CC BY
19
DOI: 10.21055/0370-1069-2021-2-79-86
УДК 616.932:579.25
А.с. Гладких, и.с. федотова, л.В. миронова
способ определения профиля генов антибиотикорезистентности у штаммов vibrio cholerae с помощью пцр в режиме реального времени
ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока», Иркутск,
Российская Федерация
цель работы заключалась в конструировании и опытно-экспериментальных исследованиях набора реагентов для выявления спектра генов, детерминирующих резистентность к антибактериальным препаратам у штаммов Vibrio cholerae. материалы и методы. В работу были взяты штаммы V. cholerae, выделенные от людей и из объектов окружающей среды во время эпидосложнений и в благополучный по холере период. Чувствительность к антимикробным препаратам оценивали диско-диффузионным методом. Полногеномное секвенирование проведено на приборе Illumina MiSeq. Профиль генов резистентности определяли на основании сравнения с базой данных ResFinder. Проведены оптимизация температурного режима, состава реакционных смесей, подбор параметров реакции, определены специфичность, чувствительность и воспроизводимость сконструированного прототипа тест-системы. результаты и выводы. Для взятых в работу штаммов определен спектр устойчивости к антибиотикам и профиль генов резистентности. Для разработки мультиплексной ПЦР выбраны наиболее распространенные в популяциях V. cholerae гены, обусловливающие устойчивость к тетрациклину (tetA), стрептомицину (strA), флорфениколу/хлорамфениколу (floR) и триметоприму/сульфаметоксазолу (две формы гена диги-дрофолатредуктазы: dfrA1 и dhfR), а также ген интегразы SXT-элемента (int). В реакции специфично выявляются маркеры в соответствии с геномным профилем резистентности, что коррелирует с фенотипическим проявлением устойчивости, определенным диско-диффузионным методом. Чувствительность разработанной панели прайме-ров и зондов для штаммов V. cholerae составила 103-104 КОЕ/мл. Таким образом, учитывая специфичность, быстроту и простоту постановки реакции, разработанная система праймеров и зондов может быть успешно применена для предварительной оценки резистентности штаммов V. cholerae к антимикробным препаратам.
Ключевые слова: Vibrio cholerae, гены антибиотикорезистентности, SXT-элемент, ПЦР-тест-система.
Корреспондирующий автор: Гладких Анна Сергеевна, e-mail: angladkikh@gmail.com.
Для цитирования: Гладких А.С., Федотова И.С., Миронова Л.В. Способ определения профиля генов антибиотикорезистентности у штаммов Vibrio cholerae с помощью ПЦР в режиме реального времени. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; 2:79-86. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-2-79-86
Поступила 21.08.2020. Отправлена на доработку 15.09.2020. Принята к публ. 05.10.2020.
A.S. Gladkikh, I.S. Fedotova, L.V. Mironova
Method for Determining the Profile of Antibiotic Resistance Genes in the Vibrio cholerae Strains by RT-PCR
Irkutsk Anti-Plague Research Institute of Siberia and Far East, Irkutsk, Russian Federation
Abstract. The aim of the work was to design and carry out experimental studies of a set of reagents to identify the spectrum of genes that determine the resistance of the Vibrio cholerae strains to antibacterial drugs. Materials and methods. V. cholerae strains isolated from humans and environmental objects during epidemiological complications and the cholera-free period were included in the study. Sensitivity to antimicrobial drugs was evaluated by the disk diffusion method. Whole genome sequencing was performed on an Illumina MiSeq. The profile of resistance genes was determined based on a comparison with the ResFinder database. The temperature regime, the composition of the reaction mixtures, and the reaction parameters were optimized; the specificity, sensitivity and reproducibility of the constructed prototype test system were measured. Results and discussion. The spectrum of antibiotic resistance and the profile of resistance genes were determined for the studied strains. To develop multiplex PCR, we selected the most common in the V. cholerae populations genes, which are responsible for resistance to tetracycline (tetA), streptomycin (strA), florfenicol/ chloramphenicol (floR) and trimethoprim/sulfamethoxazole (two variants of the dihydrofolate reductase gene: dfrA1 and dhfR), as well as SXT element integrase gene (int). In the reaction, markers were specifically detected in accordance with the genomic resistance profile, which correlates with the phenotypic manifestation of resistance determined by the disco-diffusion method. The sensitivity of the developed panel of primers and probes for V. cholerae strains was 103-104 CFU/ml. Therefore, taking into account the specificity, rapidity and simplicity of the reaction, the developed system of primers and probes can be successfully applied for a preliminary assessment of the resistance of the V. cholerae strains to antimicrobial agents.
Key words: Vibrio cholerae, antibiotic resistance genes, SXT element, PCR test system.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Corresponding author: Anna S. Gladkikh, e-mail: angladkikh@gmail.com.
Citation: Gladkikh A.S., Fedotova I.S., Mironova L.V. Method for Determining the Profile of Antibiotic Resistance Genes in the Vibrio cholerae Strains by RT-PCR. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2021; 2:79-86. (In Russian). DOI: 10.21055/0370-1069-2021-2-79-86
Received 21.08.2020. Revised 15.09.2020. Accepted 05.10.2020.
Gladkikh A.S., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6759-1907 Mironova L.V., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8481-6442
Fedotova I.S., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9890-0960
Антибиотикотерапия - основной метод, применяемый для лечения инфекционных заболеваний, однако в последние годы эффективность многих препаратов снижается или сводится к нулю из-за развития у микроорганизмов стойкой резистентности к ним. За относительно короткий в эволюционном плане период благодаря высокой адаптивности микроорганизмы приобрели механизмы, позволяющие избегать летальных воздействий антимикробных веществ. Механизмы устойчивости к антибиотикам многообразны и сложны и в наиболее общем виде могут быть классифицированы на четыре группы: а) модификация сайтов-мишеней антибиотиков; б) снижение проникающей способности внешних мембран клеток (уменьшение числа белков-поринов); в) активное выведение противомикробных веществ из клетки посредством эффлюксных насосов; г) адаптивные изменения метаболических путей клетки через модификацию регуляторных сетей. Устойчивость к каждому антимикробному классу обычно достигается путем вовлечения нескольких биохимических механизмов [1].
Приобретению лекарственной устойчивости способствуют хромосомные мутации или развитие генетической резистентности путем приобретения конъюгативных плазмид, конъюгативных транспозо-нов, интегронов или способных к самостоятельному переносу хромосомных интегрирующих элементов. по оценкам исследователей, при анализе доступных бактериальных геномов выявлено около 20 тыс. генов (r-гены), потенциально связанных с антибио-тикорезистентностью, однако число детерминант с экспериментально подтвержденной ассоциированностью с антибиотиками значительно ниже [2, 3].
Холера - острое инфекционное антропонозное заболевание, характеризующееся эпидемическим распространением, вызываемое Vibrio cholerae 01 и 0139 серогрупп. Холера клинически проявляется от вибрионосительства и бессимптомных форм до тяжелого синдрома дегидратации вследствие потери жидкости с водянистыми испражнениями и рвотными массами, приводящего к летальному исходу. Антибиотикотерапия позволяет сократить сроки и тяжесть протекаемого заболевания: при этом рекомендованы медикаменты групп тетрациклинов, фторхинолоны и триметоприм (последний входит в состав комбинированных препаратов, таких как ко-тримоксазол и бисептол).
По данным ВОЗ, V. cholerae входит в группу микроорганизмов, для которых отмечается неуклонный рост устойчивости к антимикробным препаратам. Если на ранних этапах текущей пандемии возникновение лекарственной устойчивости было предопределено спонтанными мутациями, то в настоящее время большая честь генов устойчивости привносится в геном посредством мобильных генетических элементов, в частности SXT [4, 5]. В настоящее время SXT-элементы обнаруживаются практически у всех клинических штаммов и некоторых штаммов, изоли-
рованных из объектов окружающей среды, и характеризуются вариабельным генным составом [6].
Выявление в кратчайшие сроки этиологического агента болезни и спектра его резистентности к антибактериальным препаратам определяет тактику лечения и способствует благоприятному исходу болезни. Следует сказать, что, несмотря на наличие на отечественном рынке тест-систем для идентификации V. cholerae, в их составе отсутствуют компоненты, позволяющие установить профиль антибиотико-резистентности.
цель работы заключалась в конструировании и опытно-экспериментальных исследованиях набора реагентов для выявления спектра генов, детерминирующих резистентность к антибактериальным препаратам у штаммов V. cholerae.
Материалы и методы
В работу взято 15 штаммов V. cholerae, выделенных на территории Сибири и Дальнего Востока, 10 из которых выделены от людей и объектов окружающей среды во время эпидосложнений по холере, штамм V. cholerae И-1299 выделен от вибриононоси-теля. Помимо этого использованы штаммы представителей семейств Vibrionaceae и Enterobacteriacea, возбудители острых кишечных инфекций: Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginoliticus, Esherichia coli, Shigella dysenteriae, Salmonella tiphimurium. Штаммы культивировали на щелочном агаре при температуре 37 °С. Характеристика штаммов представлена в табл. 1.
Определение чувствительности штаммов к антимикробным препаратам. Чувствительность культур к антимикробным препаратам определяли диско-диффузионным методом. Штаммы культивировали на агаре Мюллера - Хинтона, использовали диски, пропитанные антибиотиками, произведенные НИЦФ (Санкт-Петербург, Россия). Учет результатов проводили путем измерения зон задержки роста, согласно МУК 4.2.2495-09 для штаммов р. Vibrio и МУК 4.2.1890-04 для штаммов сем. Enterobacteriacea.
Полногеномное секвенирование и поиск детерминант антибиотикорезистентности в геномах. Выделение ДНК проводили набором Quigen (Германия), подготовку геномных библиотек осуществляли с помощью набора Nextera XT (Illumina, США), полногеномное секвенирование проведено на приборе Illumina MiSeq. Первичный процессинг сырых данных осуществляли программным комплексом прибора, сборка de novo произведена геномным ассемблером SPAdes v.3.13.0 [7]. Профиль устойчивости к антибиотикам определялся с помощью BLASTN-поиска против базы данных ResFinder [8].
Подбор праймеров и зондов и параметров реакции ПЦР в режиме реального времени. Последовательности искомых генов были изолированы из полногеномных сборок каждого штамма с
Таблица 1 / Table 1
характеристика штаммов, взятых в исследование Characteristics of the strains taken in the study
Штамм Strain Серогруппа Serogroup Серовариант Serovariant Профиль генов патогенности Pathogenicity gene profile Место, год и объект выделения штамма Site, year and origin of the strain
V cholerae И-1263 О1 Огава Ogawa cxtA+tcpA+ Иркутск, 1997 г., человек Irkutsk, 1997, human
V. cholerae И-1300 О1 Огава Ogawa cxtA+tcpA+ Южно-Сахалинск, 1999 г., человек Yuzhno-Sakhalinsk, 1999, human
V cholerae И-1334 О1 Огава Ogawa cxtA+tcpA+ Владивосток, 1999 г., человек Vladivostok, 1999, human
V. cholerae И-1181 О1 Огава Ogawa cxtA+tcpA+ Новосибирск, 1994 г., человек Novosibirsk, 1994, human
V. cholerae И-1316 О1 Огава Ogawa cxtA+tcpA+ Южно-Сахалинск, 1999 г., вода Yuzhno-Sakhalinsk, 1999, water
V. cholerae И-1330 О1 Огава Ogawa cxtA+tcpA+ Владивосток, 1999 г., вода Vladivostok, 1999, water
V. cholerae И-1187 О1 Огава Ogawa cxtA+tcpA+ Барнаул, 1994 г., человек Barnaul, 1994, human
V. cholerae И-1183 V. cholerae И-1184 V. cholerae И-1185 О1 Огава Ogawa cxtA+tcpA+ Омск, 1994 г., человек Omsk, 1994, human
V. cholerae И-1299 О1 Огава Ogawa cxtAtcpA- Южно-Сахалинск, 1999 г., человек Yuzhno-Sakhalinsk, 1999, human
V. cholerae 1-17 О1 Инаба Inaba cxtAtcpA- Иркутск, 2017 г., вода Irkutsk, 2017, water
V. cholerae И-1447 О1 Инаба Inaba cxtAtcpA- Иркутск, 2010 г., вода Irkutsk, 2010, water
V. cholerae И-1467 О1 Инаба Inaba cxtAtcpA- Иркутск, 2011 г., вода Irkutsk, 2011, water
V. cholerae 22-19 не О1/О1З9 non O1/O139 - cxtAtcpA- Иркутск, 2019 г., вода Irkutsk, 2019, water
S. typhimurium 14 - - н/д n/d ЦНИИЭ, Москва, 1976 г., н/д CRIE Moscow, 1976, n/d
V. alginoliticus 5-14-B - - н/д n/d Владивосток, 2014 г., человек Vladivostok, 2014, human
V. paragemoliticus 226-12-B - - tdh+ Владивосток, 2012 г., человек Vladivostok, 2012, human
E. coli 18/51 - - н/д n/d н/д n/d
Sh. dysenteriae 19 - - н/д n/d н/д n/d
Примечание: н/д - нет данных. Note: n/d - no data..
помощью авторских bash-скриптов. Выравнивание последовательностей с целью поиска консервативных участков, пригодных для конструирования праймеров и зондов, проведено в программе MEGA X [9]. Помимо ассемблированных геномов в элаймент включены последовательности генов резистентности к антибактериальным препаратам из БД ResFinder [8]. Подбор праймеров и зондов производился средствами программного обеспечения FastPCR Professional v.6.6.35 [10]: дизайн и первичную оценку компонентов осуществляли в модуле PCR Primer Design; проведение мультиплексной реал-тайм ПЦР in silico проводили в модуле in silico PCR; тестирование наборов праймеров на образование димерных фрагментов осуществляли в модуле Primers List Analysis.
Проведение ПЦР c электрофоретическим учетом и в режиме реального времени. ДНК выделяли набором «РибоПреп» (Россия) согласно инструкции производителя. В реакциях ПЦР использовали реактивы компании «Синтол» (Россия), праймеры и зонды, синтезированные компанией Beagle (Россия). Оптимизацию температурного режима для повышения специфичности реакции проводили путем постановки реакции с электрофоретическим учетом результатов на приборе BioRad С1000. Подбор параметров реакции и оптимизация реакционных смесей проведены на приборе Rotor-Gene Q 5plex (Qiagen Inc., GMBH, Германия). Учет результатов проводили по каналам для красителей FAM, R6G, ROX, Cy5. В первую позицию ротора помещали пробирку отрицательного контроля, не содержащую Днк ни
одного из штаммов, для установления порога фоновой флуоресценции. Учет результатов проводили пороговым методом, фиксируя значение цикла в точке пересечения кривой флуоресценции порогового уровня. При учете результатов устанавливали линейную шкалу учета значений, порог флуоресценции -0,05 для красителей FAM, R6G, Су5 и 0,1 для красителя ROX, корректировку уклона, динамический фон и устранение выбросов - 5 %.
Чувствительность реакции оценивали путем проведения реакции ПЦР в режиме реального времени с ДНК штаммов И-1187 и И-1263 с концентрациями клеток от 109 до 101 КОЕ/мл. Приготовление суспензии 109 проводили согласно 5 ЕД ОСО мутности (ГИСК им. Тарасевича, Россия), далее готовили серию 10-кратных разведений, точность которых оценивали трехкратными контрольными высевами на пластинки щелочного агара с подсчетом числа выросших колоний через 18 ч инкубации при 37 °С. Воспроизводимость реакций проверяли трехкратной постановкой всех проводимых тестов.
Результаты и обсуждение
Фенотипические проявления устойчивости и профиль антибиотикорезистентности. При
учете антибиотикограмм определен спектр рези-
стентности к антибиотикам у штаммов, взятых в исследование (табл. 2). При сканировании геномов через БД Resfinder определен профиль резистентности для выборки исследуемых штаммов V. cholerae (табл. 2). Все штаммы, выделенные во время эпид-осложнений по холере, содержат в составе геномов набор генов резистентности. V. cholerae И-1299, а также четыре штамма, выделенные из воды в период эпидблагополучия по холере, не несут искомых генов. В отсутствие генов резистентности штаммы V. cholerae были чувствительны ко всем применяемым препаратам.
Определение набора мишеней для выявления детерминант антибиотикорезистентности и конструирование праймеров и зондов. Для разработки мультиплексной ПЦР согласно литературным данным и результатам собственных исследований были выбраны наиболее распространенные в популяциях V. cholerae гены, обусловливающие устойчивость к тетрациклину (tetA), стрептомицину (strA), флорфениколу/хлорамфениколу (floR) и тримето-приму/сульфаметоксазолу (две формы гена дигидро-фолатредуктазы: dfrA1 и dhfR, - последняя характерна для штаммов, циркулирующих на территории Китая), а также ген интегразы (int) - маркер наличия SXT-элемента в геноме. При составлении элаймен-та обнаружена гетерогенность последовательностей
Таблица 2 / Table 2
фенотипический и геномный профиль устойчивости к антимикробным препаратам штаммов V. cholerae, взятых в исследование Phenotypic and genomic antimicrobial resistance profile of V. cholerae strains taken in the study
Наименование и номер штамма Strain's name and number Антимикробный препарат* Antibiotic* Генный профиль резистентности к антибиотикам согласно БД ResFinder Resistance gene profile according ResFinder DB
л L нк NA с S т T т/с T/S ц C
V cholerae И-1263 V. cholerae И-1187 V. cholerae И-1185 R** R R S R S int, strA, strB, catB9, floR, sul2, dfrAl
V. cholerae И-1300 V. cholerae И-1334 R S R R R S int, strA, strB, floR, catB9, sul2, tet(A), dhfR
V. cholerae И-1316 R R R R R S int, strA, strB, floR, catB9, sul2, tet(A), dhfR
V. cholerae И-1181 R R R R R S int, aadAl, strA, strB, floR, catB9, sull, sul2, tet(A), dfrAl
V. cholerae И-1183 R S R R R S int, aadAl, strA, strB, floR, catB9, sull, sul2, tet(A), dfrAl
V. cholerae И-1184 I S R R R S int, aadAl, strA, strB, floR, catB9, sull, sul2, tet(A), dfrAl
V. cholerae И-1330 S R R R S S int, strA, strB, catB9, sul2, tet(A)
V. cholerae И-1299 V. cholerae И-1447 S S S S S S catB9
V. cholerae И-17 V. cholerae И-1467 V. cholerae 22-19 S. typhimurium 14 V. alginoliticus 5-14-B V. paragemoliticus 226-12-B E. coli 18 S S S S S S -
Sh. dysenteriae 19 R S R S S S -
Примечание:
*Л - левомицетин, HK - налидиксовая кислота, С - стрептомицин, Т - тетрациклин, Т/С - триметоприм/сульфаметоксазол, Ц - циплофлокса-
цин.
**R - резистентный, S - чувствительный, I - промежуточный. Note:
*L - chloramphenicol, NA - nalidixic acid, S - streptomycin, T - tetracycline, T/S - trimethoprim/sulfamethoxazole, C - ciprofloxacin. **R - resistant, S - sensitive, I - intermediate.
Таблица 3 / Table 3
специфичные праймеры и зонды Specific primers and probes
Имя Name Последовательность (5' ^ 3') Sequence (5' ^ 3') Длина праймера, н. Primer length, nucl. Длина ампликона, н. Amplicon length, nucl. Температура, °C Tm, °C
teta_f tcatcatgcaacttgtcggaca 22 201 56.3
teta r cggcaatcattccgagcatga 21 57.6
teta_pr FAM-actcgcccaggcaatgatcaccggcc-BHQ-1 26 68.3
stra f caatgccgtcaatcccgactt 21 231 57.5
stra r tcggcatagcgatctgctgtt 21 58.1
stra_pr FAM-tcgaccttgggcggctcggaacagca-BHQ-1 26 68.8
dfra_f gagttatcgggaatggccctgat 23 336 58
dfra r caccttccggctcgatgtcta 21 57.8
dfra_pr R6G-acgtgttacgaccgcatactttcggt-BHQ-1 26 62
dhfr_f tcttgaaggatgtttcgctgcat 23 287 56.8
dhfr r tggaaattgccggctgatatgaa 23 56.6
dhfr_pr ROX-tgagctcctggtgcttgatagccgat-BHQ-2 26 62.8
int_f tggatagactctgccggtaagc 22 316 57.7
int r cgttgtcatttagcacccgagt 22 57.3
int_pr Cy5-taacgctgccgctgggatcacagcaa-BHQ-3 26 65.9
flor_f atccaactcacgttgagcctcta 23 351 57
flor r tcccaagaactcgccgatcaa 21 57.6
flor_pr Cy5-ccgacgcgcccactgcttgaagta-BHQ-3 24 65.3
гена интегразы. На основании элайментов генов-мишеней, полученных из геномных сборок, и последовательностей БД Resfinder разработаны праймеры и зонды к указанным генам; учитывая вариабельность гена интегразы, праймеры и зонд были подобраны на консервативный участок гена (табл. 3), проведен расчет температур отжига. Проверка с помощью компонента программы Primer dimer analysis показала, что разработанные праймеры не образуют устойчивых димеров, при проведении in silico ПЦР перекрестных реакций не происходило.
Определение специфичности разработанного набора праймеров и подбор оптимальных параметров реакции. Тестирование синтезированных праймеров для оценки их специфичности методом пцр с детекцией в формате электрофореза с градиентом температур от 50 до 60 °С показало, что при температуре 60 °с синтезируется только продукт ожидаемой длины и отсутствуют дополнительные полосы неспецифической амплификации. данная температура выбрана как оптимальная для этапа отжига праймеров и синтеза цепи.
для выявления детерминант антибиотикорези-стентности в режиме реального времени вместе с праймерами использовали синтезированные зонды. прототип тест-системы на основе пцр в режиме реального времени включал следующие компоненты в количестве на одну постановку: 2,5 мкл 10х ПЦР-буфера; 2,5 мкл 2,5 мМ dNTP (дезоксинуклео-тидтрифосфатов); 2,5 мкл 25 мМ раствора MgCl2;
0,5 мкл SynTaq ДНК-полимеразы (5 Е/мкл); деиони-зованная вода до 25 мкл; смесь праймеров в концентрации 10 пкмоль/мкл по 0,5 мкл каждого и зонды в концентрации 10 пкмоль/мкл по 0,2 мкл; 5 мкл образца ДНК в количестве 10 нг на реакцию. Подобраны оптимальные сочетания мультиплекс-смесей для учета по нескольким каналам детекции одновременно: пробирка 1 включает в себя компоненты для поиска мишеней strA,floR, int, пробирка 2 - мишеней tetA, dfrA, dhfR. Реакцию проводили по следующей программе: 95 °С - 5 мин, 10 циклов без детекции сигнала флуоресценции (60 °С - 30 с, 95 °С - 15 с) и 25 циклов с детекцией сигнала флуоресценции (60 °С - 30 с (детекция), 95 °С - 15 с). Длительность реакции амплификации составила 66 мин.
при тестировании прототипа тест-системы получены положительные значения CT для штаммов, содержащих искомые гены на основании анализа полногеномных последовательностей (рисунок, табл. 4). Наличие гена и, как следствие, положительная реакция в ПЦР коррелировали с профилем резистентности, полученным на основании учета результатов диско-диффузионного теста. специфичность реакции оценена по отсутствию пороговых значений флуоресценции для штаммов, в геноме которых гены резистентности не представлены. Штамм Sh. dysenteriae также обнаружил наличие гена srtA, что коррелировало с устойчивостью к стрептомицину. Чувствительность разработанной панели праймеров и зондов составила 103-104 КОЕ/мл.
Результаты обнаружения гена int в ПЦР в режиме реального времени (канал учета Cy5):
1 - V. cholerae И-1181; 2 - V. cholerae И-1344; 3 - V cholerae И-1300; 4 - V cholerae И-1184; 5 - V. cholerae И-1183; 6 - V. cholerae И-1185; 7 - V cholerae И-1263; 8 - V cholerae И-1316; 9 - V cholerae И-1330; 10 - V. cholerae И-1187
Results of int gene detection in real-time PCR (Cy5 detection channel):
1 - V. cholerae И-1181; 2 -3 - V. cholerae И-1300; 4 5 - V cholerae И-1183; 6 -7 - V cholerae И-1263; 8 -
V. cholerae И-1344; V. cholerae И-1184; V cholerae И-1185; V. cholerae И-1316;
9 - V. cholerae И-1330; 10 - V. cholerae И-1187
ПЦР-анализ отличается высокой точностью, чувствительностью, простотой постановки и высокой скоростью получаемого результата, в его основе лежит поиск заданных генных детерминант, дифференцирующих организм и/или определяющих те или иные его свойства. В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, как правило, пцр-тест-системы направлены на идентификацию и типирова-ние возбудителя, а также определение детерминант патогенности. разработанная система праймеров и зондов позволяет одновременно детектировать наличие SXT-элемента путем поиска гена интегразы (int) и определять профиль маркеров устойчивости. выявляемые в составе прототипа тест-системы маркеры входят в состав известных вариантов SXT согласно классификации М. Spagnoletti et al. [11]. Помимо SXT-кассеты искомые маркеры могут быть локализованы и в составе конъюгативных плазмид и
интегрона класса I [12], учитывая общность структуры генов независимо от их локализации, они также могут быть выявлены ходе ПЦР.
Известно, что антибиотикорезистентность выявляется как у клинических, так и у водных штаммов V. с^1егае вне зависимости от географического происхождения и места выделения [5]. При этом один изолят может содержать до 40 различных генов, обеспечивающих устойчивость к 22 антибиотикам, представляющим девять различных классов антимикробных препаратов [13]. Сконструированная в работе система праймеров и зондов позволяет одновременно детектировать в геноме V. с^1егае присутствие SXT-элемента и пять маркеров устойчивости к антибиотикам. Искомые гены определяют устойчивость к актуальным в терапии препаратам: триметоприму, хлор-амфениколу, стрептомицину и тетрациклину, входящим в десятку антимикробных препаратов, к которым
Таблица 4 / Table 4
Результаты определения генного профиля антибиотикорезистентности на основании разработанного набора праймеров и зондов The results of determining the gene profile of antibiotic resistance based on the developed set of primers and probes
Штамм Strain int Cy5 strA FAM tetA FAM floR ROX dfrA R6G dhfR ROX Генный профиль Gene profile
V cholerae И-1263 V cholerae И-1187 V. cholerae И-1185 + + - + + - int, strA, strB, floR, dfrAl
V. cholerae И-1300 V cholerae И-1334 V. cholerae И-1316 + + + + - + int, strA, strB, floR, tet(A), dhfR
V. cholerae И-1181 V cholerae И-1183 V cholerae И-1184 + + + + + - int, strA, strB, floR, tet(A), dfrAl
V. cholerae И-1330 + + + - - + int, strA, strB, tet(A)
V. cholerae И-1299 V cholerae И-1447 V. cholerae И-17 V. cholerae И-1467 V cholerae 22-19 S. typhimurium 14 V. alginoliticus 5-14-B V. paragemoliticus 226-12-B E. coli 18 - - - - - -
Sh. dysenteriae 19 - + - - - - нет данных, предположительно наличие гена strA no data, presumably presence of strA gene
на сегодняшний день наиболее часто детектируется устойчивость [13]. Ранее российскими авторами была разработана тест-система для одновременной детекции четырех маркеров антибиотикорезистентности у штаммов V. с/о1егае: гены tetR, qnrVC, ё/гЛ и floR, определяющие устойчивость к тетрациклину, фтор-хинолонам, триметоприму и хлорамфениколу соответственно [14]. Следует отметить, что разработанная в рамках настоящей работы тест-система способна выявить также детерминанты устойчивости к стрептомицину srtЛ, вторую аллель гена дегидрофолатре-дуктазы и ген интегразы мобильного элемента
SXT. Подобранные олигонуклеотиды и зонды обнаружили высокую воспроизводимость и специфичность при мультиплексировании.
За устойчивость к хлорамфениколам у штаммов V. с/о1егае ответственны гены floR и catB, однако присутствие последнего у штаммов, взятых в исследование, не обеспечивало наличие признака фенотипической устойчивости. В то время как при отсутствии генаfloR у штамма, выделенного во время вспышки холеры во владивостоке, отмечалась утрата устойчивости к хлорамфениколу [15].
В качестве мишеней разработанной системы праймеров и зондов используются два маркера гена дегидрофолатредуктазы (ё/гЛ1 и dh.fR), последний характерен для штаммов, изолируемых на территории Китая [16], таким образом, помимо диагностической ценности, выявление гена позволяет сделать предположение о происхождении штамма.
На примере выборки штаммов V. с/о1егае, выделенных в разные годы в разных очагах, а также из объектов окружающей среды, показана корреляция наличия генной детерминанты с проявлениями резистентности к определенному препарату. В случае некоторых антибиотиков, механизм устойчивости к которым достигается включением нескольких биохимических механизмов, наличие гена не всегда ведет к прямому проявлению устойчивости культурой микроорганизмов при воздействии низких доз препарата, однако предполагается, что наличие определенного гена приводит к адаптации к действию антибиотика даже при изначальном проявлении чувствительности [17]. В связи с этим понимание генного профиля штамма становится необходимым для предсказания ответной реакции возбудителя на назначаемый антимикробный препарат.
Таким образом, учитывая специфичность, быстроту и простоту постановки реакции ПЦР и учет результатов в режиме реального времени, разработанная система праймеров и зондов может быть успешно применена для предварительной оценки резистентности выделенных штаммов V. с/о1егае к антимикробным препаратам.
конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
Статья выполнена в рамках федеральной целевой программы «Национальная система хими-
ческой и биологической безопасности Российской Федерации (2015-2020 гг.)».
список литературы
1. Munita J.M., Arias C.A. Mechanisms of antibiotic resistance. Microbiol. Spectr. 2016; 4(2):VMBF-0016-2015. DOI: 10.1128/mi-crobiolspec.VMBF-0016-2015.
2. Davies J., Davies D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010; 74(3):417-433. DOI: 10.1128/MMBR.00016-10.
3. Aslam B., Wang W., Arshad M.I., Khurshid M., Muzammil S., Rasool M.H., Nisar M.A., Alvi R.F., Aslam M.A., Qamar M.U., Salamat M.K.F., Baloch Z. Antibiotic resistance: a rundown of a global crisis. Infect. Drug. Resist. 2018; 11:1645-1658. DOI: 10.2147/IDR.S173867.
4. Partridge S.R., Kwong S.M., Firth N., Jensen S.O. Mobile genetic elements associated with antimicrobial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 2018; 31(4):e00088-17. DOI: 10.1128/CMR.00088-17.
5. Das B., Verma J., Kumar P., Ghosh A., Ramamurthy T. Antibiotic resistance in Vibrio cholerae: Understanding the ecology of resistance genes and mechanisms. Vaccine. 2020; 38(Suppl 1):A83-A92. DOI: 10.1016/j.vaccine.2019.06.031.
6. Burrus V., Marrero J., Waldor M.K. The current ICE age: biology and evolution of SXT-related integrating conjugative elements. Plasmid. 2006; 55(3^:173-83. DOI: 10.1016/j.plasmid.2006.01.001.
7. Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., Lesin V.M., Nikolenko S.I., Pham S., Prjibelski A.D., Pyshkin A.V., Sirotkin A.V., Vyahhi N., Tesler G., Alekseyev M.A., Pevzner P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5):455-77. DOI: 10.1089/cmb.2012.0021.
8. Zankari E., Hasman H., Cosentino S., Vestergaard M., Rasmussen S., Lund O., Aarestrup F.M., Larsen M.V. Identification of acquired antimicrobial resistance genes. J. Antimicrob. Chemother. 2012; 67(11):2640-4. DOI: 10.1093/jac/dks261.
9. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol. Biol. Evol. 2018; 35(6):1547-9. DOI: 10.1093/molbev/ msy096.
10. Kalendar R., Khassenov B Ramankulov Y., Samuilova O., Ivanov K.I. FastPCR: An in silico tool for fast primer and probe design and advanced sequence analysis. Genomics. 2017; 109(3-4):312-9. DOI: 10.1016/j.ygeno.2017.05.005.
11. Spagnoletti M., Ceccarelli D., Rieux A. Fondi M., Taviani E., Fani R., Colombo M.M., Colwell R.R., Balloux F. Acquisition and evolution of SXT-R391 integrative conjugative elements in the seventh-pandemic Vibrio cholerae lineage. mBio. 2014; 5(4):e01356-14. DOI: 10.1128/mBio.01356-14.
12. Kitaoka M., Miyata S.T., Unterweger D., Pukatzki S. Antibiotic resistance mechanisms of Vibrio cholerae. J. Med. Microbiol. 2011; 60(Pt 4J:397-407. DOI: 10.1099/jmm.0.023051-0.
13. Verma J., Bag S., Saha B., Kumar P., Ghosh T.S., Dayal M., Senapati T., Mehra S., Dey P., Desigamani A., Kumar D., Rana P., Kumar B., Maiti T.K., Sharma N.C., Bhadra R.K., Mutreja A., Nair
G.B., Ramamurthy T., Das B. Genomic plasticity associated with antimicrobial resistance in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2019; 116(13):6226-31. DOI: 10.1073/pnas.1900141116.
14. Крицкий A.A., Челдышова Н.Б., Заднова С.П., Плеханов
H.А., Смирнова Н.И. Способ одновременного выявления штаммов Vibrio cholerae и определения в их геноме генов лекарственной устойчивости с помощью ПЦР в режиме реального времени. Биотехнология. 2018; 34(2):70-9. DOI: 10.21519/0234-27582018-34-2-70-79.
15. Gladkikh A.S., Feranchuk S.I., Ponomareva A.S., Bochalgin N.O., Mironova L.V. Antibiotic resistance in Vibrio cholerae El Tor strains isolated during cholera complications in Siberia and the Far East of Russia. Infect. Genet. Evol. 2020; 78:104096. DOI: 10.1016/j. meegid.2019.104096.
16. Wang R., Yu D., Yue J., Kan B. Variations in SXT elements in epidemic Vibrio cholerae O1 El Tor strains in China. Sci. Rep. 2016; 6:22733. DOI: 10.1038/srep22733.
17. Osman K.M., Kappell A.D., Elhadidy M., ElMougy F., Abd El-Ghany W.A., Orabi A., Mubarak A.S., Dawoud T.M., Hemeg H.A., Moussa I.M.I., Hessain A.M., Yousef H.M.Y. Poultry hatcheries as potential reservoirs for antimicrobial-resistant Escherichia coli: A risk to public health and food safety. Sci. Rep. 2018; 8(1):5859. DOI: 10.1038/s41598-018-23962-7.
References
1. Munita J.M., Arias C.A. Mechanisms of antibiotic resistance. Microbiol. Spectr 2016; 4(2):VMBF-0016-2015. DOI: 10.1128/mi-crobiolspec.VMBF-0016-2015.
2. Davies J., Davies D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010; 74(3):417-433. DOI:
10.1128/MMBR.00016-10.
3. Aslam B., Wang W., Arshad M.I., Khurshid M., Muzammil S., Rasool M.H., Nisar M.A., Alvi R.F., Aslam M.A., Qamar M.U., Salamat M.K.F., Baloch Z. Antibiotic resistance: a rundown of a global crisis. Infect. Drug. Resist. 2018; 11:1645-1658. DOI: 10.2147/IDR.S173867.
4. Partridge S.R., Kwong S.M., Firth N., Jensen S.O. Mobile genetic elements associated with antimicrobial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 2018; 31(4):e00088-17. DOI: 10.1128/CMR.00088-17.
5. Das B., Verma J., Kumar P., Ghosh A., Ramamurthy T. Antibiotic resistance in Vibrio cholerae: Understanding the ecology of resistance genes and mechanisms. Vaccine. 2020; 38(Suppl 1):A83-A92. DOI: 10.1016/j.vaccine.2019.06.031.
6. Burrus V., Marrero J., Waldor M.K. The current ICE age: biology and evolution of SXT-related integrating conjugative elements. Plasmid. 2006; 55(3^:173-83. DOI: 10.1016/j.plasmid.2006.01.001.
7. Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., Lesin V.M., Nikolenko S.I., Pham S., Prjibelski A.D., Pyshkin A.V., Sirotkin A.V., Vyahhi N., Tesler G., Alekseyev M.A., Pevzner P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5):455-77. DOI: 10.1089/cmb.2012.0021.
8. Zankari E., Hasman H., Cosentino S., Vestergaard M., Rasmussen S., Lund O., Aarestrup F.M., Larsen M.V. Identification of acquired antimicrobial resistance genes. J. Antimicrob. Chemother. 2012; 67(11):2640-4. DOI: 10.1093/jac/dks261.
9. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol. Biol. Evol. 2018; 35(6):1547-9. DOI: 10.1093/morbev/ msy096.
10. Kalendar R., Khassenov B., Ramankulov Y., Samuilova O., Ivanov K.I. FastPCR: An in silico tool for fast primer and probe design and advanced sequence analysis. Genomics. 2017; 109(3-4):312-9. DOI: 10.1016/j.ygeno.2017.05.005.
11. Spagnoletti M., Ceccarelli D., Rieux A., Fondi M., Taviani E., Fani R., Colombo M.M., Colwell R.R., Balloux F. Acquisition and evolution of SXT-R391 integrative conjugative elements in the seventh-pandemic Vibrio cholerae lineage. mBio. 2014; 5(4):e01356-14. DOI: 10.1128/mBio.01356-14.
12. Kitaoka M., Miyata S.T., Unterweger D., Pukatzki S.
Antibiotic resistance mechanisms of Vibrio cholerae. J. Med. Microbiol. 2011; 60(Pt 4J:397-407. DOI: 10.1099/jmm.0.023051-0.
13. Verma J., Bag S., Saha B., Kumar P., Ghosh T.S., Dayal M., Senapati T., Mehra S., Dey P., Desigamani A., Kumar D., Rana P., Kumar B., Maiti T.K., Sharma N.C., Bhadra R.K., Mutreja A., Nair G.B., Ramamurthy T., Das B. Genomic plasticity associated with antimicrobial resistance in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2019; 116(13):6226-31. DOI: 10.1073/pnas.1900141116.
14. Kritsky A.A., Cheldyshova NB., Zadnova S.P., Plekhanov N.A., Smirnova N.I. [A method for the simultaneous detection of Vibrio cholerae strains and determination of drug resistance genes in their genome using real-time PCR]. Biotekhnologiya. [Biotechnology]. 2018; 34(2):70-9. DOI: 10.21519/0234-27582018-34-2-70-79.
15. Gladkikh A.S., Feranchuk S.I., Ponomareva A.S., Bochalgin N.O., Mironova L.V. Antibiotic resistance in Vibrio cholerae El Tor strains isolated during cholera complications in Siberia and the Far East of Russia. Infect. Genet. Evol. 2020; 78:104096. DOI: 10.1016/j. meegid.2019.104096.
16. Wang R., Yu D., Yue J., Kan B. Variations in SXT elements in epidemic Vibrio cholerae O1 El Tor strains in China. Sci. Rep. 2016; 6:22733. DOI: 10.1038/srep22733.
17. Osman K.M., Kappell A.D., Elhadidy M., ElMougy F., Abd El-Ghany W.A., Orabi A., Mubarak A.S., Dawoud T.M., Hemeg H.A., Moussa I.M.I., Hessain A.M., Yousef H.M.Y. Poultry hatcheries as potential reservoirs for antimicrobial-resistant Escherichia coli: A risk to public health and food safety. Sci. Rep. 2018; 8(1):5859. DOI: 10.1038/s41598-018-23962-7.
Authors:
Gladkikh A.S., Fedotova I.S., Mironova L.V. Irkutsk Research Anti-Plague Institute of Siberia and Far East. 78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation. E-mail: adm@chumin.irkutsk.ru.
Об авторах:
Гладких А.С., Федотова И.С., Миронова Л.В. Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока. Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78. E-mail: adm@chumin.irkutsk.ru.
