CC BY
9
УДК 16:018:512.517
СПОСОБ ДЕКОНТАМИНАЦИИ РОСТОВЫХ СРЕД И СТИМУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА КУЛЬТУР КЛЕТОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ у- ЛУЧЕЙ
Плотникова Э.М. - д.вет.н., гл. н.с., доцент, Низамов Р.Н. - д.вет.н., гл. н.с., профессор, Фазлиахметов Р.Г. - соискатель, Нестерова И.А. - мл.н.с., Гайнутдинов Т.Р. - к.б.н., вед. н.с., Майорова Е.Н. - к.б.н., ст. н.с.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»
Ключевые слова: культура клеток, микроорганизмы, ростовые и культуральные среды, ионизирующее излучение, деконтаминация, стерилизация
Keywords: cell culture, microorganisms, growth and culture media, ionizing radiation, decontamination, sterilization
Производство лечебно-
профилактических препаратов требуют применения ростовых сред, свободных от контаминантов микроорганизмов
различных видов и штаммов. Важное значение при культивировании клеток имеет чувствительность и устойчивость к различным факторам внешней среды: температуре, давлению, ионизирующим изучениям, концентрации солей, рН, токсикантам, антибиотикам, фитонцидам, эндотоксинам и т.д.
Изучение радиочувствительности микроорганизмов напрямую связано с использованием ионизирующей радиации для лучевой стерилизации медицинских инструментов, препаратов и обработки пищевой продукции [4].
Радиационная обработка с целью стерилизации плазмы крови, а также ее замороженной и лиофилизированной фракций, способствовала сохранению биологической активности препаратов. Учитывая изложенное, замороженную и лиофилизированную сыворотку крови, а также и у-глобулин подвергали радиационной обработке у-лучами в дозах 1,5-2,5х106 Р. Установлено, что облучение существенно снижает активность иммунного у-глобулина. Гамма-облучение полностью переводит протеины в нерастворимое состояние, и агрегируют иммуноглобулин класса G.
Установлено, что одним из механизмов противолучевой защиты на
фоне применения радиопротекторов, в частности иммунотропных препаратов, является усиление активности макрофагов, моноцитов и нейтрофилов,
ограничивающих экспансию условно-патогенной микрофлоры в условиях депрессии кроветворной и иммунной системы [6]. Облучение плазмы крови и отдельных ее фракций ускоренными электронами в дозе 1х106 Р вызывает полное уничтожение вируса гепатита, снижает концентрацию альбумина и увеличивает содержание у-глобулина, одновременно снижая концентрацию фибриногена, т.е. меняет соотношение белковых фракций. Доза у-квантов 137Cs 2х106 Р вызывает полную инактивацию специфических антител в облученной плазме крови иммунизированных людей. Радиостерилизация плазмы в дозах 1-2х106 Р понижает содержание титра комплемента на 43 % и увеличивает протромбиновое время.
Облучение фибриногена у-лучами в дозе 5х105 Р и более заметно снижает его растворимость и активность, а облучение в дозе 1,5-3,5х 106 Р снижает свертывающую активность тромбина. Влияние радиации в дозах до 5 Мрад на фибринную губку не меняет ее гемостатистические свойства.
Влияние ионизирующего эффекта на активность антител открывает возможность радиационной стерилизации лечебных, профилактических и
диагностических сывороток крови. По
данным исследователей, изучавших влияние облучения в дозах 0,6 и 1,5* 106 Р на антитоксические, анафилактические и электрофоретические свойства
противодифтерийных сывороток,
радиооблучение частично денатурирует сывороточные белки крови, уменьшает анафилактические свойства сыворотки и заметно снижает титр антитоксина. На наличие денатурации указывает повышение ее вязкости, изменение соотношения белковых фракций сыворотки и изменение их электрофоретической характеристики. Облучение с целью стерилизации диагностических сывороток незначительно снижает титр агглютининов. При этом иммунные свойства не теряют превентивность после лучевого
воздействия. На лиофильно высушенные сыворотки радиация не оказывает существенного влияния. По-видимому, с уменьшением стерилизующей дозы изменения, возникающие в белковых растворах, сыворотке и плазме крови, в препаратах крови несущественны. Поэтому уменьшение доз не обеспечивает полной стерилизации. Учитывая изложенное, для стерилизации препаратов крови и сывороток используют комбинированные способы, которые при снижении дозы облучения не уменьшали бы бактерицидного эффекта ионизирующих излучений. Такое условие соблюдается при применении комбинированного
терморадиационного способа
стерилизации, когда производится одновременное прогревание и облучение. При терморадиационном способе стерилизации предусматривается
прогревание объекта от плюс 50 оС до плюс 55 оС, и облучение в дозах 1,5-2*106 Р. При таких условиях, когда тепловое и радиационное воздействия не вызывают изменений или эти изменения незначительны, мало влияют на качество и биологическую активность препарата.
В качестве лечебных препаратов использовались высушенные и растертые в порошок ткани и щитовидной железы -источника действующего начала -тиреоидина. Облучение в дозе 2 Мрад не оказывает влияния на свойства такого
препарата и стерилизует его, если количество микроорганизмов не превышает 100 м.к. на 1 г препарата [5].
Действие малых доз ионизирующих излучений на скорость обменных процессов и скорость пролиферации приводит к наблюдаемым эффектам в виде увеличения числа и живой массы тела животных.
Вышесказанное явилось основанием для проведения настоящих исследований по разработке способа деконтаминации ростовых сред и стимуляции метаболизма культур клеток с использованием у-лучей.
Материал и методы исследований. Работа выполнена в структурном подразделении ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Объектами исследований служили: ростовая среда, среда 199, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), среда Китт-Тароцци, среда Сабуро, MDBK - перевиваемая линия клеток почки эмбриона КРС, полученная S. Madin, N. Darby (1958).
Перевиваемые КК поддерживали общепринятым методом последовательных переносов в соответствии с «Инструкцией по приготовлению питательных сред и культур клеток» [5].
Культуры клеток, выращенные на вышеуказанных средах, подвергали радиостерилизации в дозах 0,05; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7 Гр. Стерильность использованных в опытах объектов определяли путем высева на МПБ, среды Китт-Тароцци, Сабуро. Деконтаминацию искусственно и спонтанно контаминированных ростовых сред проводили на у-установке «Исследователь» с источником излучения 60 Со в дозах от 1х103 до 2,5х104 Гр.
Учитывая результаты предыдущих радиомикробиологических исследований, свидетельствующих о стимулирующем действии малых доз ионизирующих излучений на рост и развитие микроорганизмов, простейших, клеток и тканей млекопитающих, настоящие исследования проводили по изучению влияния у-квантов на репродуктивную активность культур клеток.
В работе использовали КК эмбриона почек КРС (MDBK). Для культивирования
клеток применяли стандартную полную среду МЕМ, содержащую 10 % сыворотку крови КРС с добавлением пенициллина, стрептомицина по 100000 ЕД/см3.
Выращивание проводили в стандартном СО2-инкубаторе при температуре плюс 37 оС в атмосфере с 5 %-ным содержанием СО2. Пересев клеток проводили каждые 2-3 суток в фазе экспоненциального роста.
Перед началом основных опытов по определению оптимальных доз у-лучей для деконтаминации питательных сред проводили исследования по изучению радиочувствительности тест-микробов и вирусов в условиях in vitro.
В опытах использовали
референтные и вакцинные штаммы микроорганизмов из семейства
аспорогенных и спорогенных бактерий, микоплазм, грибов и вирусов, которые разводили на физиологическом растворе в концентрациях 1х105 - 1х108 м.к./см3 (микроорганизмы) и 1-5 lg ТЦД/50 см3 (вирусы). Опыты проводили в суспензионных (водные суспензии микроорганизмов) условиях с белковой защитой (добавление в субстрат 10 %
сыворотки крови КРС) и без нее. Тест-штаммы испытуемых микроорганизмов, содержащихся в водных суспензиях и в условиях защиты, подвергали воздействию у-лучей на установке «Исследователь» в диапазоне доз от 1 до 30 кГр.
Через 1, 2 и 3 ч после радиационного воздействия из каждой пробирки делали посевы на соответствующие питательные среды, которые термостатировали при температуре плюс 37 оС в течение 7 сут., регистрируя наличие или отсутствие роста использованных микроорганизмов.
Инактивацию вирусов определяли путем титрования на культуре клеток МОВК по общепринятой методике.
Результат исследований. В начале исследований использовали среду, состоящую из 0,5 %-ного гидролизата лактальбумина (ГЛА) на растворе Хэнкса 90 % и 10 %-ной сыворотки крови КРС с добавлением соответствующих
антибиотиков. При этом были использованы образцы ГЛА и сывороток, облученных в дозах от 0,1 до 6,0х104 Гр.
Результаты радиомикробиологических исследований представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Радиочувствительность контаминантов питательных сред к у-лучам в зависимости от их концентрации и наличия белковой защиты в субстрате
Наименование вида и штамма бактерии, вируса Доза у-лучей, инактивирующая тест-микроб, содержащийся в водных суспензиях, кГр Концентрация вирусов, х lg ТЦД/см3
без белковой защиты в субстрате при наличии белковой защиты в субстрате
концентрация микробов в суспензии, х м.к./см3
1х103 1х108 1х108 1,0 5,0
Е.соИ «ПЛ-6» 2,5 3,0 3,5 - -
Е.соИ «17» 2,7 3,3 4,1 - -
$1.аитеш «209» 1,9 2,2 3,3 - -
M.agalaсtia «7» 1,2 2,0 3,2 - -
Sacch.serevisiae «А-7», «192» 3,9 4,3 4,7 - -
B.subtilis «3» 23,0 25,0 30,0 - -
Вирус ИРТ (ТК-А) - - 20,0 4,9 9,5
Вирус ПГ-3 (ТМ-50) - - 15,1 5,9 6,9
Представленные в таблице данные свидетельствуют о том, что тест-микробы и вирусы проявляют вариабельную чувствительность к у-лучам, которая зависит от штамма, концентрации, а также
наличия белковой защиты. Анализ данных таблицы показывает, что использованные в опытах микроорганизмы по
радиочувствительности образуют
следующий убывающий ряд: M. agalactia
«7» у-лучей - (1,2-2,0) > St. aureus «209» -(1,9-2,2 кГр) > E.coli «ПЛ-6» - (2,5-3,0 кГр) > E.coli «17» - (2,3-3,3 кГр> Sacch. Serevisiae «А 7» и «192» > Вирус ИРТ «ТК-А» (доза - 4,9-9,5 кГр > Вирус ПГ- 3 «ТМ-50» - (5,1-6,9 кГр > B. subtilis «3» спороцидная доза - (23-25 кГр >. Присутствие белковой защиты в субстрате резко (в 1,1-2,2 раза) усиливает радиорезистентность используемых
микроорганизмов, зависит от вида и штамма микроорганизмов.
При радиационном воздействии на микроорганизмы в дозе 2,0х104 Гр последовала частичная гибель
контаминанта St. aureus - в посевах из проб
облученных сред наблюдался рост тест штаммов. В качестве тест-культуры в опытах использовали клетки почек эмбриона КРС - MDBK, которые выращивали на подвергнутых у-облучению в вышеуказанных дозах ГЛА с содержанием 10 % сыворотки крови КРС. С каждой комбинацией облученных компонентов проведено по 9-12 опытов. В качестве контроля использовали среду, состоящую из необлученных ГЛА и сыворотки крови КРС.
Результаты изучения
пролиферативной активности культуры MDBK представлены в таблице 2.
Доза облучения сывороток и ГЛА, Гр Посевная концентрация клеток (млн кл./см3) Максимальное накопление клеток (млн кл./см3) Время максимального накопления клеток (ч) Индекс пролиферации
0,1х104 0,4±0,25 1,5±0,01 48 3,88±0,11
0,5хх104 0,4±0,05 1,48±0,05 48 3,81±0,13
1,0х104 0,4±0,03 1,46±0,03 48 3,79±0,13
5,0х104 0,4±0,05 1,43±0,01 48 3,75±0,17
6,0х104 0,4±0,05 1,10±0,05 48 3,11±0,11*
Контроль 0,4±0,05 1,55±0,03 48 3,91±0,13
Примечание -* Р < 0,05
Таблица 2 - Пролиферативная активность клеток MDBK, выращенных в облученных у-лучами ростовых средах
Данные таблицы показывают, что лучевая обработка питательных сред у-лучами в дозе 0,1-3,0х104 Гр отрицательного влияния на рост и размножение клеток MDBK не оказывала.
При этом индекс пролиферации (ИП) клеток составлял 3,59. На средах, облученных в дозе 0,1х104 Гр, ИП клеток составлял 3,81-0,5х104 Гр; 3,79-1,0х104 Гр; 3,75-3,0х104 Гр и 3,11-6,01х104 Гр, соответственно. ИП клеток, выращенных на облученных в дозах 0,1-3,0х104 Гр средах, незначительно в 1,0; 1,02; 1,03 и 1,04 раза. При этом Р<0,05 уступал контролю, что свидетельствует об отсутствии ростингибирующей
способности у облученных в указанных дозах ростовых сред. В отличие от указанных сред облученные в дозе 6,0х104 Гр среды оказывали ингибирующее действие на рост и развитие клеток, снижая их концентрацию в 1,41 раза (Р<0,01), а
индекс пролиферации в 1,26 раза (Р<0,05).
Радиодеконтаминация ростовых сред (сыворотка крови КРС, ГЛА) в дозах от 0,1 до 3,0 х104 Гр не оказывала отрицательного влияния на основные их характеристики - внешний вид, рН, содержание белка, липидов, альбуминов и глобулинов, что нашло подтверждение при выращивании культур клеток MDBK, т.е. накопление клеток и их пролиферативная активность не отличались от контроля.
На следующем этапе изучали кариологическую стабильность двукратно облученных у-лучами клеток MDBK. Результаты исследований показали, что облучение клеток культуры MDBK в дозах 0,05 Гр приводило к значительному увеличению выживаемости облученных как контактирующих (монослой), так и одиночных (суспензия) клеток.
Однако при радиационном воздействии в дозах от 2 Гр и выше
последовало постепенное снижение выживаемости клеток, а при дозах 9-10 Гр наблюдалось значительное (в 1,83 и 2,42 раза) усиление гибели клеток.
Таким образом, малые дозы у-лучей (0,05-1 Гр) оказывали стимулирующее действие на КК, более высокие дозы (6-10 Гр) усиливали гибель клеточной популяции, а при радиооблучении в диапазоне доз от 1 до 5 Гр существенного увеличения гибели клеток не наблюдалось.
Установлено, что при обработке КК гамма-лучами в монослое в диапазоне доз от 0,05 до 1 Гр, наблюдалось увеличение выживаемость облученных клеток в 1,02 раза по сравнению с контролем. Начиная с дозы облучения 6 Гр, последовало уменьшение выживаемости клеток в монослое, которое составляло 99 % при дозе 6 Гр; 91 % при 7 Гр; 77,3 % при 8 Гр; 61,5 % при 9 Гр и 53,1 % при 10 Гр по сравнению с контролем.
Учитывая, что повторное воздействие на культивируемые клетки (лимфоциты) вначале малыми (0,1 Гр), а затем большими дозами (5 Гр) приводит не только к существенному увеличению выживаемости облученных клеток, но и стимуляции их репродуктивной способности [6], проводили следующую серию опытов по изучению возможности стимулирующего действия у-лучей на культуру клеток MDBK при повторном облучении малыми дозами.
Одиночные и контактирующие клетки, выращенные на среде МЕМ с 10 %-ной сывороткой крови КРС с добавлением вышеуказанных
антибиотиков по 100 ЕД/см3, подвергали двукратному облучению по схеме: вначале в дозе 0,05 Гр, затем через 3 минуты в дозе 5,95 Гр (общая доза - 6 Гр). Результаты экспериментов показали, что повторное радиационное воздействие на клетки в малой дозе (0,05 Гр) оказывает адаптирующий эффект, который приводит к развитию радиорезистентности к повторному облучению в более высоких дозах (5,95-6 Гр) с повышением их выживаемости. Полученные данные свидетельствуют о том, что предварительное облучение культуры
клеток MDBK в малой дозе индуцирует развитие благоприятной адаптивной реакции на ионизирующую радиацию в высоких (в 119 раз превышающих малую) дозах. Учитывая, что повышение выживаемости под воздействием малых доз облучения могло найти отражение и на репродуктивной способности клеток в популяции, проводили следующую серию опытов по изучению влияния двукратного облучения на динамику их роста на фоне двукратного облучения. При этом в качестве критериев оценки
стимулирующего действия малых доз у-лучей использовали концентрацию клеток в процессе культивирования и индекс пролиферации, поскольку эти показатели наряду с урожаем являются определяющими при расчете
эффективности масштабирования клеток в биотехнологии. Установлено, что использование метода двукратного последовательного облучения культур MDBK у-лучами в дозе 0,05 Гр и последующее облучение в дозе 5,95 Гр (летальная доза) оказывало
стимулирующее действие на репродукцию клеток, увеличивая концентрацию клеток в 1,77 раза с индексом пролиферации 3,2 по сравнению с контролем.
Заключение. Таким образом, в результате проведенных
радиомикробиологических и
биотехнологических исследований
разработан способ деконтаминации питательных сред, контаминированных вегетативной и спорогенной микрофлорой путем облучения их гамма-лучами в дозах от 1,2 до 3,3 Гр (вегетативной формы микроорганизмов), от 4,9 до 9,5 Гр (вирусы) и от 23 до 25 кГр (спорогенные бациллы). Результаты радиобиологических
исследований показали, что двукратное облучение клеток культур MDBK в малых (первое воздействие) и высоких (повторное) дозах предотвращало развитие мутагенного эффекта у-лучей.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Ауэрбах, Ш. Проблемы мутагенеза / Ш. Ауэрбах. - Москва: Мир, 1978. - 463 с.
2. Дьяконов, Л. П. Животная клетка
в культуре / Л. П. Дьяконов, В. И. Ситьков. - Москва: «Компания Спутник +», 2009. -656 с.
3. Кузин, А. М. Идеи радиационного гормезиса в атомном веке / А. М. Кузин. -Москва: Наука, 1995. - 158 с.
4. Курбангалеев, Я. М. Сохранность и безопасность кормов, подвергнутых радиационной обработке // Сборник материалов международной научно-практической конференции «Актуальность проблемы ветеринарной медицины» / Я. М. Курбангалеев, Г. В. Конюхов, Р. Н. Низамов, Э. И. Семенов, Р. М. Потехина. - Казань, 2018. - С. 72-76.
5. Курносов, А. Н. Изучение активности некоторых диспергирующих смесей при перфузионной дезагрегации почек поросят / А. Н. Курносов, В. Н. Опарин // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1978.
- С. 18-19.
6. Низамов, Р. Н. Концептуальные основы конструирования иммунотерапевтических средств при многофакторной экопатологии: монография / Р. Н. Низамов, Ж. Р. Насыбуллина, К. Н. Вагин, Р.Р. Гайнуллин, Н. М. Василевский, Э. М. Плотникова. - Казань: ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 2021. - 362 с.
7. Okada, M. Single exposure to low dose rate lof causes a change in the life expectancy and stability of the genome of primary human cells / M. Okada, A. Okabe, Yu. Uchihori // Br. J. Cancer. - 2007. - Vol. 96 - № 11. - P. 1707-1710.
8. Plotnikova, E. M. Correction of genetic instability of the genome by fractional irradi ati on of MDBK cells / E. M. Plotnikova, R. N. Nizamov, R. G. Fazlikhrometov, I. A. Arkharova [et al.] // International journal of research in pharmaceutical sciences. - 2020.
- Vol. 11. - № 2. - P. 1879-1882.
СПОСОБ ДЕКОНТАМИНАЦИИ РОСТОВЫХ СРЕД И СТИМУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА КУЛЬТУР КЛЕТОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ у- ЛУЧЕЙ
Плотникова Э.М., Низамов Р.Н., Фазлиахметов Р.Г., Нестерова И.А., Гайнутдинов Т.Р.,
Майорова Е.Н.
Резюме
Установлено, что облучение ростовых сред в дозах 0,05 Гр и 5-10 Гр оказывает ростостимулирующий эффект, увеличивая численность клеточной популяции в 1,5-2 раза. Однако такие исследования единичны и малоинформативны, что диктует необходимость усовершенствования методов деконтаминации ростовых сред и стимуляции роста культур клеток, обеспечивающих максимальную вируспродуцирующую активность. Целью представленной работы является подбор оптимальных доз у-лучей для деконтаминации ростовых сред и стимуляцию метаболизма культур клеток.
METHOD FOR DECONTAMINATION OF GROWTH MEDIA AND STIMULATION OF METABOLISM OF CELL CULTURES USING y-RAYS
Plotnikova E.M., Nizamov R.N., Fazliakhmetov R.G., Nesterova I.A., Gainutdinov T.R.,
Mayorova E.N.
Summary
It was found that irradiation of growth media at doses of 0.05 and 5-10 Gy has a growth-stimulating effect, increasing the number of the cell population by 1.5-2 times. However, such studies are isolated and uninformative, which dictates the need to improve the methods of decontamination of growth media and stimulation of cell culture growth, providing maximum virus-producing activity. The aim of the presented work is to select optimal doses of gamma rays for decontamination of growth media and stimulation of cell culture metabolism.
