активность уреазы наоборот увеличивается. Это может быть связано как с подавлением деятельности микроорганизмов, участвующих в азотном обмене и круговороте углерода (протеаза), так и с их стимуляцией (уреза), что отражается на изменении органического азота в почве [15]. Эффективность действия «Унисорб-био» определена благодаря сохранению или возвращению уровня ферментативной активности загрязненного почвогрунта к контрольным показателям.
Заключение. Высокие уровни загрязнения почвогрунта ингибируют активность фермента каталазы, а использование сорбента «Унисорб-био» увеличивает каталитическую активность до контрольных значений. Активность аскорбатоксидазы возрастает в соответствие с уровнем загрязнения, в том числе в вариантах с применением сорбента «Унисорб-био». Фермент уреаза реагирует на нефтяное загрязнение увеличением активности, поэтому может использоваться как диагностический критерий, сорбент «Унисорб-био» приводит ее значения к исходному уровню. Высокие концентрации нефти способствовали снижению активности липазы, а содержащиеся в сорбенте углеводородокисляющие микроорганизмы наоборот повышали липолитическую активность. Эффективность действия сорбента «Унисорб-био» определена на основании исследования активности окислительных и гидролитических ферментов, уровень которых сохраняется в стабильном состоянии или возвращается к контрольным значениям.
Список литературы
1. Шигаева М.Х., Мукашева Т.Д. Биотехнологические подходы в очистке нефтезагрязнений окружающей среды // Вестник КазНУ. Серия биологическая. - 2007. -№ 1 (31). -С. 35-42. с.
2. Вальков В.Ф. Экологическое почвоведение / В.Ф. Вальков. - Краснодар: КГАУ, 2004. - 168 с.
3. Васильев, С.И. Эффективная ликвидация аварийных разливов нефти и нефтепродуктов с применением современных технологий и полимерных сорбентов // Системы. Методы. Технологии. - 2010. - №3. - С. 115.
4. Васильев С.И. и др. Технология сорбционной и биологической очистки биосферы от загрязнений нефтепродуктами // Системы. Методы. Технологии. - 2011. -№ 11. - С. 168-179.
5. Гайворонский, В.Г. Моделирование загрязнения чернозема слитого мазутом с целью установления экологически безопасной концентрации / Гайворонский В.Г. и др. // Сборник трудов V международной научно-практической конференции «Экологические проблемы. Взгляд в будущее». Ростов-на-Дону, 2008. - С. 119-123.
6. Киреева Н.А. и др. Микробиологическая рекультивация нефтезагрязненных почв. - Москва: Изд-во «ВНИИОЭНГ», 2001. - 40с.
7. Киреева Н.А., Новоселова Е.И., Онегова Т.С. Активность каталазы и дегидрогеназы в почвах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами // Агрохимия, 2002. -№ 8.-С 64-72.
8. Клюянова, М.А. Разработка основы биопрепарата для деградации нефти при загрязнении природных сред. - Уфа, 2009. - 24 с.
9. Колесников С.И., Татосян М.Л., Азнаурьян Д.К. Изменение ферментативной активности чернозема обыкновенного при загрязнении нефтью и нефтепродуктами в модельных экспериментах // Доклады Россельхозакадемии. - 2007. - № 5. - С. 32-34.
10. Лапушова Л.А., Васильев С.И. Результаты исследования структуры полимерных сорбентов «Униполимер» для ликвидации техногенных разливов нефти и нефтепродуктов // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. - № 6. - 2015. -с.17-21.
11. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. -М.: МГУ, 1991. - 303 с.
12. Мязин В.А. Разработка способов повышения эффективности биоремедиации почв Кольского севера при загрязнении нефтепродуктами (в условиях модельного эксперимента): дисс. канд. биол. наук.- Апатиты, 2014. - 159 С.
13. Новоселова Е.И., Киреева Н.А. Моделирование условий рекультивации нефтезагрязненных почв в лабораторных условиях // Итоги науч. исследований биологического факультета Башкирского госуниверситета за 1995 год. - Уфа: БашГУ, 1996. - С.11-12.
14. Новоселова Е.И. Использование ферментативной активности для мониторинга биоремедиации нефтезагрязненных почв // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2007. № 75. - С.246-247.
15. Новоселова Е.И. Экологические аспекты трансформации ферментного пула почвы при нефтяном загрязнении и рекультивации. - Воронеж, 2008. - 41 с.
16. Пиковский Ю.И. Природные и техногенные потоки углеводородов в окружающей среде - М.: Изд-во МГУ, 1993. - 207 с.
17. Ротина, Е.Н. Оценка экологического состояния загрязненных мазутом почв по биологическим показателям / Е.Н. Ротина, С.И. Колесников // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Естеств. науки. 2008. - № 5. - С. 102-104.
18. Хазиев Ф.Х., Фатхиев Ф.Ф. Изменение биохимических процессов в почвах при нефтяном загрязнении и активация разложения нефти // Агрохимия. - 1981. - № 10. - С. 102-111.
19. Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. - М.: Наука, 2005. - 250 с.
20. Щемелинина Т.Н., Новоселова Е.И., Киреева Н.А., Маркарова М.Ю. -Диагностирование степени загрязненности почв нефтью по показателям ферментативной активности // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2007. - №75. -С.432-434
